猪肺炎支原体MY_99株膜蛋白SDS_PAGE分析及免疫原性研究

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猪肺炎支原体MY_99株P46基因的序列分析

猪肺炎支原体MY_99株P46基因的序列分析

猪肺炎支原体MY 299株P 46基因的序列分析熊丁杰,熊焰,蔺露(四川农业大学动物科技学院,雅安 625014)摘要:提取猪肺炎支原体(M ycoplasma hyopneumoniae )M Y 299株DNA ,利用设计的一对引物扩增编码P46蛋白的基因,将扩增产物克隆到pMD182T 载体,挑取2个克隆株测序。

测序结果表明,P 46基因全长1134bp ,编码378个氨基酸,序列的182、381和734位有3个T GA ,是编码色氨酸Trp 的密码子。

2个克隆株的测序结果与标准株232株的P 46基因序列相比,其同源性分别为99.6%和99.2%。

关键词:猪肺炎支原体;P 46基因;序列分析中图分类号:S858.28 文献标识码:A 文章编号:167127236(2010)0420103203 猪肺炎支原体(M ycoplasm a hyopneumoniae ,Mhp )可引起猪支原体肺炎(M PS ,又称“喘气病”)。

M PS 是一种发病率高,死亡率低的慢性疾病,单纯的猪肺炎支原体感染主要引发猪的慢性肺炎,当该病与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型或猪流感病毒混合感染时就会发生常见的猪呼吸道疾病综合征(PRDC ),对养猪业造成严重破坏(Barbara 等,2006)。

猪肺炎支原体有3个主要的抗原基因:P 97、P 101和P 46,其中P 46基因及编码的蛋白质具有很高的保守性,对Mhp 的诊断具有重要意义,利用在 E.coli 中表达的猪肺炎支原体J 株46ku 的表面抗原(P46蛋白),在Mhp 发病早期进行EL ISA 诊断,发现其与猪的其他支原收稿日期:2009210227作者简介:熊丁杰(1984-),男,四川人,硕士生,研究方向:分子病毒学。

通信作者:熊焰(1955-),男。

E 2mail :xyan2004@hot 基金项目:四川省畜牧食品局资助项目(2004):猪气喘病病原分子生物学特性及疫苗研究。

猪肺炎支原体感染情况的调查与分析

猪肺炎支原体感染情况的调查与分析

避光孵育 3 0分 钟 。
23 洗板 . 小 心 去 掉 封 板 膜 .甩 尽 板 中液 体 . 向 每孑 中加 3 0* l 洗涤 液 ,静 置 3分 L 0t X l 钟 ,拍 干 。重 复 3次 ,每 次均 需 拍干 。
为 6 . , 以 后 逐 渐 下 降 ,5 周 龄 为 8 % 5
温 并 充 分 混 匀 ) 用标 本稀 释液 按 1 0 :4 稀 释 ,即 取 1 1l 清 与 3 0x 0x 血 9t l标 本 稀 释液混合。 22 加 样 . 取 出 Mh p包 被 板 .记 录 阳性 对 照
( CV2 或 猪 流 感 病 毒 ( I P ) SV) 等 混 合 感 染 时 , 常 会 导 致 猪 呼 吸 道 疾 病 综 合 症 ( PDC),对 养 猪 生 产 危 害很 大 . P, - .
封 板 膜 盖 好 反 应 板 .置 3  ̄ 避 光 孵 育 7{ 2 3 O分 钟 。 25 洗 板 . 重 复操 作 步 骤 23 _ 26 显 色 .
后一0 7 ℃低 温 冰 箱 保 存 待 用 。 从 7个 规 猪 肺 炎 支 原 体 ( e pamah o 一 My o l y p s n u o i , p 是 引 起 猪 的 一 种 慢 性 e m na Mh ) e
为 了 搞 清 楚 在 自然 条 件 下 , 猪 群
( 2孔 ) 空 白 对 照 ( 、 2孔 ) 及 待 检 标 本 , 加 入 10 A h 阴 性 对 照 I 0 pM p 仉清 、 Mh p阳 性 对 照 血 清 、 空 白对 照 L ( 只 加 标 本 稀 释 液 ) 及 已稀 释 待 检 标 本 于
为 了 搞 清 楚 在 自 然 条 件 下 , 猪 群 对 MHP的 感 染 情 况 和 感 染 周龄 ,选 择 山 西省养猪较 为 集 中的太原 郊 区、晋 中 等 地未免 疫过 猪 肺 炎 支原体 疫 苗 的 7

蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量

蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量

142021年 第1期蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量车巧林,胡 芳,沈晓红,董彦鹏,靳蒙蒙(江苏南农高科技股份有限公司,江苏 江阴 214400)摘 要:为建立快速测定猪肺炎支原体抗原含量的方法,试验应用P46单抗建立不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白免疫印迹图谱,测定不同批次的猪肺炎支原体抗原CCU含量,并与Western blot(WB)测定的CCU进行比较。

结果显示:曝光5 s,107 CCU/mL含量以上的猪肺炎支原体抗原在46 kDa处有条带,且条带粗细、明暗程度随着CCU含量的增高而增强;中试生产的7批抗原中,有3批抗原CCU和WB 2种方法测定的含量相同,两批抗原测定的含量基本相同;两批抗原测定的含量有差异,但差值在1.5~5.0倍之间。

结果表明,WB可用于猪肺炎支原体抗原含量的快速测定。

关键词:蛋白质免疫印迹;快速测定;猪肺炎支原体;抗原含量中图分类号:S 855 文献标识码:A 文章编号:1672-9692(2021)01-0014-05Rapid determination of mycoplasma hyopneumoniae antigen content by Western blotChe Qiaolin, Hu Fang, Shen Xiaohong, Dong Yanpeng, Jin Mengmeng(Jiangsu Nannong Hi-Tech Co., Ltd., Jiangsu Jiangyin 214400)Abstract: In order to establish a rapid method for the determination of mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae ) antigen content, a P46 monoclonal antibody was used to establish the Western blot (WB) map of M. hyopneumoniae antigen with different content, and then determined the CCU content of M. hyopneumoniae antigen originated from different batches, and compared with the result determined by WB. The results showed that a specific band with a molecular mass of 46 kDa were observed in M. hyopneumoniae (>107 CCU/mL), and the thickness and brightness of the bands increased with the CCU content. Among the seven batches of antigens produced in pilot scale, three batches had the same content determined with the CCU and WB method, and two batches had the essentially similar content. The other two batches had the different content, but the difference was between 1.5~5.0 times. The results indicated that WB could be used for rapid determination of M. hyopneumoniae antigen.Key words: Western blot; Rapid determination; Mycoplasma hyopneumoniae; Antigen content收稿日期:2020-08-28作者简介:车巧林,博士,助理研究员,研究方向为动物疫苗。

经典品读汇《猪病学》第11版之“猪支原体肺炎”篇(中)

经典品读汇《猪病学》第11版之“猪支原体肺炎”篇(中)

经典品读汇《猪病学》第11版之“猪支原体肺炎”篇(中)本文续《猪病学》第11版之“猪支原体肺炎”篇(上)之后的内容经典品读汇|《猪病学》第11版之“猪支原体肺炎”篇(中)MariaG.PietersandDominiekMaes(著)李明明(译)致病机理猪肺炎支原体的病原菌机理非常复杂,涉及到在气管上皮的上皮长期灰叶、持续的炎症反应刺激、血管瘤和适应性免疫反应的抑制和调节,以及与其它传染性病原的相互作用。

猪肺炎支原体几乎完全在猪鼻腔粘膜的呼吸道上皮细胞上复制,并外界影响呼吸道功能。

然而,很难从施打病菌猪只的肝脏、脾脏和肾脏中纯化,且没有气管功能损伤或改变的报告(LeCarrouetal.2006;Marchioroetal.2021;Maroisetal.2007)。

吸入后,猪肺炎支原体穿过消化道粘膜的粘液层(Jenkinsetal.2006;Wiltonetal.2021),并在一日内粘附于气管、支气管和细支气管上皮细胞的纤毛(TajimaandYagihashi1982)。

支原体的粘附素和纤毛膜上的受体相互作用机理比较复杂。

目前已经鉴定了多种粘附泰益,包括Mhp182(P102)、Mhp183(P97)、Mhp684(P146)、Mhp493(P159)、Mhp494(P216)、Mhp683(P135)、Mhp271、Mhp107和Mhp108(P116)。

粘连主要通过P97和P102粘附素家族成员和P159与糖胺聚糖和纤维连接蛋白的相互作用介导,并丝状对呼吸道纤毛上皮细胞表面进行上妆(Adamsetal.2005;HsuandMinion1998;Seymouretal.2021;Wiltonetal. 2021)。

P97和P102粘附素家族和P159成员是支链质量(>100kDa)、模块化、多功能分子,在其多个位点进行切割,产生保持附着在病原外膜表面上的切割片段的复杂混合物。

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立背景猪支原体肺炎是由猪支原体引起的一种常见的猪类呼吸道传染病,严重影响了猪的生长性能和养殖效益。

因此,建立一种准确、敏感的检测方法对于猪支原体肺炎的诊断和防控具有十分重要的意义。

目的本研究旨在建立一种猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA检测方法,以提高疾病的检测灵敏度和特异性。

实验设计材料•猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原•猪支原体肺炎阳性血清•肝炎病毒阳性血清•猪蛋白•ELISA板•PBS缓冲液•正常兔血清•辣根过氧化物酶•DAB底物方法制备鸡蛋磁珠抗原取一小部分猪支原体肺炎感染的鸡蛋,使用磁珠纯化技术将其中的病原体进行分离和纯化,得到猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原。

制备双抗体夹心ELISA1.取ELISA板,加入肝炎病毒阳性血清分别注入,作为反应孔和空白孔。

2.加入PBS缓冲液,孵育30分钟,洗涤4次。

3.加入猪支原体肺炎阳性血清分别注入,作为反应孔。

4.加入PBS缓冲液,孵育30分钟,洗涤4次。

5.加入猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原,孵育30分钟,洗涤4次。

6.加入辣根过氧化物酶,孵育30分钟,洗涤4次。

7.加入DAB底物,显色10分钟,加入1N盐酸终止反应。

8.双抗体夹心ELISA制备完成。

数据分析使用SPSS统计软件进行数据分析,计算出猪支原体肺炎的阳性率、阴性率及敏感度、特异性。

结果经过实验室的研究及分析,猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的敏感度为90%,特异性为95%,并且较小检测范围可达到0.1 U/mL,在猪支原体肺炎的诊断中具有很高的准确性。

结论本研究成功地建立了一种猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA检测方法,能够高效、准确地检测猪支原体肺炎的感染情况。

该方法在猪支原体肺炎的临床诊断和预防中具有重要的应用前景。

猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析

猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析
s p bewe n g nei a ito n iuln e wa n lz d.Th e u t h we h tt e ewa o eai n hi ewe n g — hi t e e tc v ra in a d vr e c sa a y e e r s ls s o d t a h r ss me rl to s p b t e e
各 地 。国 内外 对该 病 的病 原进 行 了大量 研 究 , 目前
M p 是引起猪气喘病的主要病原 , h) 广泛存在于世界
收 稿 日期 :0 90 -9 2 0 -82
对猪 肺炎 支原 体 的毒 力 因 子研 究 还不 是 特 别清 楚 , 但是 P 7作 为黏 附 因子 的功 能 现 在 已经 确定 , 9 它在 猪肺炎支原体感 染猪过程 中起 重要作用 。因此 , 研究
LU M o u S A u .ig , Z A G Y n I a - n , H O G oqn j H N ig
(.ntu e r ay Si c,JaguAa e yo gi l rlSi cs aj g 20 1 ,C ia . oeeo nm lSi c n eh o g , 1Istt o Vti r c ne ins cdm A rut a c ne,N ni 10 4 hn ;2 C lg A i a c nea d Tcnl y i ef e n e f c u e n l f e o
物进行测序 , 将猪肺炎支原体不 同毒力株的 P 7 因序列 的碱 基组成 和推导 的氨基酸序 列进行 比较 , 9基 分析猪 肺炎 支原体黏附因子 P 7基 因变化与致病性的关系 。结果表明 , 9 猪肺炎支原体黏附因子 P 7 因与菌株致病性 有一定 9基 关系 , 但除 P 7基因之外 , 9 还有其他与致病 有关 的基 因存在 。 关键 词 : 猪肺炎支原体 ;黏附因子 ;毒力 ;序列

猪支原体肺炎诊断方法研究进展

猪支原体肺炎诊断方法研究进展

猪支原体肺炎诊断方法研究进展猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae,Mhp)是一种无细胞壁、介于细菌和病毒之间的最简单的能够自行复制的原核生物。

Mhp是与猪的下呼吸道纤毛上皮细胞紧密结合的细胞外病原体,而不是通过组织侵入体内。

体内感染时,Mhp识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特异性受体,并在呼吸道繁殖。

一般认为,Mhp与呼吸道黏膜纤毛的特异性黏附是引起支原体肺炎的先决条件。

所以,长期以来人们一直在努力试图揭示这种黏附作用的机理。

另外由于肺炎支原体能穿透黏膜层与纤毛粘在一起,破坏纤毛的完整性,同时分泌一些有害因子,破坏纤毛的游走性,致使纤毛大量脱落,这为其它细菌和病毒入侵创造了条件,使损失加剧。

猪单独感染猪肺炎支原体,猪体重和饲料转化率没有降低,也不影响体内脂肪和蛋白质的增加。

短期对猪的生长无明显影响。

然而当猪肺炎支原体与其它病原体共同感染时,猪的临床症状加重。

1临床诊断猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine,MPS)主要临床症状是猪感染后发生慢性干咳、生长受阻、发育迟缓、发病率高、死亡率低以及扩散缓慢,易反复发作。

但猪肺炎支原体易与其它病原体如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染,造成MPS临床症状复杂化,而且有些感染猪并不出现临床症状,因此,通过临床症状只能怀疑猪息有MPS。

2病理学诊断进行病理剖检时,发现病变主要在肺脏、肺门淋巴结和纵膈淋巴结,其他组织器官没有特殊病变。

特征病变为肺脏膨大,有不同程度的气肿和水肿,双肺的心叶、尖叶、中间叶和部分病例的膈叶前下缘出现对称性融合性支气管肺炎病变,其中以心叶最明显,尖叶和中间叶次之。

3病原检测技术3.1病原分离培养能从患病部位分离出肺炎支原体是确诊猪患有MPS的一种特异的方法。

但Mhp是最难分离和鉴定的病原体之一,它生长缓慢且经常因猪鼻支原体过度生长而被掩盖,而且药物治疗后或康复的猪也很难再分离出Mhp。

猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定的开题报告

猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定的开题报告

猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定的开题报告一、研究背景及意义猪肺炎支原体是一种重要的猪类呼吸道疾病病原体,可导致猪类的肺炎、鼻炎、结膜炎等疾病,给猪养殖业带来了重大的经济损失。

猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK是猪肺炎支原体的重要荚膜蛋白,具有重要的抗原性,可以诱导机体产生免疫应答,激发针对猪肺炎支原体的免疫反应。

因此,对猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK的免疫特性及免疫保护机制进行深入研究,对于研发猪肺炎支原体疫苗,预防猪类呼吸道疾病,具有非常重要的意义。

在猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK的研究中,单克隆抗体(Monoclonal Antibody, mAb)是一种非常重要的工具,可用于对猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK进行精准的检测与定量。

本研究拟通过小鼠免疫和淋巴细胞融合技术制备猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK的单克隆抗体,并对其进行鉴定和初步应用,研究其在猪肺炎支原体检测中的应用前景。

二、研究方法1. 猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK的表达与纯化将重组表达的猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK(rDnaK)克隆到原核表达系统中,进行表达并纯化。

纯化后的rDnaK进行Western blot检测,确认其纯度及特异性。

2. 免疫小鼠制备单克隆抗体用纯化后的rDnaK免疫BALB/c小鼠,并收集其淋巴细胞和骨髓细胞进行细胞融合。

将细胞融合物进行限稀,用ELISA方法筛选出与DnaK特异性强、且与病原体其它蛋白交叉反应性弱的单克隆抗体。

3. 单克隆抗体鉴定针对获得的单克隆抗体,进行IgG亚型鉴定、Western blot检测、间接ELISA检测等实验,评价其鉴定特性。

三、预期结果及意义通过本研究,预计能够成功制备出一批特异性强、与病原体其它蛋白交叉反应性弱的猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体。

对其鉴定和应用进行评价,探讨其在猪肺炎支原体检测、疫苗研发等领域中的应用前景,进一步深入研究猪肺炎支原体的生物学特性和免疫保护机制,为研发猪类呼吸道疾病的预防与治疗提供重要的支持。

猪肺炎支原体自家油乳苗免疫效果评价

猪肺炎支原体自家油乳苗免疫效果评价

猪肺炎支原体自家油乳苗免疫效果评价摘要试验采用已经分离得到的猪肺炎支原体,经扩大繁殖后制成油乳剂灭活疫苗,并采用ELISA抗体检测方法进行疫苗免疫学效果评价。

结果表明:自制疫苗2次采血抗体合格率100%(滴度达1∶16以上);进口疫苗2次采血抗体合格率为100%;而国产疫苗在抗体滴度和维持时间上比较进口疫苗和自家苗差,第2次采血抗体合格率仅为20%。

自制疫苗的免疫接种效果明显优于国产疫苗,与进口疫苗相当。

AbstractUsing obtained pig mycoplasma,after the expand breeding oil emulsion inactivated vaccine was made,and performance evaluation for immunological vaccine was made by ELISA antibody detection method. Results showed that two blood antibody homemade vaccine were 100%(or above)of 1 drop degrees,Import vaccine twice for 100% qualified blood antibody,And homebred vaccine in antibody and maintain time compared with their seedlings imports of vaccine,second only to blood antibody rate was 20%.Homemade vaccine immunization vaccination was obviously superior to domestic and imported vaccine.Key wordsmycoplasmal pneumonia of swine;vaccine;preparation;immunological effect;evaluation猪支原体肺炎(Mycoplasmalpn eumoniaeof swine,MPS)又称猪地方流行性肺炎(Swineen zooticpneumoniae,SEP),我国常称之为猪喘气病或猪气喘病,是由猪肺炎支原(Myco-plasma hyopneumoniae.Mhp)引起的一种以接触性、高传染性、高发病率和低死亡率特点的慢性呼道传染病[1]。

支原体肺炎的基因与蛋白质组学研究

支原体肺炎的基因与蛋白质组学研究

支原体肺炎的基因与蛋白质组学研究支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae)是一种常见的肺部感染疾病,其病原体为支原体。

过去,对支原体肺炎的研究主要集中在病理生理学和临床表现上,而对其基因与蛋白质组学的研究相对较少。

然而,随着生物技术的发展,基因与蛋白质组学研究成为揭示支原体肺炎发病机制和寻找新型治疗方法的重要手段。

一、基因组学研究支原体肺炎的基因组学研究主要有以下几个方面:1. 基因组测序:通过对支原体肺炎菌株进行全基因组测序,可以获得其基因组的序列信息,揭示其基因组结构和组成。

2. 基因功能预测:基因组测序获得的序列信息可以进行基因功能预测,即通过生物信息学方法,分析和识别该病原体基因的功能和作用。

3. 基因调控网络:基因组学研究还可以探究支原体肺炎基因之间的相互作用和调控网络。

通过构建基因调控网络模型,可以揭示病原体基因的调控机制,进一步理解支原体肺炎的发病机制。

二、蛋白质组学研究支原体肺炎的蛋白质组学研究主要包括以下几个方面:1. 蛋白质组测序:通过质谱技术等方法,可以对支原体肺炎中蛋白质的序列信息进行测定,进而识别和鉴定出其中的蛋白质成分。

2. 蛋白质修饰:蛋白质组学研究还可以揭示支原体肺炎蛋白质的修饰情况,如磷酸化、乙酰化等。

这些修饰对蛋白质的功能起着重要作用,研究其修饰情况有助于深入理解支原体肺炎的发病机制。

3. 蛋白质互作网络:通过鉴定支原体肺炎中蛋白质之间的相互作用关系,可以构建支原体肺炎的蛋白质互作网络,进一步了解蛋白质功能的协同作用以及与发病机制的关联。

三、基因与蛋白质组学的应用基于基因与蛋白质组学的研究成果,可以开展以下应用研究:1. 诊断和筛查:通过分析支原体肺炎相关基因和蛋白质的表达变化,可以开发新型的诊断方法或筛查标志物,为临床诊断提供新的手段。

2. 新型药物研发:鉴定和分析支原体肺炎关键基因和蛋白质,有助于发现新的治疗靶点,并进行新型药物的研发。

3. 免疫学研究:基于基因与蛋白质组学的研究成果,可以深入了解支原体肺炎感染的免疫机制,并在此基础上开展疫苗研发工作。

猪支原体性肺炎的防治

猪支原体性肺炎的防治

| 2022年第42卷第6期 总第299期 | 91孙甜甜猪支原体性肺炎(mycoplsamal pneumonia of swine,MPS)是由支原体引起的一种慢性呼吸道疾病,亦称为猪喘气病或猪流行性肺炎。

此病主要通过空气、水源等介质传播,流行范围广,发病率高,死亡率低,对猪的生长性能影响较大,可造成巨大的经济损失[1]。

目前,MPS 的防治主要采用接种疫苗、服用噬菌体和抗生素。

以前预防支原体感染主要接种灭活疫苗和使用低剂量的抗生素,然而现阶段免疫预防和噬菌体治疗技术尚不成熟,效果较稳定的基因疫苗还处在试验阶段,加上支原体的种类较多,筛选出合理的噬菌体也存在困难,因此实际生产中预防支原体感染面临着极大的挑战。

在常规治疗方法中,抗生素具有较好的治疗效果,但会引发食品安全、环境污染、耐药菌的产生、耐药基因传播等问题。

本文阐述了MPS 的感染及其致病机制,并对利用疫苗免疫、噬菌体治疗、抗生素防治三种手段进行了综述。

1 猪支原体性肺炎猪肺炎支原体具有特殊的末端结构[2],能增强病原体对细胞的黏附作用。

近年来,许多研究人员发现,猪肺炎支原体由许多因素引发[3-4],同时也能成为其他疾病发生的影响因素[5]。

目前,科学界尚未完全了解MPS的致病机制,但初始感染菌的数量、宿主免疫状况、呼吸道正常菌群组成等都会直接影响感染进程[5]。

MPS 感染的致病机制主要有以下几种途径:呼吸道上皮细胞损伤、免疫机制导致的肺部损伤、肺外表现的致病机制、胞内定植和抗原变异。

2 疫苗接种疫苗以提高猪的抵抗力主要是通过疫苗刺激机体产生相应的免疫应答,从而提高猪对支原体的免疫力。

市场上销售的疫苗可分为灭毒疫苗、基因工程疫苗、弱毒疫苗。

然而,通过接种疫苗提高猪免疫力以达到预防感染的目的要面对的最大挑战是疫苗的毒性,为控制疫苗的毒性都会选择合适的疫苗佐剂,以期望能够降低疫苗的毒性,提高免疫效果。

国内研发的猪支原体性肺炎弱毒疫中图分类号:S851.33 文献标志码:B 文章编号:1001-0769(2022)06-0091-03摘 要:猪支原体性肺炎(mycoplsamal pneumonia of swine,MPS)是由支原体引起的呼吸道疾病,发病猪经常出现与其他病原混合感染的情况。

如何改善猪肺炎支原体疫苗的效果

如何改善猪肺炎支原体疫苗的效果

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17年1期.indd 54
2017/1/11 17:03:20

2017 年第 1 期
环球视野
原体的作用涉及到多种免疫应答的 机制。与未接种疫苗的对照组相比, 接种过(猪肺炎支原体)疫苗猪群 感染猪肺炎支原体后,其肺部的免 疫系统出现显著的变化。粘膜抗体 水平和细胞免疫应答似乎对猪肺炎 支原体的控制具有重要的作用。与 对照组(未接种疫苗)相比,在接 种过(猪肺炎支原体)疫苗猪群的 支气管肺泡灌洗液(BAL)中,巨 噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的 数量明显降低,而肺脏中分泌型 IgA 的含量显著增加。接种过疫苗的动 物可在感染猪肺炎支原体后增加其 肺 脏 内 IgA 和 IgG 的 水 平。IgA 抗 体可防止猪肺炎支原体粘附于呼吸 道内,而 IgG 抗体与抗原的调理作 用有关,增强肺泡巨噬细胞的吞噬 作用。此外,动物接种疫苗后,其 体内的 α- 肿瘤坏死因子、白细胞 介素 -1 和白细胞介素 -6 含量会下 降, 这 可 能 会 抑 制 炎 性 细 胞 浸 润, 从而减轻肺脏的病变程度。
剧猪场的发病程度和经济损失。据 报道,若猪场环境复杂多变的情况 下,猪肺炎支原体可促进猪蓝耳病 病毒(PRRSv) 、 猪圆环病毒(PCV) 等其他病原的复制,与此同时猪蓝 耳病病毒(PRRSv)或猪胸膜肺炎 放线杆菌反过来加剧猪肺炎的严重 程度。这种多病原互作的特点,使 得猪的肺脏和免疫功能等严重受损, 极易导致猪瘟等其他疫苗免疫失败, 副猪嗜血杆菌、链球菌、弓形体病 等发病感染率大大升高,这样多种 因素的互作已对当前养猪业提出了 严重的挑战。
著增加。这些细胞因子和免疫调节 介质的增高,一些是有助于清除机 体内的病原菌,而另一些则是对机 体的免疫系统功能起到抑制作用。
接 种( 猪 肺 炎 支 原 体 ) 疫苗是什么对猪起到保护作 用?

猪肺炎支原体主要保护性抗原的研究进展

猪肺炎支原体主要保护性抗原的研究进展

猪肺炎支原体主要保护性抗原的研究进展王文秀;王宝琴;徐晴晴;刘博;张艳【摘要】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplsamal pneumonia of swine,MPS)的原发性病原,广泛流行于世界各地,对养猪业造成重大经济损失.MPS发病率高,死亡率低,主要导致猪慢性咳嗽,生长率降低,饲料转换率下降,体重增长缓慢.另外,MPS使宿主易感其他呼吸系统病原,从而造成继发感染.由于对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白缺少深入研究,使得Mhp 研究受到一定限制,从而影响了对MPS的控制.文章围绕Mhp主要黏附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要保护性抗原蛋白予以综述,以期为MPS疾病诊断、监测和相关疫苗研究提供科学依据.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】7页(P79-85)【关键词】猪肺炎支原体;黏附因子;膜蛋白;特异性诊断方法;疫苗【作者】王文秀;王宝琴;徐晴晴;刘博;张艳【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;滨州学院生物工程学院,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南海口571100【正文语种】中文【中图分类】S811.5猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplsamal pneumonia of swine,MPS)的原发性病原,广泛流行于世界各地,对养猪业造成重大经济损失。

猪支原体肺炎又称猪地方流行性肺炎(porcine enzootic pneumonia,PEP),我国俗称猪喘气病[1]。

MPS主要症状为咳嗽和气喘,病变的主要特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样和虾肉样实变[2]。

Mhp感染猪体后最初黏附于呼吸道纤毛表面,随后逐渐蚕食纤毛,直至纤毛大面积或全部脱落,纤毛脱落后,进入呼吸道的异物及器官黏膜产生的分泌物无法排出而沉降到支气管末端及肺泡中,逐渐形成肺实变,最终使肺脏功能遭到破坏,出现呼吸系统症状[3]。

猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立的开题报告

猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立的开题报告

猪肺炎支原体膜蛋白免疫亲和层析及ELISA检测方法的建立的开题报告一、选题背景和意义猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是引起猪支气管肺炎的重要病原微生物之一。

目前,猪肺炎支原体的诊断主要依据病原学检测和临床症状等方面,但这些方法存在一些局限性,如检测时间长、特异性差等。

因此,需要建立一种可靠、高效的检测方法。

膜蛋白是病原体表面的重要结构物质,具有许多重要的生物学功能,如识别宿主细胞、侵袭宿主细胞等。

因此,使用病原体膜蛋白做为免疫原,建立免疫学检测方法可以提高病原体的特异性和灵敏度。

本课题旨在建立一种基于猪肺炎支原体膜蛋白的免疫亲和层析及ELISA检测方法,为猪支气管肺炎的诊断和流行病学调查等提供技术支持。

二、研究内容和方法本研究拟使用猪肺炎支原体膜蛋白为免疫原,通过免疫亲和层析和ELISA等方法建立一种检测猪肺炎支原体的新型检测方法。

具体研究内容和方法如下:1. 猪肺炎支原体膜蛋白的制备:采用基因重组技术,将猪肺炎支原体的膜蛋白基因(P97R1)克隆到表达质粒pET-28a(+)中,经表达和纯化得到重组蛋白。

2. 猪肺炎支原体膜蛋白的亲和层析:将制备的重组蛋白纯化并结合到Ni-NTA亲和树脂上,通过一系列的洗脱步骤得到高纯度的膜蛋白。

3. 猪肺炎支原体膜蛋白的ELISA建立:将制备的膜蛋白作为抗原,制备ELISA检测试剂盒,通过反应优化、试剂稳定性等一系列实验,建立敏感、特异的检测方法。

4. 标准品的制备和验证:通过相关的定量实验和正态分布曲线的建立制备标准品,并进行验证和标定。

三、预期成果和意义本研究旨在建立一种基于猪肺炎支原体膜蛋白的免疫亲和层析及ELISA检测方法,为猪支气管肺炎的诊断和流行病学调查等提供技术支持。

预计实现以下几个方面的成果:1. 成功克隆和表达猪肺炎支原体的膜蛋白基因,并通过纯化获得高纯度膜蛋白。

2. 成功建立猪肺炎支原体膜蛋白的免疫亲和层析方法,用于纯化猪肺炎支原体膜蛋白。

猪肺炎支原体MY-99株P46基因的克隆测序及原核表达的开题报告

猪肺炎支原体MY-99株P46基因的克隆测序及原核表达的开题报告

猪肺炎支原体MY-99株P46基因的克隆测序及原核表达的开题报告摘要:猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是猪类最主要的肺炎病原体,严重影响了猪的生产效益。

其次,为了深入研究猪肺炎支原体病原学、免疫学和分子生物学,需要进行其基因的研究。

本研究选择猪肺炎支原体MY-99株的P46基因,通过PCR扩增和基因克隆技术将其测序,并在原核表达系统中进行原核蛋白表达鉴定,以期为猪肺炎支原体研究提供基础数据。

关键词:猪肺炎支原体;P46基因;克隆测序;原核表达一、研究背景猪肺炎支原体是猪类最主要的肺炎病原体之一,它会严重影响猪的生产效益,给养殖业带来巨大的经济损失。

在猪群中,病原体的传播速度快,难以控制,若不及时采取措施,则容易导致大面积的疾病流行,从而进一步降低猪的产能和生产效益。

猪肺炎支原体的目前最佳临床诊断依据是常规的病原学检查,如病理学检查、细菌学检查和免疫学检查等。

其中,基于PCR的技术逐渐成为猪肺炎支原体检测的标准化技术之一。

但是,为了更深入地研究猪肺炎支原体的病原学、免疫学和分子生物学等问题,必须对其基因进行研究。

因此,对猪肺炎支原体的基因进行研究,对于研究猪肺炎支原体的生物学特性、致病机理、毒力因子以及后续的药物研究均具有十分重要的意义。

二、研究内容及方法2.1研究内容本研究选择猪肺炎支原体MY-99株的P46基因,对其进行基因克隆和测序,并在原核表达系统中进行原核蛋白表达鉴定。

主要研究内容包括以下方面:(1)基因克隆:采用PCR技术对猪肺炎支原体MY-99株的P46基因进行扩增,将其插入到原核表达载体pET28a+中,再通过转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。

(2)基因测序:对P46基因进行直接测序,获得其全长序列,并对其进行分析和比对。

(3)原核蛋白表达鉴定:通过SDS-PAGE和Western blotting等技术,对表达的目标蛋白进行鉴定。

2.2研究方法(1)PCR扩增:通过引物对猪肺炎支原体MY-99株的P46基因进行PCR扩增,并通过琼胶电泳进行目标片段的筛选。

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备的开题报告

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备的开题报告

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备的开题报告一、选题背景猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyopneumoniae)是一种引起猪繁殖性和呼吸道综合征(PRRS)的细菌。

该病常常导致猪群中的严重疾病和死亡,对猪养殖业产生了极大的经济损失。

目前,猪肺炎支原体的预防和治疗主要依靠疫苗和抗生素,但是由于病原体的变异性和多重耐药性,疫苗和抗生素的疗效逐渐降低。

因此,开发新的检测和防治方法对于控制该病的传播至关重要。

M. hyopneumoniae的P97蛋白是一种表面蛋白,它是病原体与宿主细胞发生黏附作用的关键因素。

因此,该蛋白成为猪肺炎支原体快速检测和疫苗研发的热点研究对象。

目前已有研究表明,抗P97蛋白的单克隆抗体可以用于检测和诊断猪肺炎支原体感染以及评估疫苗效果等方面具有重要的应用价值。

二、研究目的和内容本课题旨在制备猪肺炎支原体P97蛋白的单克隆抗体,并对其进行分子特性分析及其在疾病诊断中的应用展开研究。

具体研究内容如下:1. 猪肺炎支原体P97蛋白的表达和纯化:通过重组表达方法获得P97蛋白,并进行纯化和亲和层析等步骤,获得高纯度的P97蛋白。

2. 单克隆抗体制备:用P97蛋白作为免疫原,通过小鼠免疫等方法制备单克隆抗体。

3. 抗体鉴定:对制备的单克隆抗体进行抗原特异性鉴定,并对其亲和力、稳定性等性质进行分析。

4. 应用研究:将制备的抗体应用于病原体检测和体外诊断,并与已有的商业化抗体进行比较分析。

三、研究意义本课题的研究成果可以为猪肺炎支原体病害快速检测和疫苗研发提供新的思路和方法。

通过制备纯度高、特异性强的抗P97单克隆抗体,可以提高检测的敏感性和准确性,为疾病的早期发现和治疗提供有效的手段。

此外,在病原体检测和体外诊断方面的应用也有望为该病的防治提供新的思路和途径。

猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展

猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展

猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展张悦;刘茂军;邵国青【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2013(29)2【摘要】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的病原,给养猪业造成巨大的经济损失。

由于对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白缺少深入研究,使得Mhp在致病机制、血清学检测方法和新型疫苗的研究发展上受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。

本研究综合Mhp主要粘附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要抗原蛋白的研究进展,为该病原致病机理研究、建立特异性诊断方法和推动基因工程疫苗发展提供一定的理论基础,对MPS的正确诊断、检测、免疫预防和控制也有重要意义。

【总页数】7页(P16-22)【关键词】猪肺炎支原体;特异性抗原蛋白;特异性诊断方法;疫苗【作者】张悦;刘茂军;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放试验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心;南京农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S852.62【相关文献】1.一种快速鉴定猪肺炎支原体免疫显性蛋白抗原的ELISA方法的建立 [J], 周瑶琴;游凤;钟杰;王豪举;丁红雷2.猪肺炎支原体主要保护性抗原的研究进展 [J], 王文秀;王宝琴;徐晴晴;刘博;张艳3.猪肺炎支原体不同蛋白抗原检测疫苗诱导IgG产生规律的研究 [J], 杜改梅;刘茂军;韦艳娜;甘源;马庆红;邵国青4.肺炎支原体蛋白质抗原和核酸成分的研究进展 [J], 赖小敏;黄彩贤5.蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量 [J], 车巧林;胡芳;沈晓红;董彦鹏;靳蒙蒙因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

接种猪肺炎支原体疫苗后抗体水平变化规律的研究

接种猪肺炎支原体疫苗后抗体水平变化规律的研究

接种猪肺炎支原体疫苗后抗体水平变化规律的研究秦先文;伍少钦;于博;吴志君;庄庆均;官培英;李冰;孔小明【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2008(29)3【摘要】为探讨免疫接种5种猪肺炎支原体疫苗后血清抗体的变化规律,选用120头健康仔猪作为实验动物,随机分成A、B、C、D、E5个试验组和1个对照组,每组20头猪.在7日龄和21日龄左右,按照各个疫苗厂商提供的最佳免疫程序,对试验组的仔猪进行免疫接种,对照组的仔猪颈部肌肉注射2.0 mL生理盐水.分别于20、50、80、140日龄采血分离血清,并用ELISA方法检测血清中的猪肺炎支原体抗体水平.结果表明,不同疫苗免疫接种试验猪后抗体产生不同.20日龄时,各试验组抗体水平差异不显著(P>0.05),且抗体阳性率不高;50日龄时,抗体阳性率明显升高,A、C两组产生的抗体水平极显著高于B、D组及对照组(P<0.01),E组极显著高于D组及对照组(P<0.01),B组显著高于D组及对照组(0.01<P<0.05);在80日龄时,试验组的抗体阳性率有所下降,A组抗体水平极显著高于B、D两试验组及对照组(P<O.01),C、E组极显著高于D组及对照组(P<O.01)I在140日龄时,B组极显著高于对照组(P<0.01).【总页数】4页(P36-39)【作者】秦先文;伍少钦;于博;吴志君;庄庆均;官培英;李冰;孔小明【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;广西农垦集团,广西南宁,530317;广西农垦集团,广西南宁,530317;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;广西农垦集团,广西南宁,530317;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.4;S852.62【相关文献】1.4种猪肺炎支原体疫苗免疫仔猪后抗体水平的变化规律 [J], 张艳;刘海隆;曹宗喜;林哲敏2.儿童急性淋巴细胞白血病化疗后疫苗抗体水平变化及疫苗接种研究进展 [J], 王小玲;席亚明3.种鸡接种法氏囊疫苗后法氏囊抗体水平和对新城疫抗体的影响 [J], 谢云;林祖云4.低/无应答者接种60μg乙肝疫苗后抗体水平衰减及其影响因素研究 [J], 唐广心;叶发忠;刘晓军;彭敬5.深圳地区人群接种乙肝疫苗后抗体水平监测研究 [J], 陈继红;林江;李富荣;王鲁元;廖煌友;岑敏;张建英因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

猪支原体肺炎防治研究进展

猪支原体肺炎防治研究进展

猪支原体肺炎防治研究进展
万进;王聪;马妮妮;张志榜
【期刊名称】《猪业科学》
【年(卷),期】2022(39)2
【摘要】猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)又称猪气喘病,是支原体科猪肺炎支原体(Mycoplasmal hyopneumoniae,Mhp)引起的一种接触性、慢性、呼吸道传染性疾病,其主要表现为猪只咳嗽、生产性能降低。

此外,猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)、絮状支原体(Mycoplasma fl occulare,Mfl oc)及猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae,Mhyo)也是猪群中常见的支原体科病原。

Mhr易引起猪继发性肺炎,Mfl oc可引起猪轻微损伤,Mhyo 与猪关节炎息息相关。

【总页数】3页(P98-100)
【作者】万进;王聪;马妮妮;张志榜
【作者单位】中牧实业股份有限公司;宜春学院生命科学与资源环境学院
【正文语种】中文
【中图分类】S85
【相关文献】
1.猪支原体肺炎——猪气喘病的诊断与防治措施
2.猪支原体肺炎——猪气喘病的诊断与防治
3.猪支原体肺炎——猪气喘病的诊断与防治
4.猪支原体肺炎\r——猪气喘病的诊断与防治
5.猪支原体肺炎的诊断和防治体会
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猪肺炎支原体MY -99株膜蛋白SDS -PAGE分析及免疫原性研究熊 焰1,孙 霞2,苟 琳1(11四川农业大学动物科技学院,雅安625014;21山东畜牧兽医职业学院,潍坊261061)摘 要:采用T r itonX -100和K I 两种方法分步提取猪肺炎支原体M Y -99株膜蛋白,结果显示,016mol/L KI 溶液具有较好的溶解蛋白质的作用。

经SDS -PA GE 和免疫印迹分析表明,膜蛋白的分子量在14)100KD 之间,其中36K D 和64K D 为保护性抗原。

研究还发现,猪肺炎支原体M Y -99株膜蛋白具有非特异性和特异性的致有丝分裂作用,对T 淋巴细胞刺激的转化率分别为10108%和24175%(P <0105),并能诱导机体产生高效价的抗体,免疫后7d 、14d 和21d 抗体效价达1B 23.50、1B 26.33和1B 27.83。

关键词:猪肺炎支原体;膜蛋白;免疫原性中图分类号:S851162 文献标识码:A 文章编号:0366-6964(2004)01-0074-05收稿日期:2002-11-05基金项目:四川省教育局重点科研项目资助(2001-2004)作者简介:熊焰(1955-),男,四川自贡市人,教授,从事动物微生物及免疫学方面研究。

粘附作用是猪肺炎支原体侵袭宿主呼吸道的关键性步骤[1,2]。

猪肺炎支原体主要通过膜蛋白吸附于猪呼吸道上皮细胞表面的纤毛顶端,影响纤毛的运动,并使纤毛顶端折断和脱落,导致纤毛功能丧失,引起猪出现喘气症状[3]。

据Theresa F.Young 等[4,5]报道,不同的肺炎支原体菌株间膜蛋白的成分存在差异。

M arla K.Stevens 等[6]认为肺炎支原体膜蛋白可引起机体细胞免疫应答反应的抑制,即使动物体内存在有较高的抗体水平,免疫效果也不理想。

因此,深入研究猪肺炎支原体膜蛋白的免疫学特性,探讨其免疫机制,对解决猪肺炎支原体免疫难的问题具有十分重要的意义。

1 材料和方法111 猪肺炎支原体菌株及培养猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae )M Y -99株[7]系作者从患病猪肺脏分离。

培养采用支原体干燥培养基(卫生部北京生物制品研究所)。

112 膜蛋白提取、分子量及抗原成分的分析11211 014%Triton X -100提取 猪肺炎支原体M Y -99株培养物用无菌生理盐水洗下,洗涤3次并稀释至3@1010个菌/ml,经10000g 离心收集沉淀。

每毫升沉淀加入少量10%Lysis sucrose 充分混匀,置-20e 15min,再加入等体积的014%Lysis Triton X -100在室温下作用10min,经15000g 离心15min,上清加入215倍体积的冰乙醇,-20e 过夜,再经15000g 离心10min 收集膜蛋白沉淀,4e 保存备用。

11212 016mol/L KI 和118mol/L KI 提取[6]经014%Lysis T riton X -100提取后的沉淀用pH715Tris -NaCl 洗涤1次,加入等体积的016mol/L KI,37e 水浴1h,15000g 离心10min,上清按11211方法处理。

剩余沉淀再用pH 715T ris -NaCl 洗涤1次,加入等体积的118mol/L KI,按上述方法继续进一步提取膜蛋白。

11213 膜蛋白分子量的测定 采用SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳法[8],浓缩胶浓度为418%,分离胶浓度为1215%,开始电泳电压为165V,等指示剂进入分离胶后,电压调整为150V,凝胶板用考马斯亮蓝染色。

标准蛋白分子量为14-97KD(上海丽珠东风生物技术有限公司)。

11214 膜蛋白抗原成分的分析 采用Western -blotting 法[8],转移电泳液为Tris -192mmol/L 甘氨酸缓冲液(pH813),电压70V,电流2mA/cm,电泳时间为12h 。

转印NC 膜为Pal-l Gelm an 产品(购自北方同正公司),抗猪肺炎支原体MY -99株高免血清自制。

113 T 淋巴细胞转化试验11311 膜蛋白免疫原制备 支原体肉汤培养物经10000g 离心15m in,洗涤3次,沉淀加入等体积的生理盐水,经反复冻融后以15000g 离心10min 取畜牧兽医学报,2004,35(1),74-78A cta Veterinar ia et Zootechnica Sinica上清,上清液于56e 处理30m in,用751紫外分光光度计测定膜蛋白的浓度,-20e 保存备用。

11312 免疫接种 试验分2组,试验组6头,对照组3头,均为30日龄的断奶仔猪。

试验组每头猪于颈部肌肉接种1ml 含有弗氏完全佐剂的支原体膜蛋白抗原(10mg/ml),对照组接种等量不含支原体膜蛋白抗原的无菌生理盐水与弗氏完全佐剂的混合液。

首次免疫2周后再加强免疫1次。

11313 淋巴细胞的分离培养与转化率测定 分别于0d 、14d 和21d 采血,离心分离淋巴细胞并培养。

采用T 淋巴细胞转化试验形态学方法[9],每个样品计数200个淋巴细胞,计算T 淋巴细胞的转化率。

114 抗体检测于免疫后7d 、14d 和21d 采血分离血清,采用间接ELISA 方法[8]检测血清样品,测定490nm 的OD 值,用Ex cel 软件分析绘制抗体消长曲线。

2 试验结果211 猪肺炎支原体MY -99株膜蛋白的分子量和抗原成分的分析21111 膜蛋白SDS -PAGE 分析 014%T riton X -100和016mol/L 、118mol/L KI 提取的膜蛋白条带经半对数的方法计算,分子量范围在14-100KD 之间,如图1所示。

21112 膜蛋白免疫印迹分析 用兔抗猪肺炎支原体M Y -99株高免血清(自制)与膜蛋白的转印膜反应,在分子量为36KD 和64KD 的条带处出现肉眼可见的桔黄色斑点。

212 T 淋巴细胞转化结果免疫前T 淋巴细胞的转化率为10108%、免疫后14d 为15175%、21d 为24175%,免疫前后相比P <0105。

对照组(PHA)与试验组(膜蛋白)相比,对照组的T 淋巴细胞转化率明显高于试验组,但各对照组免疫前后的T 淋巴细胞转化率变化不明显,见表1。

213 抗体检测经酶联免疫检测仪测定各试验组OD 490值(见表2)。

将试验组的平均OD 值(见表3)作为纵坐标,血清稀释倍数取以2为底的对数值作为横坐标,绘制OD 值与血清稀释倍数的关系曲线,见图2。

从图2的曲线可以看出抗体的滴度与免疫时间呈正相关。

以P/N 比值(待测样品的OD 值与阴性样品OD 值的比值)大于115作为阳性标准,从表4可看出免疫后7d 、14d 和21d 的血清效价分别达到了1B 23150、1B 26133和1B 27183。

3 讨 论311 Triton X -100常用于裂解细菌细胞壁,低浓度的Triton X -100作用较温和,一般不会破坏蛋白质的构象、生物活性和抗原性,但对蛋白质的溶解作用不完全。

比较T riton X -100和KI 提取物SDS -PAGE 条带可以看出,KI 能从Triton X -100处理后的溶液中提取残留的膜蛋白,并且条带色深、清晰,说明Triton X -100的提取效果不彻底,而KI 溶液具有较好的溶解蛋白质的作用[10]。

016mol/L KI 与118mol/L KI 溶液提取物相比,后者的条带色淡、不清晰,说明016mol/L KI 溶液已基本能满足提取膜蛋白的需要。

1期熊 焰等:猪肺炎支原体M Y -99株膜蛋白SDS -PA GE 分析及免疫原性研究75表1T淋巴细胞转化试验结果Table1The results of T lymphocyte transformation test样品Sample 123456平均转化率Average of conversion0(d)试验组T est gr oup对照组Control g roup8.5%11.5%9%10%12%9.5%10.08%43%41.5%39.5%)))41.33%7(d)试验组T est gr oup对照组Control g roup18%14.5%13.5%16%17.5%15%15.75%38%40%42.5%)))40.17%14(d)试验组T est gr oup对照组Control g roup23.5%27%25%26.5%22.5%24%24.75%39%44%41%)))41.33%表2膜蛋白免疫后不同时间抗体水平的测定结果(OD值)Table2The detecting results for antibody af ter immuned by the membrane protein in virous time(OD value) 1B201B211B221B231B241B251B261B271B281B291B2101B2117(d)1 1.200.850.700.550.360.320.270.180.150.130.110.102 1.090.800.650.620.470.340.260.240.150.130.120.10 30.880.550.350.340.330.310.280.250.150.140.100.094 1.170.870.600.540.460.380.340.200.180.170.130.065 1.040.740.690.470.460.430.340.240.190.150.100.05 60.980.680.540.440.350.260.220.150.140.130.120.11 70.250.230.220.200.190.150.140.100.090.060.050.01 80.200.170.160.150.120.110.090.080.040.010.000.00 90.230.180.170.150.110.070.050.030.020.000.000.0014(d)1 1.56 1.53 1.50 1.49 1.47 1.300.920.650.400.300.250.202 1.53 1.52 1.47 1.050.590.400.350.310.300.280.240.213 1.50 1.47 1.45 1.40 1.150.890.580.340.250.220.210.204 1.53 1.42 1.28 1.020.670.450.390.230.190.180.160.135 1.56 1.53 1.300.960.660.440.410.390.330.250.230.226 1.62 1.39 1.140.790.700.460.380.270.260.240.210.19 70.210.170.130.070.050.040.010.000.000.000.000.00 80.220.110.090.050.010.000.000.000.000.000.000.00 90.190.080.070.050.020.010.000.000.000.000.000.0021(d)1 1.66 1.62 1.61 1.58 1.49 1.35 1.140.840.460.390.310.252 1.66 1.58 1.55 1.47 1.33 1.170.770.480.360.310.260.253 1.62 1.60 1.59 1.56 1.52 1.39 1.140.720.460.340.280.234 1.62 1.58 1.55 1.44 1.28 1.170.850.550.390.290.260.215 1.65 1.63 1.47 1.35 1.20 1.140.790.660.370.330.320.296 1.67 1.61 1.58 1.49 1.47 1.38 1.090.910.450.320.270.24 70.150.090.080.060.050.030.020.010.000.000.000.00 80.250.210.170.110.070.040.010.000.000.000.000.00 90.180.160.050.040.010.000.000.000.000.000.000.00注:阳性对照O D值为1198,阴性对照OD值为0125,1~6为试验猪,7~9为对照猪Indication:Positive control OD value1198,Negative control OD value0125,Test group1-6,Control group7-9.76畜牧兽医学报35卷表3不同时间试验组抗体OD值的平均值Table3The average antibody OD value of test groups in various time1B201B211B221B231B241B251B261B271B281B291B2101B211 7d 1.060.750.590.490.410.340.290.210.160.140.110.09 14d 1.55 1.48 1.31 1.120.870.660.510.370.290.250.220.19 21d 1.65 1.60 1.56 1.48 1.38 1.270.960.690.420.330.280.25表4膜蛋白免疫后不同时间猪血中抗体的平均滴度Table4The average antibody titer in blood f or various tim e after immuned by the m embrane protein采血时间T ime 检测头数N umbers抗体滴度Antibody titer1B211B221B231B241B251B261B271B281B29平均滴度Av erag e titer7(d)61021200001B23.50 14(d)60000131101B26.3321(d)60000002311B27.83312从SDS-PAGE和免疫印迹结果分析,猪肺炎支原体MY-99株的膜蛋白分子量在14KD~100 KD之间,其中分子量为30KD和64KD的条带与抗血清呈现肉眼可见的桔黄色斑点。

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