动物细胞传代培养

➢ 7．待培养基（本身为红色），当pH值降低，培养基呈偏淡红 色时，一般2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续 培养。
➢ 作业：绘制观察到的培养细胞
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动物细胞传代培养
➢ 实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理 和方法。
➢ 实验用具：移液枪（每个台面一把），枪 头（每个台面一盒），吸管（4根），培养 皿（每组2个）
➢ 实验药品：0.125％胰酶，1640培养基
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➢ HeLa 是Henrietta Lacks的简称， Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美 国妇女的名字，在她死后，该细胞被广泛 散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂 下去。
实验结果的分析。易发生支原体污染
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。
冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤
除菌。
➢ 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
➢ 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
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培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天 然培养基和合成培养基。
天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸
液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和
80％一95％ 5％一20％（一般加10％） 2.0 g/L 各100卑位／毫升
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实验前的准备
➢ 培养基的配置
RPMI-1640培养粉 1袋
碳酸氢钠
2.0 g
青、链霉素
各100单位／毫升
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节pH值至7.2
加血清（终浓度 10％）
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消化液的配置
➢ 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－hanks 配置。 配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 ％ 。用滤器过滤除菌
物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
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每代贴附生长细胞的生长过程
➢ 游离期 ➢ 贴壁期 ➢ 潜伏期 ➢ 对数生长期 ➢ 停止期（平台期）
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培养细胞生长的条件
➢ 1 细胞的营养需要
➢ 2 细胞的生存环境
➢
温度: 37 ℃
➢
O2
➢ CO2: 5%
➢
pH: 7.2-7.4
➢
渗透压
➢ 3 无污染
➢ 4 无毒
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实验步骤
➢ 1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。 ➢ 2．从冰箱中取出0.25％胰酶、培养基。可以把瓶盖打开
或者拧松。 ➢ 3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基。 ➢ 4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞
培养面为宜，轻轻摇动。2－5分钟后迅速将消化液吸出。 消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消 化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回 缩，胞间间隙加大为消化适宜。
成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需
要。
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➢ 人工合成培养基只能维持细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。
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➢ 血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
8➢Leabharlann 消化液：➢胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，
除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细
胞分离。
➢
➢
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度
会损伤细胞。
➢
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓
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细胞培养的基本概念
➢ 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分 开接种到新的培养器皿中。
➢ 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
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细胞培养的类型
➢ 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生 长。见于各种实体瘤细胞。
➢ 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持
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➢ 5．取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞 悬液。吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打， 保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成 小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽 量不要出现气泡，以免损伤细胞。
➢ 6． 吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液 0.5ml加入新的培养皿中，培养密度为1×105－×106/ML。显 微镜下观察，摇匀，放入37度C02培养箱孵育。
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➢ 抗菌素的使用：
➢
在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑
制可能存在的细菌的生长。
➢
通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、
链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
➢
庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定
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完全培养基的组成
➢ 基础培养基 ➢ 血清 ➢ 碳酸氢钠 ➢ 青、链霉素