酶活性测定的主要影响因素及控制

2.4 正向反应与逆向反应

LDH测定的选择目前尚有争议。 国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在 2001年发表的操作手册一致。

正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低 廉，稳定性好。
L 乳酸 NAD LD 丙酮酸 NADH H

国外常用方法曾是逆向反应（P→L），


EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属 离子螯合剂； 在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子， Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷 酸酶（5′-NA）的激活剂。
1.2 肝素


是一种粘多糖， 是对酶活性影响最小的抗凝剂， 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响， 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。

酶的概念

酶活性浓度测定的主要影响因 素
1.
标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置
1.标本及标本采集和处理因素 的影响及控制
1.标本及采集和处理的影响因素



1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7
溶血 抗凝剂 温度 空气与光线 标本副反应 酶蛋白浓度 其他
1.1 溶血

最重要的影响是RBC内酶的大量释出。


大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性 远高于血清； 如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高 100、15和7倍左右。

RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能 使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的 测定。

使用时

2. 酶活性测定的原理

酶活性与速度的关系
*酶促反应进程曲线
2.1 定时法与连续监测法的选用


在条件许可的情况下，应尽可能全部采用连续 监测法，少用或不用定时法。 连续监测法可以选择线性期的反应速度来计 算酶活性，测定结果可靠，是首选的方法。 但该方法仪器要求相对较高。 在基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得 到比较准确的结果。 ALP酶活性的测定，如加做样品空白，两法 的结果准确性相当。
ALT L 丙氨酸 2 氧代戊二酸 L 谷氨酸 L 丙酮酸
L 丙酮酸 NADH H LD L 乳酸 NAD
1.5 副反应的控制

可通过加入副反应抑制剂， 或对样品进行预处理等方法给予排除。 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗 费时间是最经济的方法。

反应速度是正向的3倍，成本也较低。
L 丙酮酸 NADH H LD L 乳酸 NAD
2.5 检测试剂的干扰作用

试剂酶的污染。

组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶， 它将干扰各种还原酶的测定。 很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定， 放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。 如碱性磷酸酶（ALP）测定 是通过试剂空白管检出并加以校正。 选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量 好的试剂。
3.3 ε 的校准（405 nm波长）


最常用的色素原为对硝基苯酚等。 对硝基苯酚在405 nm的，可用ALP测定试 剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标 准液作为血清标本，实际测定计算ε值。 对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大， 则需找维修部检查。

反应系统


检测系统

3 仪器影响因素的控制


在日常工作中，除常规做好仪器和设备的 正确使用和维护外， 重点应注意仪器的校准问题。
3.1 酶活性浓度的计算公式
A U /L K min

V 106 K v L

摩尔吸光系数 和系数 K 均为常数， 和 K受仪器诸多因素的影响，

样品启动模式。

2.3 底物启动模式与样品启动模式

双试剂与单试剂酶促反应时间进程曲线
2.3 需要注意

某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑， 并没有将底物单独作为第二试剂，也起不 到消除内源性干扰的作用。
2.4 正向反应与逆向反应


一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。 除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的 方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳 定性等诸多因素。 例如， CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应 是正向反应的6倍，而且受影响因素少。
1.3 温度


由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如 无细菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP 等）可在室温保存1～3天活性不受影响。 有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在 37℃放置1h，活性可下降50%。
1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性 （活性变化小于10%）
酶 LD -GT ALD ALT AST CK ChE 室温（25℃） 1周 2d 2d 2d 3d 1周 1周 1周 2d 5d 1周 1周 1周 冷藏（0～4℃） 1～3d§ 冰冻（-25℃） 1～3d§ 1月 不稳定* 不稳定* 1月 1月 1周

冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长， 可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气 长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬 季测定LD的活性较夏季高。
2. 试剂及方法学因素 的影响及控制
2. 试剂及方法学的影响因素

酶的测定大多使用商品试剂盒

不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包 括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技 术含量等常有区别。 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 定时法与连续监测法 检测底物或检测产物 底物启动模式与样品启动模式 正向反应与逆向反应 试剂的干扰作用
酶活性浓度测定的 主要影响因素及控制
酶（enzyme）

酶的应用

临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。 酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。 是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特 殊蛋白质，又称为生物催化剂。 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者 为主。 酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。

L 丙酮酸 NADH H LD L 乳酸 NAD
2.3 底物启动模式与样品启动模式

底物启动模式（IFCC推荐采用）。


指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时 间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样 品中的待测酶的酶促反应。 好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某 些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。 这种模式需要双试剂剂型。 指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品， 依靠样品中的待测酶来启动酶促反应； 只是在延滞期去除部分干扰物。 这种模式可采用单一试剂剂型。

如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及 磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。

和 K 可用校准物定期校正。
3.2 校准物

可用作酶活性测定用的校准物分两类。 一类是产物的基准物质，

如对硝基酚、对硝基苯胺等， 用于校准仪器的 值（摩尔吸光系数）。 多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比 较接近， 用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。
3.3 ε 的校准（340 nm波长）



NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。 在340nm 的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶 法实测、计算其实测的。 NAD(P)H的ε为6220。 如果6 000>ε>6600为不合格，则需找维修部 检查。 注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使 用文献或试剂盒说明书的数值。
1.1 Hb的吸光度曲线
1.1 溶血影响的控制

减少溶血


体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加 以克服； 分清体内溶血与体外溶血。 可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连 续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分 光光度分析的影响。 应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。

减少溶血的干扰

底物的非酶反应。



解决的方法

3. 仪器因素的影响及控制
3 仪器的影响因素

加样系统

加样的准确性、重复性和携带污染； 反应杯的形状、表面和携带污染； 反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围； 搅拌和清洗机构的效果和携带污染； 光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等 均会造成结果的偏差。
1.6 酶蛋白浓度



酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易 解离、易吸附于容器上和易发生表面变性 之故。 酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超 过检测仪器的线性范围时，需将样品进行 稀释或减少样品用量后再行测定。 样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与 抑制剂被稀释有关。
1.7 其他


样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以 及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备 过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。 季节
2.1 连续监测法与定时法 的酶促反应时间进程曲线
2.2 检测底物或检测产物的选择

取决于哪个更方便，测定的结果更准确。 通常原则是选择测定产物的生成量而不是底 物的消耗量。


反应时底物浓度高，反应时间短； 这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物 所取代的原因之一。 除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外， 已很少采用测定底物消耗量的项目。


1.1 注意: RBC中酶的干扰


不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时 将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可 以透过细胞膜进入血清， 所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时 离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以 免引起误差。
1.2 抗凝剂


临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一 般都应以血清作为首选测定标本。 大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，
1.4 空气与光线
血清置于空气中时， 血中CO2丧失极快，pH可在15min内由 7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感 的ACP活性迅速下降。 某些酶易受光线破坏， CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆 地失活，其失活程度与暴光时间的长 短成正比。

1.5 副反应


副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应 外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶 测定的反应。 NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。


体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶 很多是一致的。 若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。
1.5 副反应(酶偶联法测ALT)


由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血 液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处 吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。 ALT活性测定的反应式如下：
2.2 检测底物或检测产物的选择

底物与产物 举例
ALT测定（赖氏法-定时法） ALT α -丙酮酸 + L-谷氨酸 L-丙氨酸 + α -酮戊二酸 α -丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 碱性条件下 2，4-二硝基苯腙



(红棕色，λ=505nm)
ALT测定（连续监测法） ALT L-丙氨酸 + α -酮戊二酸 α -丙酮酸 + L-谷氨酸
ALP
ACP 5’-NT
2～3d
4h※ 24h
2～3d
3d# 1周
1月
3d# 3月
AMY
LPS

1月
1周7月Biblioteka 3周2月3周
*酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5
1.3 温度影响的控制

及时检测 低温贮存

大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测 定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。

另一类称酶校准物（Enzyme calibrator），


3.2 校准物



国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。 各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可 溯源至CRM酶参考物。 常规工作一般选用用于常规实验室的工作校 准品。 目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝 灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。

常见的影响因素

2. 影响因素的控制

选购试剂盒时

要仔细阅读试剂盒说明书； 了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等； 选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方 法，或选择公认的测定方法。 定期对试剂盒的质量进行监测； 准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽； 正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸 光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。