水质粪大肠菌群的测定

7 适用范围
• 本标准适用于地表水，地下水及 废水中粪大肠菌群的测定。
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8 原理
• 多管发酵法是以最可能数（most probable number）， 简称MPN 来表示试验结果的。实际上它是根据统计
学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一 种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检 定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过 只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减 少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显 示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水 样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确 度而定。
• 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含 有 玻璃倒管的试管中。置高压蒸气灭菌器中， 115℃高压灭菌器中灭菌20min，灭菌后pH 应为6.9。
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13 培养基的存放
• 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在 大气湿度低，温度低于30摄氏度的暗处， 存放时应避免阳光直接照射，并且要避免 杂菌倾入和液体蒸发。当培养液颜色变化， 或体积变化明显时应废弃不用。
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9 培养基及试剂
• 本标准所用试剂除另有说明，均为符合国家 标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备 的去离子水。
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单倍乳糖蛋白胨培养液：
• 将10g 蛋白胨、3g 牛肉寖膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节 溶液pH 为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫 乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中， 于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于 冷暗处备用。
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举例：
• 某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种 1mL 的5 管中有2 管为阳性；接种1：10 的 水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数 （MPN）表中查检验结果5-2-0，得知 100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故 1L 水样中的总大肠菌群数为49×10=490 个。
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注意：
• 加入水样时，先将培养管管口用酒精 灯消毒一次，加入水样后再用酒精灯 消毒一次，封口。
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• 阳性的判别：既产酸又产气： • 观察：24h小时后取出观察培养
管，颜色由紫色变为黄色和有 气泡产生两个方面才能判为阳性
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• 如果接种的水样量不是10mL、1mL 和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样 量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公 式换算成每100mL 的MPN 值。
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表2 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL(100mL2份，10mL10份)
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三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：
• 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。 除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。（即 按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成 三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液）液：
• 成分： 胰胨 20克， 乳糖 5克， 胆盐三号 1.5克，磷酸氢二钾（K2HPO4）4克，磷酸 二 馏氢 水1钾0（00K毫H升2P。O4）1.5克，氯化钠5克，蒸
28 填空题
1. 细菌采样玻璃瓶洗涤干燥后，要在 0C 干热灭菌 或高压蒸汽 0C灭菌 min。
• 2. 对受污染严重的水体，可选择 测定其总大肠菌群数。
方法
• 3. 总大肠菌群测定过程的复发酵试验中，接 种完菌落后，应将发酵管置于 0C温度下 培养 h。
• 4. 复发酵试验使用
培养基。
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20 结果的计算
• 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的 数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大 肠菌群。
• 接种水样为100ml 2份，10ml 10份，总量 300ml 时，查表2可得每升水样中粪大肠菌 群；
• 接种5份10ml 水样，5份1ml水样，5份0.1ml 水样时，查表3求得MPN指数，MPN值再乘 10，即为1升水样中的粪大肠菌群；
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14 测定步骤
• 1. 水样接种量的选择 • 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确
定水样接种量。每个样品至少用三个不同的 水样量接种。同一接种水样量要有五管。 • 相对未受污染的水样接种量为10ml、1 ml、 0.1 ml。受污染水样接种量根据污染程度接 种1 ml、0.1 ml、0.01 ml、或0.1 ml、0.01 ml、0.001 ml等。
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• 计算题： • 某水样接种10mL 的5 管中有4管为
阳性；接种1mL 的5 管中有3 管为阳 性；接种1：10 的水样1mL 的5 管 中有1管为阳性。求1L 水样中的总 大肠菌群数为多少？
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4 污水的细菌学检验
• 水质的细菌学检验主要包括两个常规 项目：细菌总数和总大肠菌群。
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5 总大肠菌群测定的两种方法
• 多管发酵法
• 滤膜法
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6 粪大肠菌群的定义
2 水中微生物简介
• 自然界的水可分为地下水和地面水，除了地 下深层水外，如湖泊，河流，海洋等各种地 面水中都存在着各种各样的微生物。但它们 所含的微生物种类，数量和分布都不相同。 其中有些是“土生土长”的。另一些水生细 菌是外来的，它们来自土壤，空气，垃圾， 工厂废物或城市下水道污水。而来自下水道 的微生物中，很可能含有人体肠道致病菌， 例如霍乱，伤寒，副伤寒和痢疾等病原菌。
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• 培养液的浓度和量的选择：
• 如接种体积为10 ml，则试管内应装有三倍 浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为 1mL或少于1mL，则可接种普通浓度的乳糖 蛋白胨培养液10mL中。
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2. 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨 培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃ 下培养24h±2h。产酸和产气的发酵 管表明试验阳性。入在倒管内产气 不明显，可轻拍试管，有小气泡升 起的为阳性。
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25 注意事项
• 灭菌 • 初发酵后以有阴、有阳稀释效果最好。 • 水样一定要摇均。 • 每个稀释倍数要求做5管。 • 接种环要求用酒精灯灼烧消毒，复发酵接种
时每一管都要在酒精灯上灼烧消毒。
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26 思考题
• 配制好的培养基保存多少时间？存放时应注 意哪些事项？
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• 答：配制好的培养基不宜保存过久，以少量 勤配为宜。已灭菌的培养基可在4—100C存 放一个月。存放时应避免阳光直射，并且避 免杂菌侵入和液体蒸发。
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3. 复发酵试验
• 轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用 3mm接种环或灭菌棒将培养物转移到EC培 养液中。在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。 接种后所有发酵管必须在30分钟内放进水浴 中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为 粪大肠菌群阳性。
• 粪大肠菌群是总大肠菌群的一部分，主要来 自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖 产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提 高培养温度的方法，造成不利于来自自然环 境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌 主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确 地反映出水质受粪便污染的情况。
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