Western blot 实验技术 讲义抗体大王分享
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
western blot实验经验总结
western blot实验经验总结1.抗体的选择对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。
原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。
在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。
Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。
我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。
具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。
揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。
western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。
我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。
效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。
western blot实验技术要点
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
E
转印时间控制
凝胶不能扭曲
B
C 正负极方向问题
D
气泡问题
封闭
封闭目的 封闭试剂 封闭条件
02 Part Two SDS-PAGE电泳
基本原理
低
高
电
电
压
压
A 浓缩
B 分离
低浓度胶
高浓度胶
A
电荷 量
B
分子 量
电泳技术要点
蛋白分子量
选择合适浓 度的分离胶
样品混匀 浓缩胶足够 目的带之间分开
上样要求 浓缩与分离
试剂的纯度 缓冲液 气泡
影响电泳的 因素
胶浓度的选择
凝胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
低温、快速操作
解
避免反复冻融
03
蛋白处理至关重要
保证浓度足够高
01
调
（细胞、裂解液的量）
浓
02
浓度测量要准
（混匀、稀释、复孔）
度
浓度调一致
03
最佳上样量经验总结
1.5mm玻璃板、10孔梳子，上样量：15-25μl 1.0mm玻璃板、10孔梳子，上样量：10-20μl 上样尽可能不超出每孔总体积的一半 内参10ug左右，即可清晰显出
《westernblot讲解》PPT课件
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精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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图像分析
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将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
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注释
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SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
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仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
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样品制备
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样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
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试剂及仪器准备
western blot技术 ppt课件
•
PPT课件
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实验步骤
• 一抗杂交孵育 将一抗用含5%脱脂奶粉的 1×TBST溶液稀释，使抗体浓度为1:1000；将封 闭过的膜放在一抗稀释液中，4度过夜；而后吸 弃一抗稀释液，用1×TBST洗3次，每次5min。 二抗孵育 二抗杂交孵育：将辣根过氧化物酶连接的二抗 用含5%脱脂奶粉的1×TBST溶液稀释，使浓度为 1:2000，并加入辣根过氧化物酶连接的抗生物 素抗体（浓度为1:1000），将膜置于二抗稀释 液中，室温振荡孵育1h；而后吸弃二抗稀释液， 用1×TBST洗3次，每次5min。
PPT课件
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仪器与设备
• • • • • • 低温超速离心机（Eppendorf公司） 分光光度计（Eppendorf公司） Thermomixer（Eppendorf公司） 电泳仪（Bio-Rad 公司） 垂直式电泳槽（Bio-Rad 公司） 硝酸纤维素膜电转系统（Bio-Rad 公司）
PPT课件
Western-blot 试验技术
PPT课件
1
概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。 • 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 • 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学 的研究。
主要试剂
• • • • • • • • • • • • RIPA（华舜公司） 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） 丙烯酰胺（Amresco公司） 双丙烯酰胺（Amresco公司） 丽春红染料（华舜公司） Tween 20（Amresco公司） 过硫酸铵（Sigma公司） 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） 硝酸纤维素膜（Amersham公司） 考马斯亮兰（Fluka公司） 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling Technology公司）
Takara实验技能讲座之Westernblot
•将转膜后的膜放置在保鲜膜上，将检测试剂滴加在膜上，确保试剂均匀覆盖在膜上。 •因目的蛋白的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，因此要进行预研讨 实验。 在发光持续时间内可改变胶片曝光条件进行多次检测。
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相关产品—化学发光
产品名称
Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate
蛋白酶抑制剂
ProteoGuard™ EDTA-Free Protease Inhibitor Cocktail
635672
Calpain竞争性抑制剂
Calpastatin
7316
5
蛋白纯化
组氨酸标签融合蛋白质的纯化
✓ 高特异性的Co2+树脂：TALON系列
✓ 高产量的Ni2+树脂：His60 Ni系列
交叉反应。
• 可抑制背景，能够明确地检测出抗原。
Western BLoT Blocking Buffer (Protein Free） • 不含蛋白质（Protein Free）的化学成分封闭缓冲液。 • 同一般的脱脂奶粉相比，可提高检测灵敏度。 • 有效地用于检测磷酸化蛋白质。
1118888
T7132A
9172 9173
Ø 预染Marker与非预染Marker
CLEARLY Stained Protein Ladder
3454A
CLEARLY Protein Ladder (Unstained) 3453A
Ø 电泳缓冲液
Tris-Glycine-SDS Buffer (TG-SDS) Powder, pH8.3
pH7.6
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
Western blot 实验原理和实验步骤 PPT
1
Western blot 基本原理
蛋白免疫印迹的组成
Western blot 一般流程
Western blot 常见问题分析
Western Blot基本原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质
样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可
滤纸，擀几下盖上阴极盖子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。
（5） 将盒子放入转膜槽中，转膜时会产热，打开电源，设置mA 和时间转
膜时间。
转膜条件
11
ห้องสมุดไป่ตู้
推荐：25V，1.0A，25min。（适合本实验室半干转移条件）
转膜注意事项： 滤纸、胶、膜之间不能有气泡产生 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润
以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如
5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质
1
才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合 的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过
小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的左上角作为
标记。如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可
以分出膜的正反和加样顺序。
注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
Western-Blot-实验技术
（三） 凝胶 电泳
4.染色
SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色
（四） 转膜
原理：
蛋白因结合SDS 而带电荷，转膜 即在电场作用下 从胶中转至膜上 的过程。
注：下层滤纸必须用新的。
（四） 转膜
方法 仪器 特点
半干转
半干式转膜速度快，适 合与小分子量蛋白 两种方法的转 膜液不同！！
湿 转
湿式成功率高并特别适合用 于分子量大于 100KD的蛋白
分离胶
pH不连续 特点： 凝胶不连续 缓冲液成分不连续
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蛋白质在进入分离胶以前，先
被浓缩成一条细线，使每个蛋 白的起跑线相同，提高解析度。
（三）凝胶 电泳
2.上样
1.上样前煮沸 样品 2.每孔上样量 为100-150 μg蛋白；根 据目的蛋白的 表达情况的不 同而有所变化。 3.Marker:68ul
Western Blot
（二） 蛋白含量的测定
步骤： 1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一 圈的孔最好不用） 2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A
液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液
240ul） 3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍）， 每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做 三个重复则需要60ul，一般配80ul
Western Blot
（一）蛋白样品制备
• 4、每瓶细胞加 400 μ l 含 PMSF 的裂解液，于冰 上裂解 30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来 回摇动。 • 5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的 一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液 移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进 行。） • 6、于 4℃下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心 机预冷） • 7、 将离心后的上清液分装转移至离心管中放于－ 20℃保存。
Western blot 实验介绍及流程PPT课件
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Western blot 实验结果与分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与 内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果
c-fos actin
62kD 42kD
二抗孵育：二抗的选择根 据一抗的种属来源，如： 一抗是兔抗大鼠目的蛋白 的抗体，则二抗应选择山 羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素 或酶。
第12页/共17页
Western blot 实验流程
6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase ( HRP ), which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.
• 电泳仪
用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹 ）实验中非常重要的部分。
第2页/共17页
Western blot 实验原理
• Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即 组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过 化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂 （如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光 来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。
《westernblot精华》课件
《Western Blot精华》PPT 课件
在这份《Western Blot精华》PPT课件中，我们将深入讲解Western Blot的原 理、步骤和应用，并探讨其与其他生物技术的联系与区别。
Western Blot简介
Western Blot是一种常用的生物技术，通过将目标蛋白质从多种混合物中分离和定位，帮助研究者分析 蛋白质的表达水平和特征。
蛋白质转移
蛋白质转移是Western Blot实验的关键步骤之一，将电泳分离得到的蛋白进行转移到蛋白转移膜上。
1
原理和步骤
详细解释蛋白质转移的原理和具体的步骤。
2
蛋白质转移膜的选择和处理
讨论选择合适的蛋白质转移膜和相关的处理技巧。
3
蛋白质转移的效果和监测
讲解蛋白质转移后的效果评估和监测方法。
Western Blot研究
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳是Western Blot实验的关键步骤，用于分离蛋白质并定位目标蛋白带。
1
原理和步骤
解释SDS-PAGE电泳的原理和具体的操作步骤。
2
PAGE电泳分离和定位目标蛋白带。
3
凝胶染色和去染色
介绍凝胶染色和去染色的方法和常用技巧。
总结
这一节将总结Western Blot实验的要点和注意事项，并探讨其技术的优点和局限性，为进一步的研究提 供思考和展望。
实验的要点和注意事项
总结进行Western Blot实验时 需要特别注意的关键要点。
技术的优点和局限性
分析Western Blot技术的优点 和当前的局限性。
进一步思考和展望
提出关于Western Blot实验的 更深入思考，并展望可能的 未来发展方向。
western blot实验技术要点
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
Western blot（WB）实验技术要点
太和医院检验部
WB操作流程
样品处理
A
转印与封闭
C
蛋白检测
E
B
SDS-PAGE电泳
D
抗体孵育
失败！
理想的WB图片
1
2
3
背景干净 条带清晰
条带均一 间距相同
内参一致 差异突出
01 Part One 蛋白处理要点
蛋白处理至关重要
蛋白酶抑制剂
01
防
降
02
占据蛋白未结合位点 TBST溶解脱脂牛奶或BSA
室温1h或4℃过夜
04 Part Four
抗体孵育
抗体孵育
抗体稀释
孵育条件
注意事项
脱脂牛奶 BSA
抗体稀释液
室温1-2h
或 4℃过夜
抗体比例 充分洗涤 摇床速度
05 Part Five 蛋白检测
蛋白检测
01
显影剂孵育
均匀、快速滴加
02
曝光时间
避免过度曝光
分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小，可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
Western Blot 实验操作教程
简介蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将电泳后的细胞或组织总蛋白从凝胶电泳转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，利用抗原抗体反应，用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
现已广泛应用于基因在蛋白质水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
应用范围检测基因在蛋白质水平的表达，是一种对蛋白质表达水平半定量的检测方法。
使用实例1）如2015年发表在Cell Stem Cell（ChangHui Park et al., 2015, Cell Stem Cell）上的一篇文章（介绍神经精神疾病建模过程使用基因条件敲除，发现NRXN1中杂合突变引起突触传递缺陷现象，证明人类神经元中杂合NRXN1突变会伴随CASK蛋白表达上调），作者分析了mRNA 水平包括CASK mRNA（使用定量PCR方法，图A）和蛋白水平的变化（使用LI-COR Odyssey定量Western Blot方法，图B），文章显示cKO和cTr NRXN1突变体iN细胞中CASK蛋白水平增加60％-80％，定量PCR和定量Western Blot结果相辅相成，与其他方法共同揭示了NRXN1的杂合失活直接损害人类神经元突触功能。
A：总mRNA水平定量分析用qRT-PCR方法B：蛋白表达差异定量分析LI-COR Odyssey进行定量Western Blot成像分析2）2016年发表在Neuron(Rani et al l., 2016, Neuron)上的文章（介绍一个灵长类lncRNA-lncND 在神经元发育过程中调节Notch信号通路）中，内源性NOTCH-1和NOTCH-2 mRNA（定量PCR方法）和蛋白的表达（LI-COR Odyssey定量Western Blot方法）在miR-143-3p模拟物存在下显着下调（图D和F）。
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加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 室温避光1.5-2h 回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，纯净水洗膜5min。
显色反应
（重组蛋白一般用磷酸酯酶 AP显色或是二氨基联苯胺 DAB显色， 裂解液一般用发光法）
辣根过氧化物酶HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将 DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显 色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结 果，将印迹膜晾干扫描保存 底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在 膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X 光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、 定影。
Western blot 实验技术
巴傲得生物上海分公司 金永红 4006609091 king@
定义：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测 反应来检测样品的一种方法。
Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方 法。
蛋白样品制备的注意事项：
➢ 细胞数量达5×106个时就可以做WB。 ➢ 将细胞裂解液在离心，收集上清液，加
loading煮样5min
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺杂交 洗涤 底物显色
蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 ➢ 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain ➢ 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
凝胶浓度％ （W/V）
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 30.0
分离范围（bp)
100-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100 6以下
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：
做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。
加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短， 以免样品扩散
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot基本原理
Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经 过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸 纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固 相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫 反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物 显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹 分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
转膜
半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。
湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。
转膜注意事项：
泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用转移buffer浸泡20min 转膜顺序：
后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
纯净水 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS Tris-HCL TEMED 过硫酸铵
凝胶浓度与蛋白分离范围
电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能 联通），将电压调到85V开始电泳，待marker出现6条带 时将电压调到135V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以 0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导 致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。室温不 少于7小时，4 ℃时过夜。
回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导 致膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确 ）。
阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板 转膜：0.35A 250V 1h40min
封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深 )
5％脱脂奶粉（如果用生物素标记的二抗，就不能用奶粉封
闭，因为奶粉中含有生物素 ）
BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
剪膜
一抗、二抗孵育