疟疾培训班

3. 疟色素
不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而 异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶 性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；三日疟原 虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与 间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集 成团块。
被寄生的红细胞 被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。 疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏点 (Schuffner's dots)。 被恶性疟原虫寄生的红 细胞大小正常或稍微缩小，红细胞上有时见到茂 氏点(Maurer's dots)。
2.采血的部位和方法 以耳垂采血较为合适，也可在手指末端采血。 先用75%酒精棉球消毒采血部位，待酒精干后，左 手拇指和食指紧捏采血部位，右手持一次性采血 针迅速刺入采血部位1～2mm深，然后用左手拇指 和食指和右手中指协同挤出血滴。
3.涂制血膜
取玻片2张，1张作载片，1张作推片用右手拇 指和食指夹持推片侧缘中部。用推片的左下角刮 取血液4 ～ 5μl，再用该端中部刮取血液1 ～ 1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处， 由里向外划圈涂成直径为0.8～1cm的圆形厚血膜。 用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵 载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两 侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25 ～ 35角， 从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，薄血膜厚度 应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。薄 血膜长度约2.5cm为佳.
2.编号 编号可根据实际操作进行。号码必须不易脱 落，最好是血片自然干燥后用铅笔在薄血膜上编 号，并表明姓名、日期。 3.血片制作 4.制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购 臵之标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱除。 5.血片放臵待干时不可倾斜，否则厚血膜中 血细 胞沉在一边，可使厚薄不匀。 6.防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。
疟疾实验室检测技术培训
2011年10月21日
疟疾全球分布
（一）全球疟疾分布
全球109个国家有疟疾流行，撒哈拉以南非洲是 疟疾传播最严重的地区。在非洲之外的国家，疟疾 感染率一般低于5％ 全球约33亿人口受到疟疾威胁，每年约有5亿人 感染疟疾，其中有100万人因此死亡。
全球疟疾分布图
（二）全球遏制疟疾行动
二、当前我国疟疾疫情形势 及消除疟疾行动
（一）当前我国疟疾疫情形势 1.全国疟疾疫情总体呈下降趋势，但各 省疫情发展趋势不一。 2008年全国报告疟疾26 478例，除青海省 外各省均有病例报告，报告病例集中在安徽、 河南、海南、贵州、湖北、江苏、和浙江7 省，占全国报告病例数的82.3%，其中恶性疟 报告1 015例，云南省最多为672例，占全部病 例的66.2%，其次为江苏（59例）例和四川 （42例）。
(2)瑞氏染色法 在薄血膜上滴加6~7滴瑞氏染液，轻轻摇动玻 片，使染液在血膜上展开30秒钟，加蒸馏水或缓 冲液10~12滴，摇动玻片，使染液与水充分混合， 并将染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色5分 钟，然后用蒸馏水或缓冲液将血膜冲洗干净，晾 干后检查。
4. 影响血膜染色质量的因素
血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜 制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素 有关:
(1) 染料和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油 如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色 效果。因此Байду номын сангаас必须用分析纯的甲醇和中性甘油， 配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应 先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是 否理想，否则需重新制备染液。
(2) 染液的新旧：新配制的染液，一般染色力 较弱，且常呈碱性。染液放臵时间稍长，染色力 逐渐增加，故应在染色前1~2周先将染液制备好。 盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。 (3) 染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快， 各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著； 染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色 均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色 分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后， 一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效 果。
(二) 血膜的染色
1. 染色液的制备 目前常用的血膜染剂有吉 氏和瑞氏两种。吉氏染液染色效果稳定，染色时 间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血 膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不 变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。瑞氏染 色法因操作简便，常用于个别血片染色。
(1)吉氏染液： 吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。 将吉氏粉臵于研钵中，加入少量甘油充分研 磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入 500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲 醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇， 洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞 紧瓶塞，充分摇匀，室温内放臵，每天用力 摇动溶液5分钟，3天后即可使用。
人体疟原虫的基本构造
疟原虫基本构造 细胞浆（胞浆）、核和疟色 素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大， 细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到大滋养体阶 段，胞浆呈阿米巴样活动，胞浆内有空泡。
2. 核
即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红 色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只 有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配 子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗 红或紫红色。
Plasmodium vivax
环状体期 疟原虫胞浆 疟原虫核
Plasmodium vivax
大滋养体期 空泡 核 胞浆 色素 早期裂殖体期
间日疟早期滋养体--环状体
约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2 个环状体和一个环状体有2个核。
间日疟滋养体-大滋养体
红细胞：胀大褪色，出现形状大小相等，分布均 匀，数目较多，鲜红色薛氏小点。 大小：较大。 胞浆：不规则，浅兰色，出现阿米巴伪足，有空泡。 核： 红色，一个。 色素：细小杆状，黄褐色，分布不均匀。
世卫组织已经把遏制疟疾列为21世纪前 10年的首要医学问题。 2008年9月25日联合国峰会的世界领导发 起了一个全球疟疾行动计划（Global Malaria Action Plan)，力图大幅增加防治 疟疾的资源，争取在2015年之前避免400多 万人被这一可以预防和治疗的疾病夺走生命。 全面控制疟疾的目标在2009年需要53亿 美元，2010年需要62亿美元，此后到2020年 之前每年需51亿美元，但防治措施的花费比 起疟疾造成的损失来讲微不足道，仅非洲每 年因疟疾而蒙受的直接损失就高达120亿美 元，这还不包括更多的国内生产总值的损失。
（2）恶性疟原虫 从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖是在内 脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者 的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此， 一般在受染者的末稍血液中，随时能见到少数恶 性疟原虫的环状滋养体， 较理想的取血时间，是在发作后的20小时左右， 因为这个时候，环状滋养体虽已发育至最高峰， 但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。 环状体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴 别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时， 一般需要在发作八日后才能在末稍血液中出现， 应当注意。
湖南省近10年疟疾发病情况
2000-2010年3月湖南省疟疾发病数 250 200 发病数 P.v P.f
病例数
150 100 50 0
20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 20 06 20 07 20 08 20 09 20 10
年
疟疾血检对象 “三热病人” 临床诊断为疟疾 疑似疟疾 不明原因发热病 非洲东南亚国家 等疟疾流行区入 境人员和疟疾流行区回来发热人 员为重点血检对象
(4) 染色时间：染色时间长，染色效果好，反 之则差。染色时间长短与温度有关，温度高着色 快，故染色时间可适当缩短，温度低染色慢，则 时间可适当延长。所以染色时间长短要随着染液 的质量、新旧、浓度及温度而决定。 (5) 稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色好， 应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用 pH7.0~7.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的 缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液 冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。 (6) 冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉， 应将玻片连同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片 及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗， 以免染液色素颗粒沾污血膜。
(1)吉氏染色法
成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸 中，或背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏 染液(2ml吉氏原液同98ml蒸馏水或缓冲液混匀）， 浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入 缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的 浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水， 反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片 板上干燥。
一、疟疾实验室检测技术
目前，用于疟疾诊断的实验室检测包括病原 学检查、免疫学检测和分子生物学检测等3类。 （一）病原学检测 检出疟疾的病原体─疟原虫，是确诊的疟疾 最直接证据。目前常用的有厚、薄血膜法，由于 具有操作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等优点， 病原学检测用于疟疾诊断已近一个世纪，且仍是 目前最常用的方法之一。
（三）注意事项 1、采血时间 在临床诊断疟疾患者时，应考虑在什么时 候取血较为适宜，尤在确定不下虫种和查不到疟 原虫的疑似疟疾患者的情况下极为重要。
（1）间日疟原虫 在患者刚发冷发热以后，大部是在环状滋养体 期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。虽 在—般情况下，任何时间检查感染者的末稍血液， 多少能查到各个时期的原虫。 一般是在患者发作数小时至十余小时，即滋养 体已经发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期。
血涂片制作
1.所需设备 （1）载玻片：新载玻片应先浸入含洗 涤剂的清水中10～20分钟，然后用干净棉 毛巾逐片擦拭，再用清水冲洗干净，晒干， 最后用干净柔软棉毛巾将玻片擦亮。最好 将洗净的浸泡在 95%的酒精中5～10分钟， 再将玻片擦干擦亮。
洗净的玻片每10 ～20张用干净的白纸包好放 入塑料袋内，保存于干燥环境中备有。 （2）采血针：使用一次性采血针。 （3）玻片盒：防污染、防苍蝇。 （4）75％酒精棉球： （5）记号笔：