麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制

复旦学报（医学版）
2021May，48（3）292
Fudan Univ J Med Sci
麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制
邵帅陈彦霖地里热巴提·地力木拉提贾锋△
（上海交通大学医学院附属仁济医院神经外科上海200127）
【摘要】目的探究麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill，SBP）在小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制。

方法通过大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）构建脑缺血性卒中模型，将96只C57BL/6小鼠随机分成4组：假手术（Sham）组、模型（ischemia/reperfusion，I/R）组、低剂量麝香保心丸（LSBP，22.5mg/kg）组和高剂量麝香保心丸组（HSBP，45mg/kg），每组24只。

灌胃4周后制备小鼠MCAO模型。

记录各组小鼠的大脑梗死体积及脑组织含水量，利用免疫荧光技术分析激活的小胶质细胞数量，采用qRT-PCR检测炎症因子的表达，通过Western blot法分析NF-κB信号通路相关蛋白质的表达情况。

结果与I/R组相比，LSBP组和HSBP组大脑梗死体积减少，脑组织含水量降低，激活的小胶质细胞数量减少，同时促进小胶质细胞由M1型向M2型极化，并抑制NF-κB信号通路的激活。

结论SBP可以减轻由缺血性脑卒中引起的小鼠脑组织损伤，其机制可能与改变小胶质细胞M1/M2的极化状态和抑制NF-κB信号通路的激活有关。

【关键词】麝香保心丸（SBP）；缺血性脑卒中；小胶质细胞；M1/M2极化；炎症因子；NF-κB信号通路；小鼠
【中图分类号】R743.3，R332【文献标志码】Ａdoi：10.3969/j.issn.1672-8467.2021.03.002 Protective effect of Shexiang Baoxin pill on ischemic stroke in
mice and its mechanism
SHAO Shuai，CHEN Yan-lin，DILIMULATI Dilirebati，JIA Feng△
（Department of Neurosurgery，Renji Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai200127，China）
国家自然科学基金（81471855）
△Corresponding author E⁃mail：*****************。

网络首发时间：2021-05-1809∶23∶33网络首发地址：https：///kcms/detail/31.1885.R.20210517.1538.002.html
邵帅，等.麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制
inflammatory factor；NF-κB signaling pathway；mice
*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81471855).
脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其发病率高、致残率高、死亡率高且复发率高［1］，已成为危害居民健康的常见难治性疾病。

在我国，脑卒中引起的死亡率和致残率由1990年的第三位上升到2017年的首位［2］。

缺血性脑卒中在我国脑卒中患者中占69.6%~70.8%［3-4］。

缺血性脑卒中是大脑血管闭塞引起的脑组织缺血、缺氧和坏死，最终导致神经功能障碍［5］。

近年来，机械取栓术治疗缺血性脑卒中已取得巨大进步，但由于取栓时间窗的局限性，仅可对少数患者进行有效救治［6］，目前药物治疗仅限于重组组织纤溶酶原激活剂［7］，因此研发新的有效治疗手段势在必行。

麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill，SBP）的组成（质量百分比）为麝香6%、人参提取物27%、牛黄4%、肉桂24%、苏合香酯8%、蟾酥4%及冰片19%，具有芳香温通、益气通心的功效，是一种多靶点、多作用途径的治疗药物［8］。

作为一种传统中药复方制剂，SBP可有效缓解心绞痛、改善血流动力学，已广泛用于治疗心血管疾病［9］。

目前关于SBP 治疗急性缺血性脑卒中的临床研究较少，在动物实验方面尚未见报道。

本实验通过建立小鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，观察SBP对小鼠缺血性脑卒中产生的影响，并探索其中的分子作用机制，以期为SBP治疗缺血性脑卒中的临床应用提供理论和实验依据。

材料和方法
主要实验试剂及仪器本研究中96只健康雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可号：SCXK（沪）2017-0011，体质量22~25g。

饲养条件：12h的明暗循环，平均室温约24℃，相对湿度约50%，自由进食和饮水。

动物实验符合上海交通大学医学院动物伦理相关规范。

SBP（上海和黄药业有限公司），线栓（广州佳灵生物技术有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazole chloride，TTC）、戊巴比妥钠（美国Sigma公司），GAPDH抗体（美国Cell Signaling Techonology公司），Iba-1抗体、NF-κb p-p65抗体（美国Abcam公
司），免疫荧光（immunofluorescence，IF）二抗、BCA 蛋白质检测试剂盒、Western blot二抗（美国Thermo 公司），DAPI染色试剂盒、细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒、山羊血清、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），逆转录试剂盒、Syber Green（日本TaKara公司），qRT-PCR引物［铂尚生物技术（上海）有限公司］。

体式显微镜、石蜡切片机、激光共聚焦显微镜（德国Leica Microsystems公司），组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司），酶标仪、NanoDrop TM分光光度计（美国ThermoFisher公司），化学发光凝胶成像系统（美国Aplegen公司）。

实验分组与给药将C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组，模型（ischemia/reperfusion，I/R）组、低剂量（22.5mg/kg）麝香保心丸（low-dose SBP，LSBP）组、高剂量（45mg/kg）麝香保心丸（high-dose SBP，HSBP）组，每组24只，用药剂量参考文献报道［10］。

用生理盐水配置成混悬液，灌胃给药，每日1次，连续给药4周，分别给予假手术与MCAO手术。

MCAO模型的建立参考文献［11］建立MCAO 模型。

小鼠称重，50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，行左侧MCAO手术。

动物四肢及头部固定于木板上，沿颈正中线切开皮肤，钝性分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。

在体式显微镜下，首先在颈总动脉近心端打一活结，再在颈内动脉远心端打一活结，接着结扎颈外动脉远心端，在近心端打一松结，并在两个结之间做斜切口，快速插入线栓，使之头端稍微超过颈外动脉松结的位置，此时将颈内动脉处活结松开，并调整线栓的进线方向，使线栓头部沿颈内动脉进入，缓慢推动，直至有少许阻力感，停止推动线栓，并在颈内动脉处打活结固定线栓。

1h 后缓慢退出线栓，将颈外动脉近心端结扎，松开颈总动脉活结，实施血流再灌注。

逐层缝合皮肤，将动物放回笼中，待其自然苏醒，正常饮食。

手术期间，用加热垫使肛温维持在（37.0±0.5）℃。

术后动物出现步态不稳或前肢瘫痪则用于实验，单纯手术而未进线栓的动物作为假手术组。

TTC染色造模24h后，用异氟烷麻醉小鼠，采
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取心脏灌流法，用生理盐水将小鼠血液排出，随后处
死小鼠（每组6只），取脑组织。

将脑组织和大脑切片
槽，置于-20℃冰箱15min后，行冠状位切片，厚度为
2mm/片，切好的脑片放入2%染液中，避光置于
37℃恒温箱15min，取出脑片，摄像。

用Image J软
件计算梗死面积并定量。

脑组织含水量按上述方法处理小鼠，取完整
的左侧脑组织，用电子天平称取湿重，放入恒温电
热干燥箱（105℃）烘烤72h，称取干重。

按Elliott公
式计算脑组织含水量：含水量（%）=（湿重-干重）×
100%/湿重。

免疫荧光染色按上述方法处理小鼠，再缓慢
灌注4%多聚甲醛，取小鼠脑组织，去除嗅球及小
脑，4%多聚甲醛浸泡过夜。

二甲苯和梯度酒精行
透明和脱水处理，再行石蜡包埋，制作厚度5μm的
冠状切片，55℃烘箱过夜。

第二天，用二甲苯和梯
度酒精行脱蜡，柠檬酸和柠檬酸钠行抗原修复，5%
山羊血清溶液37℃恒温箱封闭1h，孵育Iba-1（1∶100，英国Abcam公司）抗体稀释液4℃过夜，次日PBS清洗3次，每次5min，最后DAPI室温孵育5min，封片。

用激光共聚焦显微镜观察梗死侧Iba-1的表达情况。

qRT-PCR按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5mL无酶离心管中，加入1mL TRIZOL 和预冷的磁珠，用组织研磨仪将组织打碎。

加入200μL氯仿，手动剧烈摇晃1min，4℃下12000×g 离心15min，将上清吸至另一离心管，加入等体积异丙醇，手动剧烈摇晃1min，4℃下12000×g离心10min，白色RNA沉淀在管底，去上清，加入1mL 用DEPC水配置的75%乙醇溶液，4℃下7500×g 离心5min，去上清，室温晾干20min。

加入适量DEPC水，吹打数次，溶解RNA。

用Nanodrop测定样本浓度，再利用逆转录试剂盒（日本Takara公司）按说明书将RNA反转为cDNA，最后将cDNA稀释至50μL，用于qRT-PCR检测。

按Syber Green试剂盒说明书配制实时荧光定量反应体系，加入荧光定量专用384孔板中进行反应，根据循环数检测基因表达水平。

qRT-PCR引物由铂尚生物技术（上海）有限公司提供（表1）。

Western blot按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5mL无酶离心管中，加入磁珠和含有PMSF的RIPA溶液，用组织研磨仪将组织打碎。

按照细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒说明书，抽提细胞核蛋白质。

依据BCA蛋白质检测试剂盒说明书，测定样品的蛋白质浓度，制作标准曲线，计算蛋白质浓度，加入相应的SDS蛋白质Loading缓冲液，混匀后放入100℃金属浴恒温器加热10min，置于冰上。

采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭1h后，将PVDF膜加入TBST中，摇床晃动1min，加入相应一抗，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，再加入相应的二抗，室温孵育1h，最后用TBST洗膜3遍，每遍5min。

将PVDF膜放入超灵敏多功能成像仪中，加入显影液，反应后曝光得到不同目的条带，采用Image J软件分析蛋白质灰度值。

统计学方法采用SPSS19.0统计软件分析数据，定量数据以x±s表示，各组间数据差异比较采用One-way ANOVA法分析，采用GraphPad Prism 5.0软件制作柱状图，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
MCAO模型建立4组小鼠连续灌胃4周后，建立MCAO模型，并在24h后取材（图1）。

SBP对小鼠脑梗死体积的影响每组取6只小鼠，正常状态下小鼠无脑梗死。

造模后，与Sham组表1qRT-PCR的基因引物序列
Tab1Prime sequences in
qRT-PCR
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邵帅，等.麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制相比，经TTC 染色，I/R 组梗死体积明显大于Sham 组（P <0.001）。

经SBP 灌胃预处理4周后，LSBP 组和HSBP 组梗死体积均明显小于I/R 组，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.002；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对梗死体积减小具有剂量正相关性，HSBP 组梗死面积小于LSBP 组梗死体积，差异有统计学意义（P =0.005）。

因此，SBP 可以减少缺血性脑卒中引起的梗死体积（图2A~C ）。

SBP 对小鼠脑组织含水量的影响
每组取6只
小鼠，与Sham 组相比，I/R 组脑组织含水量明显高于Sham 组（P <0.001），提示I/R 组脑组织水肿程度大于模型组。

经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组脑组织含水量均明显少于I/R 组，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对脑水肿的改善与剂量正相关，HSBP 组脑水肿程度轻于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.036）。

因此，SBP 可以缓解缺血性脑卒中引起的脑水肿（图2D ）。

SBP 对激活小胶质细胞数量的影响
每组取6
只小鼠，经IF 检测，与Sham 组相比，I/R 组Iba -1+细胞数量明显增加（P <0.001），Iba -1可作为激活小胶质细胞的标记物［12］，这提示I/R 组激活的小胶质细胞数量增加。

在缺血性脑卒中的急性期，大量激活的小胶质细胞提示炎症反应加重。

经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组Iba -
1+细胞数量明显下降，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对小胶质细胞激活的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组Iba -1+细胞数量少于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.041）。

因此，SBP 可以减少缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量（图3）。

SBP 对炎症因子表达的影响
每组取6只小
鼠，经qRT -PCR 检测，与Sham 组相比，I/R 组M 1型和M 2型小胶质细胞标志性炎症因子（M 1型：
TNF -α、I L -1β、MCP -1、CXCL 1；M 2型：Arg -1、Ym -1、Mgl 1、Fizz 1）表达均明显增加，差异有统计学意义（A rg -1：P =0.0017；其他P 均<0.001），提示炎症反应加重。

经SBP 灌胃预处理4周后，与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组M 1型小胶质细胞标志性炎症因子表达水平明显下降，差异有统计学意义（IL -1β：LSBP vs.I/R ，P =0.0047；MCP -1：LSBP vs.I/R ，P =0.009；CXCL 1：LSBP vs.I/R ，P =0.044；其他P 均<0.001）。

且SBP 对M 1型炎症因子表达的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组M 1型炎症因子表达水平低于LSBP 组，差异有统计学意义（TNF -α：P <0.001；IL -1β：P =0.031；MCP -1：P =0.007；CXCL1：P =0.028）。

与I/R 组相比，LSBP 组和HSBP 组M 2型炎症因子表达水平均有所增加，部分差异有统计学意义（Arg -1：LSBP vs.I/R ，P
=
A ：Groups of experiment ；
B ：MCAO model （left side ）.CCA ：Common carotid artery ；ICA ：Inter carotid artery ；ECA ：External carotid artery ；BA ：Basilar artery ；PPA ：Pterygopalatine artery ；MCA ：Middle cerebral artery.
图1
小鼠实验分组以及MCAO 模型建立
Fig 1
Experimental grouping and establishment of MCAO model
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0.067，HSBP vs.I/R ，P =0.0083；Ym 1：LSBP vs.I/R ，P =0.036，HSBP vs.I/R ，P <0.001；Mgl 1：LSBP vs.I/R ，P =0.014，HSBP vs.I/R ，P =0.004；Fizz 1：LSBP vs.I/R ，P =0.193，HSBP vs.I/R ，P =0.047）。

因此，SBP 可以促进小胶质细胞由M 1型向M 2型极化（图4）。

SBP 对NF-κB 信号通路相关蛋白质水平的影响
每组取6只小鼠，经Western blot 检测，与Sham 组相比，在细胞核内I/R 组p -p 65/p 65水平明显增高
（P <0.001）。

经SBP 灌胃预处理4周后，LSBP 组和HSBP 组p -p 65/p 65的水平都有所减少，差异有统计学意义（LSBP vs.I/R ，P =0.007；HSBP vs.I/R ，P <0.001），且SBP 对p -p 65/p 65的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP 组p -p 65/p 65水平低于LSBP 组，差异有统计学意义（P =0.008）。

因此，SBP 可以抑制细胞核内NF -κB 通路的激活，从而减轻缺血性脑卒中带来的炎症反应（图5）。

A ：The representative photograph of TTC staining for each group ；
B ：Quantification of ischemic infarct volume ；
C ：Quantification of ischemic
infarct size ；D ：Quantification of brain water content.（1）P <0.05；（2）P <0.01；（3）
P <0.001（each group ，n =6）.
图2
SBP 减少小鼠缺血性脑卒中引起的梗死体积和脑水肿程度
Fig 2
SBP reduced the infarct size and infarct volume and cerebral edema caused by ischemic stroke in
mice
A ：Representative immunofluorescence staining of Iba -1in ipsilateral brain sections 24h after sham operation or MCAO in all groups （400×）；
B ：Quantitative analyses of Iba -1+cells/total cells.（1）P <0.05；（2）P <0.01；（3）P <0.001（each group ，n =6）.
图3
SBP 减少小鼠缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量
Fig 3
SBP reduced the number of activated microglia caused by ischemic stroke in mice
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邵帅，等.麝香保心丸对小鼠缺血性脑卒中的保护作用及机制讨论
MCAO 模型诱导的小鼠脑卒中是研究缺血性脑卒中的经典模型，该方法无需开颅，对动物损伤小，其病理学改变与人类脑中风相似［13］。

本研究对8周龄雄性小鼠给予线栓法建立MCAO 模型，结果显示I/R 组小鼠出现梗死体积和脑水肿，大量小胶质细胞激活，且引起炎症风暴，这些变化与既往MCAO 模型结果相一致［14］。

上述表现在LSBP 组
和HSBP 组中得到缓解，提示SBP 可改善缺血性脑
卒中引起的脑损伤。

缺血性脑卒中是指由于血管阻塞引起的脑血流循环障碍，进而引起脑组织缺血缺氧，最终导致组织病理性坏死的一系列过程［15］。

脑卒中及缺血后再灌注是复杂的病理生理性变化，机制错综复杂［16］。

有学者提出，炎症反应是导致缺血性脑损伤的重要因素之一［17］。

SBP 是一种多成分、多靶点的复合中成药，主要由中药麝香、人参提取物、蟾蜍、苏合香脂、
冰片、
A ：Representative Western blot analysis of p -p 65and p -65in ipsilateral brain tissues nuclear （GAPDH was used as a loading control ）；
B ：
Quantifications of Western blot results.（2）P <0.01；（3）P <0.001（each group ，n =6）.
图5
SBP 抑制小鼠缺血性脑卒中引起的NF-κB 信号通路激活
Fig 5
SBP attenuated the activation of NF-κB signaling pathway caused by ischemic stroke in
mice
A -D ：mRNA expression of M 1activated microglia markers ；E -H ：mRNA expression of M 2activated microglia markers.（1）P <0.05；（2）P <0.01；（3）
P <0.001（each group ，n =6）.NS ：No significance.
图4
SBP 促进小鼠缺血性脑卒中后小胶质细胞由M1型向M2型极化
Fig 4
SBP promoted M1pro-inflammatory phenotype to M2anti-inflammatory phenotype polarization
in microglia caused by ischemic stroke in mice
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复旦学报（医学版）2021年5月，48（3）
牛黄和肉桂组成［8］。

由于SBP具有扩张冠状动脉、抑制血管壁炎性因子、改善心肌缺血等作用，且安全性高，不良反应较少，已经广泛用于冠心病的治疗［18］。

由于脑血管疾病与心血管疾病有相似的发病机理，根据心脑同治原则，将SBP应用于脑梗死患者的临床治疗已取得一定的效果［19］。

然而，对于SBP治疗缺血性脑卒中仅应用于部分临床研究，在动物实验方面尚无报道。

部分缺血性卒中患者会发生脑心综合征，严重时可致心律失常和心肌缺血［20］。

SBP可有效缓解急性缺血性脑卒中引起的脑心综合征［21］。

本实验通过观察SBP对小鼠缺血性脑卒中产生的保护作用，并探索其中的分子机制。

对于患有心肌梗死和缺血性脑卒中的人群，以及患有心肌梗死且属于缺血性脑卒中的高危人群，是否给予SBP治疗心肌梗死，并预防和改善缺血性脑卒中的预后，值得进一步研究。

在小鼠脑卒中急性期，由于脑组织微环境缺血缺氧，导致脑组织大量坏死，从而形成梗死面积及脑水肿，这与人的病理生理过程极为相似，可导致神经功能损伤以及颅高压的形成［11］。

本研究中，我们发现SBP可减轻缺血性脑卒中引起的小鼠大脑梗死及脑水肿，从而缓解这一症状。

小胶质细胞是大脑内负责监视和吞噬的固有免疫细胞，由其分泌介导的炎症反应是缺血性脑卒中的重要病理生理机制［22］。

在急性缺血性损伤早期，小胶质细胞迅速激活，并在短时间内迅速聚集在损伤区域。

尽管小胶质细胞在缺血性脑卒中里发挥双重作用，但是通常认为在急性损伤早期，小胶质细胞大量激活表明炎症反应加重，而在损伤的慢性期小胶质细胞则在修复过程中起至关重要的作用［23］。

本研究结果表明，SBP可以抑制小胶质细胞的激活，从而抑制级联炎症反应，最终减轻脑损伤。

小胶质细胞和巨噬细胞一样，具有两种表型，即M1型和M2型。

传统观点认为，M1型小胶质细胞主要分泌促炎因子，如TNF-α、IL-1β、MCP-1、CXCL1；M2型小胶质细胞主要分泌抑炎因子，如Arg-1、Ym-1、Mgl1、Fizz1［24］。

本研究发现，SBP可以促进小胶质细胞由M1型向M2型极化，达到减轻炎症风暴的作用。

大量国内外研究证明，脑缺血后的组织损伤与NF-κB信号通路的激活密切相关，NF-κB是NF-κB/Rel蛋白家族成员，广泛存在于小胶质细胞、星
型胶质细胞和神经元细胞。

NF-κB是一种多向性转录调节蛋白，在静息状态时，NF-κB与其抑制因子IκB结合，形成复合物存在于胞质内，没有生物活性，但在缺血缺氧的条件下，NF-κB可以被激活，可诱导IκB蛋白的磷酸化，并通过泛素-蛋白酶体通路将其靶标快速降解，释放NF-κB进入细胞核并与DNA结合，从而启动下游靶基因转录，参与并调控炎症反应，在缺血性脑卒中的炎症反应中起至关重要的作用［25］。

本研究发现SBP可有效减少细胞核内NF-κB表达量，从而抑制下游炎症因子转录，减轻炎症反应，对小鼠缺血性脑卒中引起的脑损伤起到保护作用。

SBP含有多味中药，其单体化学成分甚为复杂，本研究未分离出发挥主要作用的具体成分，这是我们课题组后期研究方向。

综上所述，SBP可改善小鼠缺血性脑卒中引起的炎症微环境，减轻脑组织损伤，缓解脑水肿，从而对损伤的脑组织起到保护作用，其作用机制可能与促进小胶质细胞由M1型向M2型转化和抑制NF-κB信号通路激活有关。

本研究结果为SBP在缺血性脑卒中治疗中的应用提供了理论和实验依据，本课题组将继续深入研究SBP保护脑组织保护的其他相关机制。

作者贡献声明邵帅实验研究，论文撰写。

陈彦霖，地里热巴提·地力木拉提实验设计，资料分析。

贾锋实验指导，论文修改。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿日期：2020-12-21；编辑：段佳）
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