大鼠牙周膜干细胞分离、培养及应用的研究进展
牙周膜干细胞在再生医学中的进展
因素均会对细胞的分化模式、分化方向产生影响，合理调控分 化因素，便于对细胞定向分化的掌控。
维生素是一种维持人体正常生理功能的一类微量有机物， 在维持细胞活 性，延 长 细 胞 寿 命 等 方 面 有 着 重 要 作 用。Wei 等〔10〕研究表明，在维生素 C 的刺激下，PDLSC 的 I 型胶原、整 联蛋白 β1 的表达量均增多，并且干细胞标记 Oct4、Sox2、Nanog 的表达上调，特别是成骨标记 RUNX2、ALP 和 OCN 的表达增 加，与未经维生素 C 处理的 PDLSC 相比，这种类型的 PDLSC 在 组织再生方面具有显著优势。Chadipiralla 等〔11〕从人的乳牙牙 周膜中分离 PDLSC，在维甲酸的作用下连续培养 3 w，结果显 示： PDLSC 在骨源性分化方面具有更大的潜能。
2. 2 PDLSC 的神经分化 多种成体干细胞均具有向神经方向 分化的潜能，特别是在胚胎形成时期，与神经系统同属于外胚 层的细胞更具优势。
Zhen 等〔9〕对 PDLSC 先采用一定的方式进行预诱导，随后 用 β-巯基乙醇进行神经样细胞的定向诱导，诱导 6 h 后，进行 相关蛋白及基因表达的检测。检测结果显示： 经诱导的 PDLSC 表达神经微丝蛋白、神经胶质酸性蛋白以及神经元特异性烯醇 酶，并且表达量远高于对照组； 从形态学角度可见，经诱导后的 PDLSC 有一定的神经样细胞形态。
趋化因子是一类可吸引细胞向特异部位移行的小分子化 合物，特别是在炎症反应中有着重要作用。Du 等〔12〕通过趋化
1 PDLSC 的发现及相关分离鉴定 在 2004 年，Seo 等〔3〕首次从人类牙周膜组织中分离出了一
利用干细胞及细胞因子再生牙周组织的研究进展
目前发 现间充 质 干细胞 具 有 自我 更 新 、 多 向分 化 等能 力， 可分化为组织修 复所 需的各种组织如骨组织 、 软骨组织 、
牙本质 、 牙周组织等 ， 与生 物材料 复合应 用具 有 良好 的修 复 自身缺损和改建周 围组织 的功能 刮。近 年来 越来 越多的研
在牙周炎 的发生 、 发展及牙 周组 织的愈合 中至关重 要。 由牙
究 表明 ， 间充 质干细胞 除免疫原 性低 、 具备再 生 和修复 功能 外， 还有较强 的免 疫抑制及调节 、 抗炎 等作 用 ， 并 已安全 和成
功地用于临床 ， 是 牙周 组织 再生 的 良好 的种子 细胞 ｆ 。 已 Ｉ
水平的骨分化 能力 ， 表明 Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ 是最 理想 的牙槽 骨再生 的
治疗方法 … ； 但传统牙周治疗方法 尚不能使丧失的牙周组织 获得理想 的再生 。因此牙周 组织 缺损修 复是 口腔领 域 的重
点研究 内容之一 。近 年来 ， 牙周骨移植术 、 引导组 织再生术 、
引导骨再生术及生长 因子 局部缓 释技术 的 临床应用 在一定 程度上可提高牙槽骨及牙 周再生能力 ， 但 这些骨引导和 骨诱 导 方式也需依赖于剩 余 间充质干 细胞 的数 量及功 能。对 于 慢 性牙周炎患者 ， 长期的慢性炎症使宿 主 自身间充质干细胞 数 量减 少 ， 功能受损 ， 很 难满 足骨再 生手 术 的要求 。随着 干
统牙周治疗方法 主要 包括 机械 的清除 方法 是牙周 炎的基 础
特殊 的诱 导条件下还 可 向脂 肪 、 神 经等 细胞 分化 。与牙 齿有关 的干细胞主要存在于牙髓和牙周膜等结缔组 织 中， 这 些组织都有 修复 自身缺 损和改 建周 围组织 的功 能。其 中牙 周膜 干细 胞 （ Ｐ ｅ ｉ ｒ ｏ ｄ ｏ ｎ ｔ ａ ｌ ｌ ｉ ｇ ａ ｍ ｅ ｎ ｔ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ ） Ｊ ， 可 在体外分化成成牙 骨质细胞样细胞和胶原形成细胞 ， 并能被 矿化和成脂诱 导 ， 将其 与特定 生物材料 植入 体 内 ６～８周可 形成牙周膜牙骨质复合样 结构 ， 这对牙周组织 再生具有重要 意义 ’ ｊ 。Ｋ ａ ｔ ｏ等 通过对骨髓间充质 干细胞 、 脂肪 间充质 干细胞 、 牙周 膜干细胞 的 比较 ， 发现牙 周膜 干细胞 具有 最高
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展作者：吴玲来源：《中国保健营养·中旬刊》2014年第02期【摘要】牙周膜干细胞因高度自我更新能力和多向分化潜能能形成类似于天然牙骨质牙周膜复合体的结构，使其在临床上具有广泛应用前景，目前在牙周组织工程方面的应用研究已取得一些进展，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞，但是牙周膜组织中干细胞含量非常少，如何用成体干细胞替代牙源性干细胞，从而获得大量种子细胞。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
【关键词】牙周膜干细胞；增殖；细胞因子【中图分类号】R748 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0534-02牙周炎是一种侵犯牙周组织（牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨）的慢性炎症性疾病，是由于细菌侵犯牙龈和牙周组织而引起的牙龈发炎肿胀，牙周袋形成、牙槽骨丢失，最终导致牙齿松动脱落病变，牙周炎是成年人牙齿丧失的主要原因之一。
全球重度牙周炎患病率为5-20%。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
1.1 釉基质蛋白（EMP）由上皮根鞘内层的成釉细胞分泌，主要成分是釉原蛋白（amelogenin，Am）和非釉原蛋白（non-amelogenin）。
众多实验都已证实EMP对牙周膜干细胞和骨髓基质干细胞[7]有明显的促增殖作用，可以提高干细胞总蛋白的合成，碱性磷酸酶（ALP）的活性以及矿化结节的形成，并且作用的效果呈时间和质量浓度依赖性。
刘兰宁等用不同浓度的EMPs诱导牙周膜干细胞，得出EMPs在一定浓度下可以促进人PDLCs增殖，以100mg/L浓度最佳。
1.2 骨形成蛋白（BMP）除BMP-1外其余均属于转化生长因子-β超家族成员，在胚胎发育期间由多种上皮和间叶组织产生，诱导间叶细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，参与软骨与骨发育，参与四肢形成及肺、肝、肾等软组织发育，与交感神经元分化有关。
在BMPs中，BMP-2的诱骨作用最强，是发现的唯一能单独诱导成骨的骨形成蛋白，存在于具有成骨潜质的细胞的细胞质中，可以诱导未分化的间充质细胞向成骨细胞和成牙骨质细胞分化，促进牙周组织新骨的形成。
牙周膜干细胞生物学研究新进展
差异 主要 表现在 与细胞 来源 相关 的转录 基 因、与矿
化组织形成相关基因、与牙周及颅面部发育及牙周
再 生修 复 中信 号通 路 相关 基 因 、及 重 要 的生 长 因
中国博士后基金 资助项 目ｆ 编号：２ ００ ２ ０ ７ ０ ７ ４ ０ ７） 中国博士后特别资助项 目（ 编号 ：２０ ０ ０ １ ０ ８ １ ６）
细 胞 （ ｇ ｎ ｒｔ ｇ ｔ ｓ ｅ ｄ ｒ ｅ ｅ ，ＲＴＣ 和 ｒ ｅ ｅａｉ － ｉ ｕ ｅｉ ｄ ｃｌ ｅ ｎ ｓ ｖ ｌ ） 牙 周 膜 问 充 质 细 胞 （ｅｉｄ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｐ ｒｏ ｏ ｔｌ ｉ ｍｅ ｔ ｇ
胞 来 自骨组 织还 是 来 自牙 周膜 一 直存 在 不 同意 见 。 最近 有 学 者［ ２ １ 通过 Ｐ Ｓ ＤＬ Ｃ示踪 发现 ：表达 骨髓 基
其 复杂 的生物 学过程 ，而 了解 牙周发 育学过 程无 疑 对 深入研 究 Ｐ Ｌ Ｃ的生物 学作 用和 实现真 正意 义 Ｄ Ｓ
上 的生 物再 生 都 至关 重要 。最近 有报 道 显示 ：用 发 育 中的 根尖 部 牙胚 条 件 培 养 基 提 供 的 生 物 学 信 号 ，可诱 导 Ｐ Ｓ ＤＬ Ｃ向成 牙骨质 样细胞 分化 ，形 成
牙 周 膜 干 细 胞 （ｅｉｄ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｓｅ ｐ ｒ ｏ ｔｌ ｉ ｍｅ ｔ ｔｍ ｏ ｇ ｃｌ，Ｐ Ｓ ） ｅ ｌ ＤＬ Ｃ 是牙 周组 织再生 最直接 、最可 靠 的种
子细胞 ，也 是牙周缺 损细 胞治 疗和基 因治疗 重要 的 细胞 学基础 ，在牙 周病治 疗 、种 植体 周 围软硬 组 织 缺损修 复 、正畸牙 移动过 程 中的修复 与改建 中均 发 挥重 要作用 ，是近 年来 牙周病研 究领 域 的焦点和 热
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
牙周组织再生技术的研究进展
牙周组织再生技术的研究进展牙周组织再生是实现牙槽骨、牙骨质、牙周膜间的再生与功能重建。
随着组织工程学和基因工程学的飞速发展，为牙周组织再生提供了新的思路。
[Abstract] The purpose of periodontal regeneration is to obtained regeneration and reconstruction between alveolar bone，cementum and periodontal membrane.With the rapid development of tissue engineering and gnetic engineering，periodontal regeneration will have an new idea.[Key words] Periodontal tissue regeneration；Tissue engineering；Gnetic engineering牙周炎是一种慢性炎症性疾病，若未及时治疗，会导致牙槽骨丧失、牙齿松动，最终导致牙齿丧失，因此牙周炎的预防和治疗引起了学者们的重视。
目前，牙周组织再生的方法有牙周植骨术、引导组织再生术等。
随着组织工程学和基因工程学的发展，为牙周组织再生带来新的希望。
本文将对牙周组织再生技术的进展作一综述。
1 传统牙周组织再生技术1.1 再生性手术获得牙周组织再生的手术治疗方法称为再生性手术（regenerative surgery），主要包括植骨术和引导性组织再生术，也可两者联合应用，或与其他一些促进再生的方法如根面生物处理和使用生长因子等联合应用。
1.1.1 植骨术牙周植骨术（bone grafts）是采用骨或骨的替代品等移植材料来修复因牙周炎造成的牙槽骨缺损的方法。
研究认为，骨再生构成了新附着的先决条件，新骨的形成能够诱导牙骨质和牙周膜的形成。
根据植骨材料的来源，目前用于植骨的材料主要有自体骨、异体骨、异种骨和骨替代品。
牙周膜干细胞的表型分析
牙周膜干细胞的表型分析贺慧霞;刘洪臣;王东胜;鄂玲玲;马攀【摘要】目的:分析人牙周膜干细胞(PDLSCs)的表型特点,为分离、鉴定和应用PDLSCs提供有效途径.方法:采用免疫磁珠法分离PDLSCs,制备细胞爬片.分别采用免疫荧光、免疫细胞化学染色法检测PDLSCs表面蛋白STRO-1、CD44、Vimentin、CK、COL-Ⅰ、BSP的表达.收集PDLSCs,采用RT-PCR法检测PDLSCs Scleraxis mRNA、Col Ⅰ及CAP mRNA的表达情况.结果:PDLSCs表达间充质干细胞表面标志STRO-1、CD44,强阳性表达间充质来源细胞表面蛋白Vimentin,弱表达Col-Ⅰ,不表达上皮细胞标志蛋白CK、成骨细胞相对特异性蛋白BSP.RT-PCR也显示PDLSCs表达韧带组织特异性基因Scleraxis和Col-Ⅰ,不表达成牙骨质细胞特异性蛋白CAP.结论:本实验所分离的PDLSCs具有间充质来源的、牙周组织特异性的、未分化细胞的表型特点,该特点可作为PDLSCs分离和鉴定的重要依据.%Objective: To analyze the phenotypic characteristics of human periodontal ligament stem cells(PDLSCs), and to provide new way for understanding and further application of PDLSCs. Materials and Methods. PDLSCs were isolated using an immunomagnetic bead selection system. The slides of the cells were prepared and immunofluorescence and immunocytochemical straining were performed to detect the expression of specific proteins including STRO-1, CD44, Vimentin, CK, COL-I, BSP, respectively. In addition, PDLSCs were collected to detect the the gene expression of Scleraxis mRNA, Col I mRN and CAP mRNA by RT-PCR techniques. Results: PDLSCs expressed the surface markers of mes-enchymal stem cells such as STRO-1 and CD44, and positively expressedthe specific proteins of cells originated from mes-enchymal tissue including Vimentin, weakly expressed CoL-I, and negatively expressed the CK which is expressed specially in epithelial cells. PDLSCs were also negatively expressed the marker of osteocytes of BSP. Results from RT-PCR showed that these cells positively expressed the specific marker of tendon tissue-Scleraxis, specific marker of membrane-Collagen I, and negatively expressed the specific marker of cementocyte-CAP. Conclusion: PDLSCs isolated by immunomagnetic bead selection system in this study showed the phenotypes of mesenchymal origination, periodontal specificity and undifferentiated cells. These characteristics may provide important evidences for isolation, identification, and futher application for PDLSCs.【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》【年(卷),期】2011(012)005【总页数】4页(P257-260)【关键词】牙周膜干细胞;表型;间充质【作者】贺慧霞;刘洪臣;王东胜;鄂玲玲;马攀【作者单位】解放军总医院口腔医学研究所北京100853;解放军总医院口腔医学研究所北京100853;解放军总医院口腔医学研究所北京100853;解放军总医院口腔医学研究所北京100853;解放军总医院口腔医学研究所北京100853【正文语种】中文【中图分类】R780.2在生理状态下，牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的主要功能是维持牙周膜中细胞更新和凋亡的动态平衡；在病理情况下，则主要是参与牙周损伤后的再生修复、生理性改建过程。
干细胞在牙周病学中的应用进展
干细胞在牙周病学中的应用进展谢军;陆玉林;曹庆堂【摘要】牙周病是造成牙齿缺失的常见病因之一。
随着对干细胞的深入研究，牙周膜干细胞得以从牙周膜提取分离，具有分化成牙周组织细胞的能力。
通过分析近年的组织工程学文章，探讨牙周膜干细胞的应用前景。
%Periodontal disease is one of the common cause of tooth loss.With the in-depth study of stem cells,periodontal ligament stem cells isolated from periodontal ligament tissue, has the ability to differentiate into periodontal tissue cells. To analyze articles tissue engineering in recent years, this article discussed the application prospect of the periodontal ligament stem cell.【期刊名称】《北方药学》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】2页(P86-86,87)【关键词】牙周病;牙周膜干细胞;组织工程学【作者】谢军;陆玉林;曹庆堂【作者单位】内蒙古医科大学呼和浩特 010110;内蒙古医科大学第四附属医院包头014000;内蒙古医科大学第四附属医院包头014000【正文语种】中文【中图分类】R781.4牙周病是指发生在牙周支持组织的各种疾病，累及四种牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的慢性感染性疾病。
目前牙周病的治疗分为四阶段：基础治疗、牙周手术治疗、修复治疗以及牙周支持治疗。
非手术治疗只能消除病因，难以达到理想疗效。
为了形成新的附着，Nyman S引入引导组织再生的原理，提出用外科方法放置一个物理屏障选择性地分隔不同的牙周组织，阻止牙龈上皮和牙龈结缔组织向根面生长，造成空间，诱导具有牙周组织再生潜力的牙周膜细胞冠向移动并生长分化，实现牙槽骨、牙周膜、牙骨质的再生，形成新的附着[1]。
大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定
大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro Cultivation and AppraisalZHANG Ai-xia 1 ，21.Life science college of Jiaying University ，Meizhou，GuangdongProvince ，514015 China ；2.Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering Sun Yat-Sen University ，Zhongshan ，Guangdong Province ，510080 China [] Objective To establish the rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSC）s separation of training method，and morphological observation ，phenotype and multi-directional differentiation ability of detecting. Methods He whole bone marrow adherent cultivation method in rat BMSCs ，morphological observation under amicroscope ，flow cytometry instrument to detect cell surface markers CD29 ，CD44，CD45，and induced to osteogenesis and into fat rat BMSCs differentiation.Results The cells cultured separation is given priority to with spindle cells ，a swirling growth. CD29 ，CD44 were positive expression and CD45 were negative. Into fat osteogenesis after induction ，oil red O and alizarin redS staining were positive. Conclusion The whole bone marrow adherent cultivation method of separation of cells with the biological characteristics of mesenchymal stem cells ，with multi-directional differentiation potential.BMSC作为多能干细胞的一种，由于其取材方便，具有多向分化潜能，有较弱的免疫抗原性，体内植入反应较弱，正逐渐受到学者们的广泛关注。
实验性牙周炎大鼠模型的建立
实验性牙周炎大鼠模型的建立孙继军;王栋;王爱芹【摘要】背景：建立实验性牙周炎大鼠模型是研究牙周病的基本方法之一,目前常用的建模方法存在许多弊端,需要进一步改进。
目的：建立一种近似于人类临床的牙周炎动物模型方法。
方法：将20只8周龄的Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,锐分离实验组大鼠双侧下颌第一磨牙颊侧牙龈,局部黏结慢性牙周炎患者的牙石于牙颈部,滴入慢性牙周病炎患者的唾液10μL/次,2次/d；对照组大鼠牙齿不做处理。
两组大鼠均喂以高糖黏性食物。
结果与结论：造模14 d后实验组动物一般生物学特征和牙周组织病理、X射线变化均符合典型牙周炎表现。
局部黏结牙石加混合细菌感染的方法建立的大鼠牙周炎模型可以模拟人类牙周炎的组织变化,是一种接近于人类临床的简单、实惠、有效的建模方法。
%10.3969/j.issn.2095-4344.2012.37.006【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2012(000)037【总页数】4页(P6867-6870)【关键词】牙周炎;细菌感染;牙石;动物模型;大鼠;组织构建【作者】孙继军;王栋;王爱芹【作者单位】滨州医学院附属医院口腔内科,山东省滨州市256603;滨州医学院附属医院口腔内科,山东省滨州市256603;滨州医学院附属医院口腔内科,山东省滨州市256603【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言牙周炎是引起失牙的主要原因，建立稳定、可靠的实验性牙周炎动物模型，可以为探讨牙周炎病因、病理及临床治疗提供研究工具[1-2]。
大鼠除切牙牙根持续生长外，其牙周组织如牙龈、牙槽骨、牙周膜的解剖结构及相互关系与人相似；其口腔菌斑的形成及其生长发育、滋生、繁殖等亦都与人类相似，且大鼠价格便宜、操作简便，所以在牙周炎的实验研究中，大鼠是一种较好的模型动物。
传统大鼠牙周炎模型制备方法包括丝线结扎、高糖喂养、注射激素和应激刺激等[3-7]，但这些方法具有干扰因素多、操作复杂、成功率较低、花费多等缺点。
牙周膜干细胞在牙周组织再生中的研究新进展
［文章编号］㊀１６７４⁃８６０３（２０２０）０４⁃０２７０⁃００牙周膜干细胞在牙周组织再生中的研究新进展吴博昊１，安莹２∗（１．空军军医大学基础医学院，陕西西安７１００３２；２．军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，陕西省口腔生物工程技术研究中心，空军军医大学口腔医院牙周病科，陕西西安７１００３２）［摘要］㊀牙周膜干细胞（ＰＤＬＳＣｓ）具有增殖及多向分化潜能等特性，在牙周组织再生方面具有广阔的应用前景㊂本文总结了ＰＤＬＳＣｓ的生物学特性及其在牙周组织再生中的最新应用，并对其将来的临床应用前景进行展望㊂［关键词］㊀牙周膜干细胞；牙周再生；组织工程［中图分类号］㊀Ｒ７８１．４㊀㊀［文献标识码］㊀Ａ㊀㊀［ｄｏｉ］㊀１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４⁃８６０３．２０２０．０４．０１３基金项目：国家自然科学基金（８１７００９７１）∗通信作者：安莹，Ｅｍａｉｌ：ａｎｙｉｎｇ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ㊀㊀牙周炎是由牙菌斑引起的牙周组织的慢性炎症，进而造成牙槽骨的破坏吸收，是导致牙齿缺失的主要原因之一㊂近期的研究表明牙周炎与一些全身系统的疾病密切相关，例如阿兹海默症［１］㊁冠心病［２］以及免疫系统疾病［３］等㊂牙周炎的传统治疗，如洁治术和刮治术等，可以控制炎症，但难以恢复牙周组织的形态和功能㊂牙周组织再生是通过组织工程的方法，在体外利用种子细胞㊁生长因子以及生物支架，搭建出三维的移植复合体，以修复和改善牙周组织的形态和功能［４］㊂种子细胞是组织工程的核心和必要成分，牙周膜干细胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＰＤＬＳＣｓ）是一类有克隆增殖能力㊁多向分化潜能和免疫调控等生物学特性的成体干细胞㊂由于ＰＤＬＳＣｓ是从牙周组织中分离获取，因而也是最适宜牙周再生的种子细胞之一㊂生长因子在牙周再生中具有重要作用，适宜的生长因子可以促进干细胞的增殖㊁分化以及生成组织的能力㊂支架材料应当具有生物相容性㊁可降解性㊁高孔隙率以及良好的表面活性等特性［５］，为干细胞提供附着㊁增殖㊁分化和分泌细胞外基质的土壤㊂本文从上述角度出发，对ＰＤＬＳＣｓ生物学特性㊁牙周再生的支架材料㊁牙周再生的生物活性分子以及近年用ＰＤＬＳＣｓ进行牙周再生的临床实验作一综述㊂１㊀ＰＤＬＳＣｓ的生物学特性１．１㊀ＰＤＬＳＣｓ的来源以及表面标记牙周膜组织是连接牙根与牙槽骨的致密结缔组织，其主要生理功能是缓冲牙合力㊁稳固支持和营养等作用㊂ＰＤＬＳＣｓ是从牙周膜组织中分离出的一类干细胞㊂２００４年，Ｓｅｏ等［６］首次利用酶消化法从人的牙周膜组织中分离出ＰＤＬＳＣｓ，这种干细胞表现出类似间充质干细胞（ｍｙｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）的生物学特性，同时也会表达ＭＳＣｓ的相关标记㊂因而，起初研究者会使用ＭＳＣｓ的相关标记物鉴别ＰＤＬＳＣｓ，如基质细胞抗原１（ｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ１，ＳＴＲＯ１）㊁ＣＤ１４６和粘蛋白１８（ｍｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＵＣ１８）㊂Ｔｒｕｂｉａｎｉ等［７］在ＰＤＬＳＣｓ表面检测到了更多的ＭＳＣｓ标记物，包括ＣＤ１０㊁ＣＤ２６㊁ＣＤ２９㊁ＣＤ７３和卷曲受体蛋白９（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ⁃９，ＦＺＤ９）等；同时ＰＤＬＳＣｓ表面也会存在一些基质细胞㊁内皮细胞的标记物，如ＣＤ４４㊁ＣＤ９０㊁ＣＤ１０５㊁ＣＤ１６６㊁ＳＴＲＯ３等［８］㊂相对于外周血和脐带来源的ＭＳＣｓ，ＰＤＬＳＣｓ有更多的胚胎干细胞的标记物表达［９］，这些分子能够一定程度体现干细胞的未分化特性㊂例如：相比牙髓干细胞（ｄｅｎｔａｌｐｕｌｐｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＤＰＳＣｓ）和骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＳＣｓ），ＰＤＬＳＣｓ会表达更多的阶段特异性抗原４（ｓｔａｇｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ４，ＳＳＥＡ⁃４），这表明ＰＤＬＳＣｓ具有ＭＳＣｓ样的性质以及更多未分化细胞的特性［８］㊂１．２㊀ＰＤＬＳＣｓ的增殖能力ＰＤＬＳＣｓ在体外具有一定克隆增殖的能力，其增殖潜能比ＢＭＭＳＣｓ和ＤＰＳＣｓ更强［１０］，通常ＢＭＭＳＣｓ在第５０代时就已经无法继续传代，而ＰＤＬＳＣｓ在第１００代时仍然保有一定的增殖能力［１１］㊂Ｌｉｕ等［１２］发现处于咀嚼应力区的牙周组织，会表现出更强的活性和自我修复能力，这表明ＰＤＬＳＣｓ的增殖能力与机械负荷相关㊂Ｍｏｎｎｏｕｃｈｉ等［１３］发现白介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）⁃１１㊁血管紧缩素（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ，Ａｎｇ）Ⅱ及其２型受体（ＡｎｇⅡｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ２，ＡＧＴＲ２）参与了机械负荷对ＰＤＬＳＣｓ的增殖能力的调控，机械负荷会促进ＰＤＬＳＣｓ分泌ＩＬ⁃１１，作用于ＡｎｇⅡ／ＡＧＴＲ２通路促进ＰＤＬＳＣｓ的增殖㊂缺氧环境也会促进ＰＤＬＳＣｓ的增殖［１４］，经过音猬因子（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）处理的ＰＤＬＳＣｓ也表现出更高的增殖能力［１５］㊂还有研究表明，在牙周病中起重要作用的炎症调控因子ＩＬ⁃１０的上调也可以促进ＰＤＬＳＣｓ的增殖［１６］㊂１．３㊀ＰＤＬＳＣｓ的多向分化潜能１．３．１㊀成骨分化能力㊀Ｓｅｏ等［６］首次发现了ＰＤＬＳＣｓ的成骨能力，他们将ＰＤＬＳＣｓ与羟基磷灰石（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡ）／β⁃磷酸三钙（β⁃ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ，β⁃ＴＣＰ）陶瓷的复合材料移植至大鼠体内，６ ８周后处死大鼠，茜素红染色显示生成大量矿化结节，免疫组化结果检测到大量成骨相关分子的高表达㊂ＰＤＬＳＣｓ的成骨能力也受多方面因素影响，Ｚｈａｏ等［１７］用脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）模拟ＰＤＬＳＣｓ的炎症环境，并加入了芦丁，碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）和茜素红染色等结果显示，芦丁可以有效地减弱炎症状态对于ＰＤＬＳＣｓ成骨的抑制㊂外泌体对ＰＤＬＳＣｓ的成骨分化也有调节作用，Ｗａｎｇ等［１８］在成骨诱导条件下的ＰＤＬＳＣｓ中加入了人脱落乳牙牙髓干细胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｅｘｆｏ⁃ｌｉａｔｅｄｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈ，ＳＨＥＤ）来源的外泌体，促进了ＰＤＬＳＣｓ的成骨分化㊂骨组织的恢复是牙周组织再生的关键之一，因而ＰＤＬＳＣｓ成骨能力方面的研究，对于牙周再生有十分重要的意义㊂１．３．２㊀成脂分化能力㊀ＰＤＬＳＣｓ的成脂能力最早也是由Ｓｅｏ的团队所发现，他们在ＰＤＬＳＣｓ的培养基中加入含有胰岛素㊁地塞米松等成分的 鸡尾酒 成脂诱导液，３周后油红Ｏ染色后可见细胞内的脂滴，ＲＴ⁃ＰＣＲ检测也显示成脂分子 过氧化物酶体增殖物激活受体γ２（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ２，ＰＰＡＲγ２）的表达大量上调［６］㊂Ｄｅｎｇ等［１９］在２５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖的高糖环境下培养ＰＤＬＳＣｓ，发现其成脂能力会有提升，成脂诱导７ｄ后ＲＴ⁃ＰＣＲ结果显示，ＰＰＡＲγ等成脂相关分子的ｍＲＮＡ远高于对照组，但成骨能力会受到抑制，这或许也是糖尿病患者ＰＤＬＳＣｓ修复能力明显减弱的原因之一㊂Ｙａｎｇ等［２０］用一氧化氮合成酶的抑制剂 Ｌ⁃单甲基精氨酸作用于ＰＤＬＳＣｓ，其成脂的能力明显提升，但成骨能力也受到了抑制㊂许多研究都证实了ＰＤＬＳＣｓ的成脂能力，但上文所述的成脂能力和成骨能力互相拮抗的机制或许会为如何提高ＰＤＬＳＣｓ的成骨能力，提供一种新的思路㊂１．３．３㊀其他的分化能力㊀ＰＤＬＳＣｓ可以形成Ｓｈａｒｐｅｙ纤维样的组织：Ｌｉｍ等［２１］用β⁃卡波林生物碱处理ＰＤＬＳＣｓ，将其播种至双相磷酸钙，移植到免疫缺陷小鼠的皮下，８周后ＰＤＬＳＣｓ表现出更高的矿化程度，并且形成类似Ｓｈａｒｐｅｙ纤维样的组织垂直连接矿化组织，这对牙周再生具有重要意义㊂ＰＤＬＳＣｓ还具有成牙骨质的能力：Ｊｉｎ等［２２］用纤溶酶原激活物抑制剂（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ⁃１，ＰＡＩ⁃１）处理ＰＤＬＳＣｓ，将其与ＨＡ／β⁃ＴＣＰ和人牙根牙本质基质制成的移植复合物移植至免疫缺陷小鼠的背部，８周后在ＨＡ／β⁃ＴＣＰ表面形成了牙骨质样物质㊂除此以外，ＰＤＬＳＣｓ还可通过短时机械应力刺激，分化为表达肌动蛋白㊁心肌肌钙蛋白Ｔ等心肌标记物的心肌样细胞［２３］；用胰岛素㊁激活素⁃Ａ㊁丁酸钠㊁２⁃巯基乙醇等可将ＰＤＬＳＣｓ诱导为可在高糖环境下分泌胰岛素的胰岛样细胞［２４］；ＰＤＬＳＣｓ还可以分化为视网膜神经节样细胞，表达神经元和视网膜的相关标记物，并且可以形成有效突触［２５］㊂由于人ＰＤＬＳＣｓ可以来源于作用较少的第三磨牙，因而除了用于骨组织和牙周组织再生，还被用于软骨组织㊁神经组织㊁心肌组织等多种组织的再生㊂２㊀生长因子对ＰＤＬＳＣｓ调控生长因子可以有效地促进ＰＤＬＳＣｓ的增殖㊁分化以及成骨能力㊂近年来，除了经典的生长因子，其他一些生物活性分子也被用于牙周再生，如微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）㊁成骨信号分子等㊂２．１㊀经典生长因子转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ）β１㊁胰岛素样生长因子（ｉｎｓｕｌｉｎ⁃ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＩＧＦ）等经典生长因子广泛存在于外周血及血小板制品中，如富血小板血浆（ｐｌａｔｅｌｅｔ⁃ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ，ＰＲＰ）㊁富血小板纤维蛋白（ｐｌａｔｅｌｅｔ⁃ｒｉｃｈｆｉｂｒｉｎ，ＰＲＦ）等㊂因此，许多学者研究了这类血小板制品对于牙周再生的影响㊂Ｋｏｒｎｓｕｔｈｉｓｏｐｏｎ等［２６］在犬的牙周炎动物模型中采取翻瓣术并加入ＰＲＦ的方法，这种方法有效地减轻了炎症，并且有更多的Ａ１型Ⅰ型胶原（Ｃｏｌｌａｇｅｎ１Ａ１，Ｃｏｌ１Ａ１）和Ａ１型Ⅲ型胶原（Ｃｏｌｌａ⁃ｇｅｎ３Ａ１，Ｃｏｌ３Ａ１）的分泌，而Ｃｏｌ１Ａ１和Ｃｏｌ３Ａ１的分泌水平能够反映ＰＤＬＳＣｓ的成骨能力㊂Ｄｕａｎ等［２７］将ＰＲＦ与ＰＤＬＳＣｓ的复合物移植至小鼠的牙周组织，结果显示这种处理会上调移植物骨涎蛋白（ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＳＰ）㊁骨钙蛋白（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，ＯＣＮ）㊁Ｒｕｎｔ相关转录因子２（ｒｕｎｔ⁃ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２，ＲＵＮＸ２）和ＡＬＰ的水平，且可以观察到更多的骨质的生成㊂Ａｍｍａｒ等［２８］利用水凝胶材料包裹含ＴＧＦ⁃β１㊁ＩＧＦ⁃１㊁血小板源生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）的冻干血小板浓缩液，研究表明这种材料可以有效地释放生长因子，提升ＰＤＬＣＳｓ的生物活性及增殖能力㊂这也为解决生长因子难以被缓释㊁有效递送和吸收的问题，提供了一种值得借鉴的方法㊂２．２㊀成骨相关分子成骨相关分子在组织再生的过程中起到调控和诱导成骨的作用，其中一类重要的成骨相关分子是信号分子，这是一类在细胞间或是细胞内传递信息的生物分子㊂常用于牙周再生的信号分子主要是成骨相关的信号分子，例如骨形成蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏ⁃ｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）㊂Ａｃｉｌ等［２９］研究表明ＢＭＰ⁃７可以上调ＰＤＬＳＣｓ中骨桥蛋白（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎｅ，ＯＰＮ）和ＯＣＮ等成骨相关蛋白的表达，而且ＰＤＬＳＣｓ会被诱导为成骨细胞样／成牙骨质细胞样的细胞㊂Ｋａｎｇ等［３０］利用碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）对ＰＤＬＳＣｓ的增殖能力的促进作用，将其与ＢＭＰ⁃２协同作用于ＰＤＬＳＣｓ，增强了ＰＤＬＳＣｓ的成骨及矿化能力，同时有效地弥补了ｂＦＧＦ对ＰＤＬＳＣｓ成骨的抑制作用，这种处理方法在牙周再生中值得借鉴㊂２．３㊀ｍｉＲＮＡ根据目前文献，可以促进ＰＤＬＳＣｓ成骨分化的ｍｉＲＮＡ有ｍｉＲ２２㊁ｍｉＲ２１０㊁ｍｉＲ２９９⁃５ｐ㊁ｍｉＲ５４３等，而抑制ＰＤＬＳＣｓ成骨分化能力的有ｍｉＲ１２５ｂ㊁ｍｉＲ１３２等［３１⁃３６］㊂值得注意的是ｍｉＲ２１８，虽然尚未有文献报导ｍｉＲ２１８对ＰＤＬＳＣｓ的调控，但是ｍｉＲ２１８却可以通过基质金属蛋白酶⁃９（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，ＭＭＰ９），抑制破骨细胞的活性，缓解炎症状态，这无疑对牙周再生也是有积极意义的［３７］㊂但是，在临床上实现ｍｉＲＮＡ的有效递送和转运却极其困难㊂Ｌｉｕ等［３８］利用聚乳酸㊁聚乙二醇㊁介孔二氧化硅纳米粒子㊁聚乳酸⁃乙醇酸微球等材料，制作出一种可以携带并长时间缓释ｍｉＲＮＡ以及生长因子的纳米纤维海绵球，将这种材料复合ｍｉＲ⁃１０ａ／ＩＬ⁃２／ＴＧＦ⁃β，移植至牙周炎小鼠模型后，成骨相关分子的表达上调，再生的骨量也有明显提升㊂２．４㊀其他调控ＰＤＬＳＣｓ成骨作用的分子其他一些生物活性分子，对于ＰＤＬＳＣｓ的成骨也具有促进作用㊂Ｊｉａ等［３９］发现二甲双胍可以通过蛋白激酶Ｂ／核因子相关因子２通路，促进ＰＤＬＳＣｓ的成骨作用，并对氧化应激状态下的ＰＤＬＳＣｓ具有一定的保护作用㊂芦丁也可以有效地抵抗炎症状态下ＰＤＬＳＣｓ成骨分化受到的抑制作用［１７］㊂３㊀用于ＰＤＬＳＣｓ进行牙周再生支架材料生物支架材料为干细胞提供了适宜再生的三维微环境，良好的生物支架材料可以有效地促进细胞的附着㊁增殖㊁分化和组织生成㊂随着材料学的发展，近年也出现了更多应用于牙周再生的新材料㊂３．１㊀羟基磷灰石ＨＡ是人骨骼的主要无机成分，具有良好的生物相容性㊂Ｐａｒｋ等［４０］将ＨＡ与ＴＣＰ复合的生物材料作为支架，播种ＰＤＬＳＣｓ后移植至小鼠皮下，观察到了牙周膜样组织㊁骨样组织和牙骨质样的组织，甚至还观察到了类似Ｓｈａｐｅｙ纤维的组织，这对于实现牙周组织更全面的再生无疑有重大意义㊂Ｈｉｇｕｃｈｉ等［４１］利用超声喷涂和静电喷涂的方法，在聚合物生物膜表面修饰了一层厚度约为２ ３μｍ的纳米羟基磷灰石，涂层可以有效减缓生物膜的降解，增加生物膜的润湿度，而且细胞毒性较低㊂Ｗｉｊｅｄａｓａ等［４２］将鲷鱼和鲑鱼两种鱼鳞来源的ＨＡ，与肽纳米纤维复合成支架材料进行细胞学实验，细胞活力㊁ＡＬＰ活性和茜素红染色的结果都显示，这两种材料明显优于对照组，且鲑鱼组的细胞成骨分化能力更强㊂Ｏｕ等［４３］同样利用静电纺丝技术在一种玉米蛋白复合明胶的支架材料中加入了纳米羟基磷灰石，研制出了一种玉米蛋白／明胶／纳米羟基磷灰石复合的纳米生物支架，这种材料具有极为良好的表面润湿性，并且还可以促进人ＰＤＬＳＣｓ的附着㊁增殖和成骨的分化㊂ＨＡ具有与骨质相似的结构㊂其前体β⁃ＴＣＰ会在植入后６ ９个月内被替代㊁吸收，并在吸收的过程中提供成骨相关的钙离子㊁镁离子㊁磷酸根离子等，这些离子还会激活ＡＬＰ等成骨的关键酶，这些对于成骨及矿化至关重要的离子是其他材料所不具备的［４４⁃４５］㊂３．２㊀明胶明胶因其生物相容性㊁可降解㊁亲水等性能，近年来常作为生物支架材料用于组织再生㊂Ｙａｎｇ等［４６］研制出了一种玉米蛋白复合明胶的生物支架，这种材料具有良好的表面润湿性，并且其中的玉米蛋白有良好的生物亲和性能以及可降解性，可以有效地促进人ＰＤＬＳＣｓ的增殖和附着，但是对于ＰＤＬＳＣｓ的成骨性能并无明显的调节作用㊂Ｐａｎ等［４７］构建了一种明胶／甲基丙烯酸盐（ｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈ⁃ａｃｒｙｌａｔｅ，ＧｅｌＭＡ）水凝胶的包裹体系，其具有较大的溶胀比㊁良好的通透性和大量的纤维网络，可以为ＰＤＬＳＣｓ提供适宜附着㊁增殖和成骨分化的微环境㊂ＧｅｌＭＡ水凝胶包裹ＰＤＬＳＣｓ修复牙周病所造成的骨缺损，显微ＣＴ和组织学切片显示可以形成更多的骨增量，ＡＬＰ的活性也有显著提升㊂明胶可以加工成为水凝胶的形态，这种形态具有多孔结构，有利于进行细胞和分子的有效募集和递送；同时这种形态可以在募集了干细胞和生长因子后，采用注射的方式移植至缺损部位，对于骨缺损体积普遍较小的牙周组织，这种方式会有效降低手术难度［４８］㊂３．３㊀壳聚糖壳聚糖具有利于生物分子缓释的多孔结构，也是组织工程的理想材料之一㊂ＮｉｖｅｄｈｉｔｈａＳｕｎｄａｒａｍ等［４９］用静电纺丝技术制作出了聚己内酯和壳聚糖的双层复合物，这种材料具有多孔性和利于蛋白质粘附的特性，播种干细胞以后，干细胞的ＡＬＰ活性以及胶原蛋白的表达都有明显升高㊂Ｌｉ等［５０］研制了一种ＴＧＦ⁃β３和壳聚糖凝胶海绵的的复合物，可以大幅提升体外实验中人ＰＤＬＳＣｓ的增殖速率和ＡＬＰ活性，Ⅰ型胶原㊁ＡＬＰ㊁ＴＧＦ⁃βＲＩ㊁ＴＧＦ⁃βＲＩＩ等成骨相关分子也有更高的表达㊂同时壳聚糖还存在一定的免疫调节效应㊂Ｓｈｕ等［５１］将壳聚糖修饰为２⁃Ｏ，６⁃Ｎ硫酸化壳聚糖（２⁃Ｎ，６⁃Ｏ⁃ｓｕｌｆａｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎ，２６ＳＣＳ），２６ＳＣＳ会在移植的初期短时地活化巨噬细胞，并促进炎症反应，这种反应会逐渐转变为对炎症反应的抑制，他们推测这种免疫调节能力可能形成良好的免疫微环境，这种微环境在成骨的过程中会增强干细胞与免疫细胞间的交流，有利于成骨的过程，并且２６ＳＣＳ还会通过成骨相关的通路促进干细胞的成骨能力㊂Ｌｉ等［５２］还将壳寡糖进行磺酸化处理，磺化壳寡糖可以与ｂＦＧＦ产生更紧密的结合㊂ｂＦＧＦ可以有效促进人ＰＬＤＳＣｓ的体外增殖，抑制其成骨分化，但磺化壳寡糖可以缓解ｂＦＧＦ对于ＰＤＬＳＣｓ的成骨分化抑制，表明磺化壳寡糖可能存在一定的促进成骨能力㊂Ｇｅ等［５３］将壳聚糖涂布于纳米羟基磷灰石，在其表面培养的ＰＤＬＳＣｓ表现出更高的成活率，更高的ＡＬＰ活性以及ＢＳＰ㊁ＯＰＮ㊁ＯＣＮ等成骨相关蛋白的表达㊂壳聚糖的独特优势在于其抗菌特性，这种特性在有菌的口腔环境下具有独特优势；同时壳聚糖还可以加工成与上述明胶类似的水凝胶形态支架材料㊂但壳聚糖的缺点是灭菌过程会降低其分子量㊁黏度和凝胶化程度，这可能会导致其对细胞的募集能力下降［５４⁃５５］㊂如上文所述，不同材料具有不同的生物学特性，各有优劣，因而可以结合各种材料优势，研制出多种材料复合的㊁具有良好生物学特性㊁理化性质以适宜的微观表面结构的材料，或许是未来牙周组织再生的关键㊂４㊀ＰＤＬＳＣｓ用于牙周再生的动物实验及临床研究关于ＰＤＬＳＣｓ应用于牙周再生的动物实验前文已有所叙述，但许多动物模型并不是牙周炎模型，未将细胞移植至颌骨内㊂Ｉｗａｓａｋｉ等［５６］在免疫缺陷小鼠的第一磨牙处通过手术建立了Ⅱ度骨缺损的牙周炎模型，以人的羊膜为支架移植入人ＰＤＬＳＣｓ，结果显示在牙周膜间隙内形成更加粗大的胶原束，几近垂直的连接着新形成的类牙骨质层与新生骨组织㊂Ｎｕñｅｚ等［５７］则在犬的上颌第一磨牙通过手术建立了牙周炎模型，但实验结果却显示ＰＤＬＳＣｓ对于牙周组织再生无影响，其原因可能是手术破坏较深，达到了根分叉以下，移植的细胞数量可能不足，而且未使用生物膜㊂这提示在牙周再生中，移植与缺损量相匹配的ＰＤＬＳＣｓ以及维持ＰＤＬＳＣｓ的相对稳定，都是十分重要的㊂鉴于干细胞疗法安全和伦理学问题一直存在争议，近年来ＰＤＬＳＣｓ用于临床研究十分有限㊂Ｃｈｅｎ等［５８］采用单中心随机实验的方法将３０名有骨缺损的牙周炎患者分为两组，实验组用自体ＰＤＬＳＣｓ＋引导组织再生（ｇｕｉｄｅｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧＴＲ）＋人工骨粉，而对照组仅用ＧＴＲ＋人工骨粉，虽然实验结果显示两组的临床疗效并无统计学差异，然而却证实了自体ＰＤＬＳＣｓ移植的安全性㊂Ｓｈａｌｉｎｉ等［５９］将２８名中重度牙周炎患者随机分为两组，比较了在翻瓣手术中移植自体ＰＤＬＳＣｓ与仅实施翻瓣术两种治疗方法的疗效㊂ＰＤＬＳＣｓ从患者自身智齿获取，与其周围的细胞外基质一同迅速与明胶支架材料混合，植入骨缺损；术后３㊁６㊁９㊁１２个月，相对于对照组，实验组牙周袋深度明显降低，骨缺损区的骨密度明显增加㊂Ｉｗａｔａ等［６０］则是挑选了牙周袋深度超过了４ｍｍ的患者，利用患者自体智齿获取的ＰＤＬＳＣｓ，在体外用自体ＰＤＬＳＣｓ与β⁃ＴＣＰ支架和可降解的聚乙二醇酸网制成的细胞膜片移植至牙周缺损的区域；６个月后，相比对照组，实验组患者牙周袋深度㊁临床附着丧失和骨高度都得到了明显地改善㊂上述研究结果表明，使用自体ＰＤＬＳＣｓ治疗牙周炎，目前为止是相对安全的㊂然而目前对于此种疗法的适应证（如牙周袋深度㊁牙齿松动度㊁骨缺损度等）和根分叉病变等牙周炎并发症是否也适用此种疗法，并没有文献报道㊂目前已报道的文献是以需翻瓣治疗甚至植骨的中重度牙周炎作为此种疗法的适应症㊂临床的有效性方面，目前只有文献证明对于牙周袋超过４ｍｍ的中重度牙周炎患者，ＰＤＬＳＣｓ自体移植的治疗可能是有效的［６０］㊂因而还需要大样本量的临床研究，以进一步探究其临床的有效性和具体适应症㊂５ 展望组织工程技术的飞速发展，为牙周再生这一新型治疗方法打下了更深厚的基础，但牙周再生需要面临诸多方面的问题和挑战㊂首先是干细胞的大量获取，作为最适宜牙周再生的干细胞之一的ＰＤＬＳＣｓ，人体来源极其单一，尤其是患有重度牙周病的患者㊂近年来细胞编程技术的出现可以提供解决思路，即用成体细胞诱导为诱导多能干细胞（ｉｎ⁃ｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣｓ），进而诱导为所需的细胞［６１］㊂Ｈａｍａｎｏ等［６２］曾将真皮成纤维细胞诱导为ｉＰＳＣｓ，进而诱导为ＰＤＬＳＣｓ㊂其次是如何便捷地制作出适宜ＰＤＬＳＣｓ生长分化，可以递送各种生长因子的支架材料，这类支架材料应当具有良好的生物相容性㊁可降解㊁亲水性，适宜的微观表面形貌和多孔结构，能够与一些包裹生长因子的载体紧密的结合㊂最后，ＰＤＬＳＣｓ应用于牙周再生的安全性和有效性还需要大样本量的临床实验来证明㊂［参㊀考㊀文㊀献］［１］㊀ＴｏｎｓｅｋａｒＰＰ，ＪｉａｎｇＳＳ，ＹｕｅＧ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅ，ｔｏｏｔｈｌｏｓｓａｎｄｄｅｍｅｎｔｉａ：Ｉｓｔｈｅｒｅａｌｉｎｋ？Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗ［Ｊ／ＯＬ］．Ｇｅｒ⁃ｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，２０１７，３４（２）：１５１⁃１６３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｇｅｒ．１２２６１．［２］㊀ＺａｎｅｌｌａＳＭ，ＰｅｒｅｉｒａＳＳ，ＢａｒｂｉｓａｎＪＮ，ｅｔａｌ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｄｉｓｅａｓｅ，ｔｏｏｔｈｌｏｓｓａｎｄｃｏｒｏｎａｒｙｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｃｏｒｏｎａｒｙａｎｇｉｏｇ⁃ｒａｐｈｙ：ａｃｒｏｓｓ⁃ｓｅｃｔｉｏｎａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＲｅｓ，２０１６，５１（２）：２２１⁃２２７［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｒｅ．１２３０１．［３］㊀ＭｉｃｈａｕｄＤＳ，ＦｕＺ，ＳｈｉＪ，ｅｔａｌ．ＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＤｉｓｅａｓｅ，ＴｏｏｔｈＬｏｓｓ，ａｎｄＣａｎｃｅｒＲｉｓｋ［Ｊ／ＯＬ］．ＥｐｉｄｅｍｉｏｌＲｅｖ，２０１７，３９（１）：４９⁃５８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｅｐｉｒｅｖ／ｍｘｘ００６．［４］㊀ＬａｎｇｅｒＲ，ＶａｃａｎｔｉＪＰ．Ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ／ＯＬ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６０（５１１０）：９２０⁃９２６［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．８４９３５２９．［５］㊀ＣａｒｍａｇｎｏｌａＤ，ＴａｒｃｅＭ，ＤｅｌｌａｖｉａＣ，ｅｔａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｓｃａｆｆｏｌｄｓａｎｄｃｅｌｌ⁃ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＡｐｐｌＢｉｏｍａｔｅｒＦｕｎｃｔＭａｔｅｒ，２０１７，１５（４）：ｅ３０３⁃ｅ３１２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５３０１／ｊａｂｆｍ．５０００３８９．［６］㊀ＳｅｏＢＭ，ＭｉｕｒａＭ，ＧｒｏｎｔｈｏｓＳ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｐｏｓｔｎａｔａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ［Ｊ／ＯＬ］．Ｌａｎｃｅｔ，２００４，３６４（９４２９）：１４９⁃１５５［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０⁃６７３６（０４）１６６２７⁃０．［７］㊀ＴｒｕｂｉａｎｉＯ，ＺａｌｚａｌＳＦ，ＰａｇａｎｅｌｌｉＲ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｍａｒｋｅｒｓｎａｎｏｇ，ＯＣＴ⁃４，ＳＳＥＡ⁃１，ＳＳＥＡ⁃４，ａｎｄｆｒｉｚｚｌｅｄ⁃９ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１０，２２５（１）：１２３⁃１３１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｃｐ．２２２０３．［８］㊀ＷａｄａＮ，ＭｅｎｉｃａｎｉｎＤ，ＳｈｉＳ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００９，２１９（３）：６６７⁃６７６［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｃｐ．２１７１０．［９］㊀Ｔｒｉｖａｎｏｖｉｃ＇Ｄ，Ｊａｕｋｏｖｉｃ＇Ａ，Ｐｏｐｏｖｉｃ＇Ｂ，ｅｔａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃａ⁃ｐａｃｉｔｙ，ｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈａｎｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｍａｒｋｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，２０１５，１４１：６１⁃７３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｌｆｓ．２０１５．０９．０１９．［１０］ＥｌｅｕｔｅｒｉｏＥ，ＴｒｕｂｉａｎｉＯ，ＳｕｌｐｉｚｉｏＭ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅｏｆｈｕｍａｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔａｎｄｄｅｎｔａｌｐｕｌｐ［Ｊ／ＯＬ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１３，８（８）：ｅ７１１０１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７１１０１．［１１］ＳｈｉＳ，ＢａｒｔｏｌｄＰＭ，ＭｉｕｒａＭ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｅａｎｄｒｅｐａｉｒｄｅｎｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＯｒｔｈｏｄＣｒａｎｉｏｆａｃＲｅｓ，２００５，８（３）：１９１⁃１９９［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１６０１⁃６３４３．２００５．００３３１．ｘ．［１２］ＬｉｕＪ，ＬｉＱ，ＬｉｕＳ，ｅｔａｌ．ＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｉｎｔｈｅＰｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓＭｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＡｒｅＳｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＳｔａｔｉｃＭｅｃｈａｎｉｃａｌＳｔｒａｉｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔ，２０１７，２０１７：１３８０８５１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１７／１３８０８５１．［１３］ＭｏｎｎｏｕｃｈｉＳ，ＭａｅｄａＨ，ＹｕｄａＡ，ｅｔａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ⁃１１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃｃｅｍｅｎｔｏｂｌａｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＰｅｒ⁃ｉｏｄｏｎｔａｌＲｅｓ，２０１５，５０（２）：２３１⁃２３９［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｒｅ．１２２００．［１４］ＨｅＹ，ＪｉａｎＣＸ，ＺｈａｎｇＨＹ，ｅｔａｌ．ＨｙｐｏｘｉａｅｎｈａｎｃｅｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｖｉａｔｈｅＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１６，１５（４）［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４２３８／ｇｍｒ１５０４８９６５．［１５］ＭａｒｔｉｎｅｚＣ，ＳｍｉｔｈＰＣ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＪＰ，ｅｔａｌ．Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇｓｔｉｍ⁃ｕｌａｔｅｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＤｅｎｔＲｅｓ，２０１１，９０（４）：４８３⁃４８８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／００２２０３４５１０３９１７９７．［１６］ＬｉｕＹ，ＹａｎｇＪ，ＳｕｎＷ．ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＩＬ⁃１０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＢｒａｚＯｒａｌＲｅｓ，２０２０，３４：ｅ０３０［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５９０／１８０７⁃３１０７ｂｏｒ⁃２０２０．ｖｏｌ３４．００３０．［１７］ＺｈａｏＢ，ＺｈａｎｇＷ，ＸｉｏｎｇＹ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｕｔｉｎｏｎｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎＬＰＳ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＭｏｌＨｉｓｔｏｌ，２０２０，５１（２）：１６１⁃１７１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０７３５⁃０２０⁃０９８６６⁃９．［１８］ＷａｎｇＭ，ＬｉＪ，ＹｅＹ，ｅｔａｌ．ＳＨＥＤ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｅｘｏｓｏｍｅｓｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＰＤＬＳＣｓｖｉａＷｎｔａｎｄＢＭＰｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ／ＯＬ］．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２０２０，１１１：１⁃１１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｄｉｆｆ．２０１９．１０．００３．［１９］ＤｅｎｇＣ，ＳｕｎＹ，ＬｉｕＨ，ｅｔａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｄｉｐｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｄｏｓｅｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅ［Ｊ／ＯＬ］．ＰｌｏＳｏｎｅ，２０１８，１３（７）：ｅ０１９９６０３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９９６０３．［２０］ＹａｎｇＳ，ＧｕｏＬ，ＳｕＹ，ｅｔａｌ．ＮｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｂａｌａｎｃｅｓｏｓｔｅｏｂｌａｓｔａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅｌｉｎｅａｇｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｖｉａｔｈｅＪＮＫ／ＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ，２０１８，９（１）：１１８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３２８７⁃０１８⁃０８６９⁃２．［２１］ＬｉｍＨＣ，ＣｈａＢＹ，ＳｏｎｇＳＵ，ｅｔａｌ．Ｈａｒｍｉｎｅｐｒｏｍｏｔｅｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｃｅｌｌ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＯｒａｌＤｉｓ，２０１８，２４（３）：４５６⁃４６４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｏｄｉ．１２７７０．㊀㊀［２２］ＪｉｎＨ，ＣｈｏｕｎｇＨＷ，ＬｉｍＫＴ，ｅｔａｌ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＰｌａｓｍｉｎｏ⁃ｇｅｎＡｃｔｉｖａｔｏｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒ⁃１ＰｒｏｍｏｔｅｓＣｅｍｅｎｔｏｇｅｎｉｃＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＡ，２０１５，２１（２３／２４）：２８１７⁃２８２８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｔｅｎ．ＴＥＡ．２０１４．０３９９．［２３］ＰｅｌａｅｚＤ，ＡｃｏｓｔａＴｏｒｒｅｓＺ，ＮｇＴＫ，ｅｔａｌ．Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｅｒ⁃ｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｄｙｎａｍｉｃｔｅｎｓｉｌｅｓｔｒａｉｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ，２０１７，３６７（２）：２２９⁃２４１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００４４１⁃０１６⁃２５０３⁃ｘ．［２４］ＬｅｅＪＳ，ＡｎＳＹ，ＫｗｏｎＩＫ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏ；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｌｉｎｅａｇｅ［Ｊ／ＯＬ］．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＦｕｎｃｔ，２０１４，３２（７）：６０５⁃６１１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｂｆ．３０５７．［２５］ＮｇＴＫ，ＹｕｎｇＪＳ，ＣｈｏｙＫＷ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｏ⁃ｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎ⁃ｌｉｋｅｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｇｎａｔｕｒｅ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１５，５：１６４２９［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ１６４２９．［２６］ＫｏｒｎｓｕｔｈｉｓｏｐｏｎＣ，ＰｉｒａｒａｔＮ，ＯｓａｔｈａｎｏｎＴ，ｅｔａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｌａｔｅｌｅｔ⁃ｒｉｃｈｆｉｂｒｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｃａｎｉｎｅｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０２０，１０（１）：１８５０［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８⁃０２０⁃５８７３２⁃ｘ．［２７］ＤｕａｎＸ，ＬｉｎＺ，ＬｉｎＸ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｆｐｌａｔｅｌｅｔ⁃ｒｉｃｈｆｉｂｒｉｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｒａｔｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｅｌＭｏｌＭｅｄ，２０１８，２２（２）：１０４７⁃１０５５［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｃｍｍ．１３４６１．［２８］ＡｍｍａｒＭＭ，ＷａｌｙＧＨ，ＳａｎｉｏｕｒＳＨ，ｅｔａｌ．Ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｌｅａｓｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｖｉａｂｉｌｉｔｙｂｙｆｒｅｅｚｅ⁃ｄｒｉｅｄｐｌａｔｅｌｅｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｌｏａｄｅｄｔｈｅｒｍｏ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｈｙｄｒｏｇｅｌｆｏｒｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＳａｕｄｉＤｅｎｔＪ，２０１８，３０（４）：３５５⁃３６４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｄｅｎｔｊ．２０１８．０６．００２．［２９］ＡçｉｌＹ，ＹａｎｇＦ，ＧｕｌｓｅｓＡ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａ⁃ｍｅｎｔｃｅｌｌｓａｎｄｄｅｎｔａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＢＭＰ⁃７ｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ／ＯＬ］．Ｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，２０１６，１０４（２）：１２３⁃１３５［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０２６６⁃０１５⁃０１９８⁃１．［３０］ＫａｎｇＷ，ＬｉａｎｇＱ，ＤｕＬ，ｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｂＦＧＦａｎｄＢＭＰ⁃２ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏ⁃ｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＲｅｓ，２０１９，５４（４）：４２４⁃４３４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｒｅ．１２６４４３４．㊀㊀［３１］ＹａｎＧＱ，ＷａｎｇＸ，ＹａｎｇＦ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ⁃２２ＰｒｏｍｏｔｅｄＯｓｔｅｏ⁃ｇｅｎｉｃＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｂｙＴａｒｇｅｔｉｎｇＨＤＡＣ６［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｅｌＢｉｏｃｈｅｍ，２０１７，１１８（７）：１６５３⁃１６５８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｃｂ．２５９３１．［３２］ＰｉｚｚｉｃａｎｎｅｌｌａＪ，ＣａｖａｌｃａｎｔｉＭ，ＴｒｕｂｉａｎｉＯ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ２１０ＭｅｄｉａｔｅｓＶＥＧＦＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎＨｕｍａｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＣｕｌｔｕｒｅｄｏｎ３ＤＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＣｅｒａｍｉｃＳｃａｆｆｏｌｄ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１８，１９（１２）：３９１６［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｉｊｍｓ１９１２３９１６．［３３］Ｋａｎｅｄａ⁃ＩｋｅｄａＥ，ＩｗａｔａＴ，ＭｉｚｕｎｏＮ，ｅｔａｌ．ＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａｍｉＲ⁃２９９⁃５ｐｉｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２０２０，１１２：４７⁃５７［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｄｉｆｆ．２０２０．０１．００１．［３４］ＧｅＹ，ＬｉＪ，ＨａｏＹ，ｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ⁃５４３ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｏｓｔｅｏ⁃ｇｅｎｅｓｉｓｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｏｆＥＲＢＢ２，２［Ｊ／ＯＬ］．ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＲｅｓ，２０１８，５３（５）：８３２⁃８４１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｒｅ．１２５７２．［３５］杜莉，曹伟靖，田莹，等．ＭｉｃｒｏＲＮＡ⁃１２５ｂ对人牙周膜干细胞成骨分化的影响［Ｊ］．上海口腔医学，２０１８，２７（１）：１１⁃１７．［３６］ＸｕＹ，ＲｅｎＣ，ＺｈａｏＸ，ｅｔａｌ．ｍｉｃｒｏＲＮＡ⁃１３２ｉｎｈｉｂｉｔｓｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｖｉａＧＤＦ５ａｎｄｔｈｅＮＦ⁃κＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＰａｔｈｏｌＲｅｓＰｒａｃｔ，２０１９，２１５（１２）：１５２７２２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｒｐ．２０１９．１５２７２２．［３７］ＧｕｏＪ，ＺｅｎｇＸ，ＭｉａｏＪ，ｅｔａｌ．ＭｉＲＮＡ⁃２１８ｒｅｇｕｌａｔｅｓｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｄｉｆ⁃ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓｒａｔｓｔｈｒｏｕｇｈＭｍｐ９［Ｊ／ＯＬ］．ＣｅｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１９，２１（４）：ｅ１２９７９［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｃｍｉ．１２９７９．［３８］ＬｉｕＺ，ＣｈｅｎＸ，ＺｈａｎｇＺ，ｅｔａｌ．ＮａｎｏｆｉｂｒｏｕｓＳｐｏｎｇｙＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓＴｏＤｉｓｔｉｎｃｔｌｙＲｅｌｅａｓｅｍｉＲＮＡａｎｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓＴｏＥｎｒｉｃｈＲｅｇｕ⁃ｌａｔｏｒｙＴＣｅｌｌｓａｎｄＲｅｓｃｕｅＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＢｏｎｅＬｏｓｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＡＣＳｎａｎｏ，２０１８，１２（１０）：９７８５⁃９７９９［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．７ｂ０８９７６．［３９］ＪｉａＬ，ＸｉｏｎｇＹ，ＺｈａｎｇＷ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｄａｍａｇｅｉｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｖｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｋｔ／Ｎｒｆ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ，２０２０，３８６（２）：１１１７１７［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２０１９．１１１７１７．［４０］ＰａｒｋＪＣ，ＫｉｍＪＭ，ＪｕｎｇＩＨ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ（ＰＤＬ）ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＰＤＬＳＣｓ）ｆｒｏｍｔｈｅｉｎｆｌａｍｅｄＰＤＬｔｉｓｓｕｅ：ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＣｌｉｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２０１１，３８（８）：７２１⁃７３１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１６００⁃０５１Ｘ．２０１１．０１７１６．ｘ．［４１］ＨｉｇｕｃｈｉＪ，ＦｏｒｔｕｎａｔｏＧ，Ｗｏｚ＇ｎｉａｋＢ，ｅｔａｌ．ＰｏｌｙｍｅｒＭｅｍｂｒａｎｅｓＳｏｎｏｃｏａｔｅｄａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｅｄｗｉｔｈＮａｎｏ⁃ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｆｏｒＰｅｒｉ⁃ｏｄｏｎｔａｌＴｉｓｓｕｅｓＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂａｓｅｌ），２０１９，９（１１）：１６２５［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｎａｎｏ９１１１６２５．［４２］ＷｉｊｅｄａｓａＮＰ，ＢｒｏａｓＳＭ，ＤａｓｏＲＥ，ｅｔａｌ．Ｖａｒｙｉｎｇｆｉｓｈｓｃａｌｅｄｅ⁃ｒｉｖｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｂｏｕｎｄｈｙｂｒｉｄｐｅｐｔｉｄｅｎａｎｏｆｉｂｅｒｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＭａｔｅｒＳｃｉＥｎｇＣＭａｔｅｒＢｉｏｌＡｐｐｌ，２０２０，１０９：１１０５４０［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｓｅｃ．２０１９．１１０５４０．［４３］ＯｕＱ，ＭｉａｏＹ，ＹａｎｇＦ，ｅｔａｌ．Ｚｅｉｎ／ｇｅｌａｔｉｎ／ｎａｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓａｒｅｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＢｉｏｍａｔｅｒＳｃｉ，２０１９，７（５）：１９７３⁃１９８３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｂｍ０１６５３ｄ．［４４］ＳｏｗｍｙａＳ，ＢｕｍｇａｒｄｅｎｅｒＪＤ，ＣｈｅｎｎａｚｈｉＫＰ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｎａｎｏ⁃ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓａｎｄｂｉｏｃｅｒａｍｉｃｓｉｎｅｎａｍｅｌ，ｄｅｎｔｉｎａｎｄｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＰｒｏｇＰｏｌｙｍＳｃｉ，２０１３，３８（１０／１１）：１７４８⁃１７７２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｒｏｇｐｏｌｙｍｓｃｉ．２０１３．０５．００５．［４５］ＳｃｕｌｅａｎＡ，ＮｉｋｏｌｉｄａｋｉｓＤ，ＮｉｋｏｕＧ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｐｒｏｍｏ⁃ｔｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｉｎｔｒａｂｏｎｙｄｅｆｅｃｔｓ：ａｓｙｓ⁃ｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗ［Ｊ／ＯＬ］．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ２０００，２０１５，６８（１）：１８２⁃２１６［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｐｒｄ．１２０８６．［４６］ＹａｎｇＦ，ＭｉａｏＹ，ＷａｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎＺｅｉｎ／ＧｅｌａｔｉｎＳｃａｆ⁃ｆｏｌｄ⁃ＥｎｈａｎｃｅｄＣｅｌｌＡｔｔａｃｈｍｅｎｔａｎｄＧｒｏｗｔｈｏｆＨｕｍａｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂａｓｅｌ），２０１７，１０（１０）：１１６８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｍａ１０１０１１６８．［４７］ＰａｎＪ，ＤｅｎｇＪ，ＹｕＬ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆａｌｖｅｏｌａｒｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔｓｂｙｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓ⁃ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＭａｔｅｒＳｃｉＭａｔｅｒＭｅｄ，２０１９，３１（１）：３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０８５６⁃０１９⁃６３３３⁃８．［４８］ＣｈｅｎＸ，ＢａｉＳ，ＬｉＢ，ｅｔａｌ．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ／ｎａ⁃ｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｍｉｃｒｏｇｅｌａｒｒａｙｓｆｏｒｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＪＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６，１１：４７０７⁃４７１８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１４７／ＩＪＮ．Ｓ１１１７０１．［４９］ＮｉｖｅｄｈｉｔｈａＳｕｎｄａｒａｍＭ，ＳｏｗｍｙａＳ，ｅｔａｌ．Ｂｉｌａｙｅｒｅｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｌｖｅｏｌａｒｂｏｎｅａｎｄｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＢｉｏｍｅｄＭａｔｅｒＲｅｓＢＡｐｐｌＢｉｏｍａｔｅｒ，２０１６，１０４（４）：７６１⁃７７０［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｂｍ．ｂ．３３４８０．［５０］ＬｉＹ，ＱｉａｏＺ，ＹｕＦ，ｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ⁃β３／Ｃｈｉ⁃ｔｏｓａｎＳｐｏｎｇｅ（ＴＧＦ⁃β３／ＣＳ）ＦａｃｉｌｉｔａｔｅｓＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１９，２０（２０）：４９８２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｉｊｍｓ２０２０４９８２．［５１］ＳｈｕＹ，ＹｕＹ，ＺｈａｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｆｓｕｌ⁃ｆａｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｉｎＢＭＰ⁃２⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｂｏｎｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．Ｂｉｏ⁃ｍａｔｅｒＳｃｉ，２０１８，６（９）：２４９６⁃２５０７［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ８ｂｍ００７０１ｂ．［５２］ＬｉＹ，ＹｕＦ，ＬｉｕＹ，ｅｔａｌ．Ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｌｌｅ⁃ｖｉａｔｅｓｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｏｎｏｓ⁃ｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２０２０，９１（７）：９７５⁃９８５［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ＪＰＥＲ．１９⁃０２７３．［５３］ＧｅＳ，ＺｈａｏＮ，ＷａｎｇＬ，ｅｔａｌ．Ｂｏｎｅｒｅｐａｉｒｂｙｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｅｄｅｄｎａｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ⁃ｃｈｉｔｏｓａｎｓｃａｆｆｏｌｄ［Ｊ／ＯＬ］．ＩｎｔＪＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，７：５４０５⁃５４１４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１４７／ＩＪＮ．Ｓ３６７１４．［５４］ＢａｂｒａｗａｌａＩ，ＭｕｎｉｖｅｎｋａｔａｐｐａＬａｋｓｈｍａｉａｈＶｅｎｋａｔｅｓｈＰ，Ｂａｎｇａｌ⁃ｏｒｅＶａｒａｄｈａｎＫ．Ａｎｏｖｅｌａｐｐｒｏａｃｈｕｓｉｎｇ１５％ｎａｔｕｒａｌｃｈｉｔｏｓａｎｇｅｌｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｉｎｔｒａｂｏｎｙｄｅｆｅｃｔｓ：ａｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙ［Ｊ／ＯＬ］．ＣｈｉｎＪＤｅｎｔＲｅｓ，２０１６，１９（４）：２３１⁃２３７［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３２９０／ｊ．ｃｊｄｒ．ａ３７１４８．［５５］ＺａｎｇＳ，ＤｏｎｇＧ，ＰｅｎｇＢ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｈｙｄｒｏｇｅｌａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｉｎａｃａｎｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＰｏｌｙｍ，２０１４，１１３：２４０⁃２４８［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｂｐｏｌ．２０１４．０７．０１８．［５６］ＩｗａｓａｋｉＫ，ＫｏｍａｋｉＭ，ＹｏｋｏｙａｍａＮ，ｅｔａｌ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａ⁃ｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ⁃ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄａｍｎｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＡ，２０１４，２０（３／４）：６９３⁃７０４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｔｅｎ．ＴＥＡ．２０１３．００１７．［５７］ＮｕñｅｚＪ，ＶｉｇｎｏｌｅｔｔｉＦ，ＣａｆｆｅｓｓｅＲＧ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙｉｎｐｅｒ⁃ｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ／ＯＬ］．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ２０００，２０１９，７９（１）：１０７⁃１１６［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｐｒｄ．１２２５０．［５８］ＣｈｅｎＦＭ，ＧａｏＬＮ，ＴｉａｎＢＭ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｉｎ⁃ｔｒａｂｏｎｙｄｅｆｅｃｔｓｕｓｉｎｇａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ，２０１６，７：３３［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３２８７⁃０１６⁃０２８８⁃１．［５９］ＳｈａｌｉｎｉＨＳ，ＶａｎｄａｎａＫＬ．Ｄｉｒｅｃｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎ⁃ｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｏｓｓｅｏｕｓｄｅ⁃ｆｅｃｔｓ：Ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ［Ｊ／ＯＬ］．ＪＩｎｄｉａｎＳｏｃＰｅｒｉｏｄ⁃ｏｎｔｏｌ，２０１８，２２（６）：５０３⁃５１２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１０３／ｊｉｓｐ．ｊｉｓｐ＿９２＿１８．［６０］ＩｗａｔａＴ，ＹａｍａｔｏＭ，ＷａｓｈｉｏＫ，ｅｔａｌ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｓｈｅｅｔｓ⁃Ａｓａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｓｔｕｄｙｉｎｔｅｎｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＲｅｇｅｎＴｈｅｒ，２０１８，９：３８⁃４４［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｒｅｔｈ．２０１８．０７．００２．㊀㊀㊀［６１］ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＴａｎａｂｅＫ，ＯｈｎｕｋｉＭ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｄｕｌｔｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｂｙｄｅｆｉｎｅｄｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ／ＯＬ］．Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）：８６１⁃８７２［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９．［６２］ＨａｍａｎｏＳ，ＴｏｍｏｋｉｙｏＡ，ＨａｓｅｇａｗａＤ，ｅｔａｌ．ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘｆｒｏｍＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＣｅｌｌｓＣｏｕｌｄＩｎｄｕｃｅｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｔｏＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌ⁃ＬｉｋｅＣｅｌｌｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ，２０１８，２７（２）：１００⁃１１１［２０２０⁃０２⁃２２］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１７．００７７．（收稿日期：２０２０－０２－２２）（本文编辑：曹灵）。
牙周膜干细胞鉴定的研究进展
高潜 能 向成 骨 分 化 能 力 的 标 志 。同 样 关 键 的 成 骨 基 因
Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ 、 Ａ Ｌ Ｐ 、 Ｃ ｏ ｌ ｌ Ａ ２ 、 Ｂ Ｇ Ｎ和 Ｏ Ｃ Ｎ的表达 与 Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ形 成 矿
化基质的能力是一致的 ， 因此也 可以作 为 Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ 成骨分 化和矿化能力 的特殊标记 。
细胞与基质问的接触调节 ， 随后刺 激干细胞 向成 骨分化 ， 同
时也显著影响干细胞 向 目标 位点 的迁 移 。Ｔ ｗＩ ｓ Ｔ 一 １是一
间充质 干细 胞 （ Ｂ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ ） 、 脐 带 血 干细 胞 （ ｗＪ Ｃ ＭＳ Ｃ ｓ ） 相 比，
Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ 具有更强的增殖潜 能 ， 其表现在更长的生存期 、 更高
和Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ４ 会逐渐消失 。Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ． １可 以作为长 期存 活胚 胎 干 细胞形态稳定的一个标志 ， 因此它也可 以作 为 Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ 形态 稳定 的 一 个 标 志。 由 于 Ｓ Ｓ Ｅ Ａ￣ 在 Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ的 表 达 要 比 Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ￣更稳定一些 ， 因此可以将 Ｓ Ｓ Ｅ Ａ － ４作为从 牙周膜 中分 离Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ的一个标志 ’ 。Ｏ Ｃ Ｔ － ４是一 种关键 的胚胎干 细
现Ｓ Ｔ Ｒ Ｏ 一 １ ， 这跟后来 Ｎ ｏ ｒ ｉ ａ ｋ ｉ 等 刮发现表达 Ｓ Ｔ Ｒ Ｏ ． １阳性 的
牙周膜细 胞 的潜 能 有 一 定 的 限 制 是 一 致 的。Ｎ ｏ ｒ ｉ ａ ｋ ｉ 和
了类似于神经球的干细胞球 ， 并 表达 神经 嵴来 源细胞的标志
基因Ｔ ｗ ｉ ｓ ｔ ， Ｓ ｌ ｕ ｇ ， Ｓ ｏ ｘ ２和 Ｓ ｏ ｘ ９ ， 而且可 以分 化为神 经元样 、 胶 质样 、 少突胶质细 胞样 细胞 和肌 管。Ｔ ｏ ｍ ｏ ｋ ｉ ｙ ｏ等” 发 现表 达神经嵴 干细 胞表 型 Ｓ ｌ ｕ ｇ ， Ｓ ｏ ｘ ｌ ０ ， Ｎ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ， ｐ ７ ５ Ｎ Ｔ Ｒ和 Ｃ Ｄ ４ ９ ｄ 的Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｃ ｓ 可
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
大鼠牙周膜干细胞处理方法
大鼠牙周膜干细胞处理方法大鼠牙周膜干细胞处理方法及细胞说明书仅供参考，具体操作还需要根据到货时细胞密度，细胞生长状态等具体情况，酌情处理。
一．大鼠牙周膜干细胞贴壁细胞客户接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。
肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X 各一张）。
显微镜观察细胞，当细胞融汇80%左右（可以传代的情况下），细胞应该在37度培养箱预温1-2h后再做处理。
如未达到细胞传代密度，培养瓶应预留一部分培养基继续培养。
严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
用PBS2-3ml/次轻轻洗细胞表面，加入适量的0.05%胰酶-EDTA消化细胞,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
1000rpm,5min离心，重悬细胞。
换新的细胞培养瓶，37℃,5%CO2培养。
二．大鼠牙周膜干细胞悬浮细胞1.接收到细胞，用75%的酒精消毒（建议配制75%酒精的水是灭菌过的）培养瓶外部。
2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管完全吸出（严禁直接倾倒）。
5.1000rpm,5min离心，重悬细胞。
换新的细胞培养瓶和新鲜培养基，37℃,5%CO2培养。
牙周膜干细胞的培养方法
• 当原代细胞生长达80%汇合时，弃原培养液， 用 PBS洗涤细胞 2 遍，消化，制备成单细胞 悬液；
• α-MEM 培养基倍比稀释，调整细胞密度至 10-15 个/mL，吹打均匀。将稀释好的细胞 悬液分别接种于 96 孔板中，每孔加0.1mL， 培养过夜。
• 次日，在倒置显微镜下观察培养板各孔的 细胞数，挑选只含有一个细胞的孔，做标 记，并补加培养液 0.1mL，继续培养。3天 更换培养液一次；
• 到孔中形成较大克隆达孔底面积的 1/3-1/2 时，消化单克隆细胞，将多个单克隆来源 的细胞悬液混合， 形成多克隆PDLSCs， 体 外扩大继续培养；
低密度多克隆法培养PDLSCs
• 组织块法培养原代PDLSCs；待原代长满至 80%时，消化细胞，过筛网，制备成单细胞 悬液后，按照每800-1000个细胞接种一个大 瓶继续培养；
• 酶消化法培养原代PDLSCs，消化后直接过筛 网，接种10cm培养皿或者大瓶。
检测指标
• STRO-1和CD146
• CD29，CD105，CD106，CD90，CD44 • CD31，CD34，CD14，
基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用[发明专利]
![基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2c97ca8464ce0508763231126edb6f1afe007173.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011418103.1(22)申请日 2020.12.07(71)申请人 上海交通大学医学院附属第九人民医院地址 200011 上海市黄浦区制造局路639号(72)发明人 江凌勇 代庆刚 徐弘远 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限公司 31253代理人 周琼(51)Int.Cl.C12Q 1/6869(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)A61K 35/32(2015.01)A61P 1/02(2006.01)(54)发明名称基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法及其应用，筛选到的新亚群特异性表达FBLN2及膜蛋白CADM3，同时公开了牙周膜特异性干细胞新亚群用于制备牙周病治疗的药物的应用。
本发明通过单细胞测序、获得牙周膜特异性干细胞亚群，并通过标记基因进行体外流式分选及细胞亚群性能的验证；本发明筛选的细胞亚群利于寻找牙周稳态失衡的干预靶点，为新药物的开发创造可能；以牙周膜特异性干细胞为种子细胞形成类器官，为医疗器械新材料的研究和验证提供科学依据；进一步探索牙周膜干细胞自体/异体移植可行性，为治疗牙周病提供重塑新思路。
权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 112481364 A 2021.03.12C N 112481364A1.基于单细胞测序筛选牙周膜特异性干细胞新亚群的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.获取因正畸需要拔除的健康前磨牙；b.制备牙周膜组织的单细胞悬液；c.通过细胞染色对单细胞悬液样品质量进行检测；d.单细胞转录组测序分析；e.生物信息拟时序分析发现牙周膜干细胞可能新亚群，明确该可能新亚群的高特异性，高灵敏度标志基因；f.体外根据标志基因分选人牙周膜亚群，体外培养，并验证其干性；g.构建候选群体的标记基因启动子所驱动的CreER小鼠进行谱系示踪及细胞剔除验证；h.利用步骤g构建的小鼠模型进行体内验证。
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[文章编号] 1674-8603(2016)01-0054-03大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养及应用的研究进展刘 努1,李 萌2,赵 盼2,刘 琪1*(1.遵义医学院附属口腔医院牙周科,贵州遵义563003;2.第四军医大学口腔医院组织工程研究中心,军事口腔医学国家重点实验室,陕西西安710032)[摘要] 大鼠牙周膜干细胞的分离㊁培养方法与人牙周膜干细胞有着不同之处,分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞存在磨牙小㊁牙周膜组织来源少以及拔牙困难等难点㊂然而,在基础研究中,大鼠牙周炎模型的建立应用广泛,分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞用以探讨牙周炎致病机制,明确机体内环境改变是否通过影响牙周膜干细胞的生物学性能导致牙周组织破坏严重与修复困难具有重要作用;另一方面,大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养方法建立后,可以尝试从干细胞水平为治疗牙周病与促进牙周组织再生提供可靠的理论依据㊂因此,综述分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞的可行方法有着十分重要的意义,有十分可观的应用前景㊂[关键词] 牙周膜干细胞;牙周炎;大鼠[中图分类号] R780.2 [文献标识码] A [doi ] 10.3969/j.issn.1674-8603.2016.01.013基金项目:国家自然科学基金资助项目(81360168)*通信作者:刘 琪 Email:liuqi1964@牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周组织工程与口腔再生医学中一种重要的种子细胞[1]㊂目前国内外对人PDLSCs 的培养方法已经成熟,主要采用人第三磨牙或正畸患者拔除的前磨牙的牙周膜组织,进行体外分离㊁培养的方式而获得[1-3]㊂由于受到临床取材数量以及医学伦理等方面的限制,无法有效㊁快速㊁大量的获取人PDLSCs 已成为限制口腔再生医学和相关基础研究进程的瓶颈㊂大鼠牙周疾病模型应用广泛,探索分离㊁培养大鼠PDLSCs 的技术,并在此基础上鉴定大鼠PDLSCs 的生物学性能,将为进一步的机理性实验与应用性研究奠定基础㊂本综述就大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法,细胞的生物学性能,以及应用前景做一回顾总结㊂1 大鼠PDLSCs 分离㊁培养大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法远不及人PDLSCs 方便㊁简单㊂最初的研究尝试利用大鼠的磨牙培养PDLSCs,然而大鼠磨牙甚小㊁牙周膜组织少,且拔牙较为困难,使得获取大鼠磨牙的牙周组织成为挑战[4-6]㊂此外,鼠类属于低等哺乳类动物㊂研究表明,低等动物组织细胞的分离㊁培养过程中,细胞不易存活,且状态不佳[7]㊂因此,鼠类PDLSCs 的分离㊁培养较为困难,大鼠PDLSCs 培养过程中对获取的牙周膜组织要求更严格㊁培养条件要求极高㊂近年来,学者提出大鼠门齿相比于大鼠磨牙存在诸多优势:数目较多(4个),体积较大,牙周膜面积大,能获取牙周膜组织较多;大鼠的门齿不断生长,咀嚼行为能刺激牙周膜组织的再生,获取的PDLSCs 的活性可能较好㊂利用大鼠门齿来获取大鼠PDLSCs 成为热点探讨的方法[8-9]㊂当前,利用门齿进行大鼠PDLSCs 的分离㊁培养步骤可归纳如下:拔取年轻大鼠的4个门齿(要求门齿无牙周疾病㊁拔除门齿需完整以及去除牙龈牙槽骨等其他软硬组织),立即置于含3%胎牛血清的无菌PBS 缓冲液中;用无菌拔髓针除尽牙髓组织,并用PBS 反复冲洗髓腔与根面,直至冲洗后的液体清亮为止;刮取门齿根中1/3的牙周膜组织并修剪成1mm 3大小的组织块,使用0.3%Ⅰ型胶原酶与Dispase 酶等量混合在37ħ培养箱中消化60min (每15min 震荡一次);加入等量的含血清培养液终止消化,1000r /min 离心5min,弃上清液;少量培养液重悬组织后,均匀致密铺板于直径较小的培养皿中,加入含有15%胎牛血清的α-MEM 培养液,置于37ħ㊁5%CO 2培养箱中培养㊂隔日观察,3天换液,等待细胞长至皿底面积的80%时进行消化和传代[8-9]㊂这种大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法的主要特点可总结如下:首先,大鼠磨牙小㊁拔牙困难,则采取拔取大鼠门齿的方法,多个门齿的牙周膜组织共同分离㊁消化后同时置于小型无菌塑料培养皿中,利用组织密集性来获取原代PDLSCs;其次,由于门齿的根端呈开放型,为了保证细胞的纯度和活力,需去净牙髓组织再分离牙周膜组织,消化后大鼠牙周膜组织铺板时需具有致密性;最后,大鼠牙周膜组织的消㊃45㊃口腔生物医学2016年3月(第7卷第1期) Oral Biomedicine,Vol.7,No.1,Mar.2016化体系为Ⅰ型胶原酶与Dispase酶的等量混合液,消化时间在人PDLSCs的分离基础上需适当延长,选择使用塑料器皿使之有利于PDLSCs的贴壁生长[8-9]㊂2 大鼠PDLSCs的生物学特性分析使用上述方法分离㊁培养的大鼠PDLSCs与人PDLSCs形态相似:大多数细胞呈现梭形,少数为带刺突或触角的不规则形,细胞胞体较小㊁包浆丰满,种系来源之间无明显差异[10]㊂大鼠PDLSCs与人PDLSCs和大鼠骨髓来源间充质干细胞(bone mar-row mesenchymal stem cells,BMMSCs)功能相近:具备不断增殖更新以及多向分化的潜能,并且具有间充质干细胞干性的生物学特征[10-11]㊂相对来讲,大鼠PDLSCs的增殖能力较人PDLSCs稍弱㊂大鼠PDLSCs不仅在体外能够增殖和成骨㊁成脂分化,而且在体内可再生出类骨组织或牙骨质/牙周膜样组织[8-9]㊂因此,大鼠PDLSCs在大鼠单纯牙周炎以及系统性疾病伴牙周炎的治疗应用中很可能再生牙周组织并修复牙周组织缺损㊂3 大鼠PDLSCs的应用前景牙周病病因的复杂性㊁病理过程的反复性以及临床治愈的困难性一直是研究难点和关注焦点㊂人PDLSCs的发现,为基于成体干细胞治疗牙周组织缺损提供了一个全新的方法,使牙周组织再生进入了一个新的时期㊂尽管如此,复杂的牙周病发病机理仍然不甚清晰,人PDLSCs的研究受伦理以及机体内环境的改变等多方面条件制约而受限㊂为此,分离㊁培养大鼠PDLSCs的意义十分重大㊂3.1 在牙周病机理研究中的应用流行病学调查结果显示,牙周病在我国人群中患病率高于70%,并有逐年上升的趋势[12]㊂近年来临床和基础研究资料表明,牙周病与全身健康和疾病有着双向的密切关联[13-16]㊂研究表明,牙周病与糖尿病之间存在着越来越多的共同危险因素,且互为高危因素[17-19]㊂精神压力也是牙周病发生及发展的重要危险因素[12,20-21]㊂此外,牙周病与骨质疏松症有一些共同的危险因素等[22-23]㊂然而,牙周病与全身各种疾病的相关基础研究与发病机理仍缺乏相关实验研究,当前利用干细胞治疗恢复牙周组织缺损的远期效果尚难以确定,其中取材受限是导致体内实验研究证据不足的主要原因之一㊂因此,从细胞㊁基因与蛋白水平更深入地探索系统性疾病与牙周病的相互作用机制成为一种挑战,基于大鼠PDLSCs分离㊁培养的基础研究成为了临床应用必不可少的环节㊂从门齿进行大鼠PDLSCs 的分离㊁培养为后续的一系列基础实验性及应用性研究奠定了基础,使得模拟人类疾病(如糖尿病伴牙周炎㊁骨质疏松症和抑郁伴牙周病等)和后续的细胞学实验在动物模型上成为了可能㊂此外,大鼠PDLSCs也为基础性研究中提供疾病来源和基因干预的PDLSCs提供了可能㊂3.2 在牙周组织再生中的应用利用人PDLSCs的多向分化能力以及体内再生能力的特性,将人PDLSCs作为种子细胞用于组织修复和细胞治疗的研究已经成为当前研究的热点㊂为了适应基础性研究㊁减少科研成本以及降低免疫排斥反应等,科研工作者们已从鼠类分离㊁培养了多种间充质干细胞,其中以BMMSCs应用最为广泛[24-25]㊂然而,在牙周组织再生中,BMMSCs并不能替代PDLSCs㊂Akizuki等[26]学者将BMMSCs和PDLSCs细胞膜片移植入大鼠或比格犬的牙周组织缺损处,6周后取材结果表明,虽然BMMSCs细胞膜片形成的骨样硬组织多于PDLSCs,但是BMMSCs形成骨样组织不能将软硬组织与牙齿联为一个整体,而只有PDLSCs形成的细胞膜片植入牙周缺损后,能形成牙周附着这种独特的组织结构㊂Dan等[27]和Hasegawa等[28]研究结果也显示,PDLSCs再生形成复杂的牙周膜样组织的能力显著高于其他组织来源的干细胞㊂因此,大鼠PDLSCs将会成为牙周组织工程与再生医学的重要种子细胞,分离㊁培养得到的大鼠PDLSCs有着不可替代的作用㊂4 总结与展望综上所述,通过分离大鼠门齿牙周膜组织,可成功获取㊁培养大鼠PDLSCs,并具有良好的再生应用相关的生物学特性㊂尽管分离㊁培养大鼠PDLSCs 过程较复杂,但是获取的大鼠PDLSCs有着重要的意义:从临床疾病发病的角度来分析,可进一步探索机体内环境的变化如何介导PDLSCs功能变化来影响牙周组织的损伤与再生;从牙周组织再生的角度来研究,大鼠PDLSCs是研究牙周病中牙周缺损和再生的合适种子细胞㊂大鼠PDLSCs的妥善分离㊁培养将给予基础和临床研究以新的希望㊂[参考文献][1] Seo BM,Miura M,Gronthos S,et al.Investigation of multipotentpostnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet, 2004,364(9429):149-155.㊃55㊃刘努,等.大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养及应用的研究进展[2] Gao LN,An Y,Lei M,et al.The effect of the coumarin-like deriva-tive osthole on the osteogenic properties of human periodontal liga-ment and jaw bone marrow mesenchymal stem cell sheets[J].Bio-materials,2013,34(38):9937-9951.[3] 崔晓霞,杨琨,伍燕,等.糖基化终末产物介导的牙周膜干细胞成骨分化过程中Wnt经典信号通路相关作用机制的研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2013,23(9):564-568. 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