发根农杆菌介导抗菌肽Shival基因转化马铃薯的初步研究

发根 农杆 菌介导抗菌肽 Ｓ ｉａ 基 因转 化马铃 薯 的初步研 究 ｈｖ ｌ
刘春 元 ， 殷宪平 ， 邢小萍
（河 南 农业 大 学 植 物 保 护 学 院 ，河 南 郑 州 ， ４ ００ ５０ ２）
摘
要 ：利用 已构建栽体 ５ ０Ｓ ｉ ，转化马铃薯普通栽培种 甘农薯 ｌ 、澳布 、Ｈ Ｓ和夏波 蒂的试 管苗及 块 ３ ｈｖ ａ 号 Ｌ
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发根农杆菌介导抗菌肽 Ｓ ｉａ基 因转化 马铃薯 的初步研究——刘春元 ，殷宪平 ，刑小萍 ｈｖｌ
中图 分 类 号 ：￥ ３ ５２
文献标识码：Ａ
文 章 编 号 ： １７ — ６ ５ ２ ０ ） ６ ０ ４ — ５ ６ ２ ３ ３ （０６ ０ — ３ １０
过 伤 口传染 ，常 规 防 治难 度 较 大 ，费 时 耗 力 ，防
进行遗传研究 的科研工 作 比较多 ，而且这项转化
工作 将 越 来 越 受 到 人 们 的关 注 【５ ２１ 研 究 运 用 发 －。本 根 农 杆 菌 （ 有 Ｒ 质 粒 ） 导 将抗 菌肽 ｓｉａ 入 含 ｉ 介 ｈｖｌ导 马铃 薯外 植体 材 料 中 。
茎盘的研 究。结果表明 ，以 Ｋ ｎ５ ｇ Ｌ ａ ０ｍ ・ 和 １０ｍ ・ 作为筛选转基 因细胞 和植株的 剂量 。对 于发根农杆 菌侵 ０ ｇＬ 染马铃薯试管苗应采 用新鲜 茵落直接涂抹 伤 口进行侵 染 ，这种方法诱导生根率 高且 易于操作 ，根诱 导率、成愈 率 及分化率远高于浸 泡法；发根农杆 菌转化 试管苗 ，后期愈伤组织分化产 生 ５个幼苗。发根农 杆菌茵液侵染甘农薯 ｌ 号和夏波蒂两品种的块 茎盘 ，７ｄ后就 有很 小的毛状根 突起产生 ，２周后 即有大量毛状根产生 ，３周后 毛状根 产 生量有所减 少，产 生的毛状根 ３周 时其成愈 率分别为 ３ ．％和 ２ ． １ Ｏ ７Ｏ ％，愈 伤组织分化成 苗比较 困难 ，分化 出 ３个 幼苗，分化 率分别为 ６４ ％和 ３ ０ ． ５ ． ％。转化材料进行 冠瘿碱检测表 明，分化苗均 为胭 脂碱 阳性反 应。环腐病菌接 ７ 种试 管苗结果表明 ，分化植株与对照相 比抗性明显增强。
１１ 供试 菌株 ．． ２
操作过程 中，利用农 杆菌作为介体进 行介导转移 的实例 占绝大多数 。究其原 因主要 是利用土壤杆
菌具有质粒（ｉ Ｒ ） Ｔ 或 ｉ，转 化 植 物 后 可 以使 植 物 产 生 冠 瘿 瘤 或 毛 状 根 ，冠 瘿 瘤 和 毛状 根 都 容 易 再 生 植 株 ，所 以在 基 因工 程 研 究 过 程 中人 们 将 Ｔ、Ｒ ｉ ｉ 质粒 作 为基 因工 程载 体 。 目前 ，运 用 Ｔ 或 Ｒ 质粒 ｉ ｉ
关 键 词 ：发 根 农 杆 菌 ；Ｓ ｉａ ； 转化 ；马 铃 薯 ｈｖ ｌ
在农业生产 中，马铃薯受到多种病害的危害 ，
仅 细菌 性 病 害 造 成 的损 失 占年 产 量 的 ２ ％，约 合 ５ ４ ０亿 美 元 【。马 铃 薯 环 腐 病 在 所 有 的 马 铃 薯 栽 培 １ １ 种 和一 些 野 生 种 上 都 严 重 发 生 ，病 原 细 菌 主 要 通
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中国马铃 薯，第 卷 ，第 ６期 ，２ ０ ｌ ０７
恒温 箱 中培养 。
１ ． 茵液 的制备 ．２ ２
理 ３皿 ，用 Ｐ ｒｆｍ膜 封 口 。以 无农 杆 菌 的 Ｌ ａａｉ ｌ Ｂ液 浸泡 为对 照 。然 后将 封好 的培 养皿 放在 ２ ℃ 、光强 ５ 为 ２００ｌ、光照 ｌ ／ ０ ｘ ４ｈ黑暗 ｌｂ的光照 培养 箱 中培 Ｏ
治效 果 有 一定 的局 限性 ，所 以 利 用 抗 病 品种 来 防 治 此病 害 是最 经 济 、最 有 效 的 途 径 ，但 目前 还 没 有 免疫 和 高抗 品种 ，用 常 规 育 种 选 育 马铃 薯 抗 病
品 种 十 分 困 难 ，而近 年 发 展 迅 速 的 基 因工 程 技 术
１ ． 试 验方 法 ２
１ ． 农杆 菌的 培养 ．１ ２
作者简介 ：刘春元 （ ９ ２ ）女 ， １６ 一 ， 高级实验 师 ， 硕士 ， 主要 从事植
物病害防治研究 。 通讯作者 ：Ｅ ｍａ： ｘ ｌ． ６ ． ｍ． － ｉ ｘｐ ６ ＠１３ｃ ｌ ８ ｏ
将各 菌株 在 相应加 了激素 的培 养基 上平 板 划线 培养 ，每 ３ 划线一次 ，挑取生长好的单菌落连 ６ｈ 续 划 线 ２ ３次进 行 菌 种 活 化 培 养 ，培 养 皿 置 ２ ℃ ～ ８
收稿 日期：２ ０ — ６ ｌ ０７０ 一８
本 试 验 所用 的 农杆 菌 菌 株 （ ０ ０ 含有 改 建 质 Ｒ１０ ）
粒 ５ ０ Ｓ ｉ ，所 携 带 目的 基 因 为 Ｓ ｉ ｌ ３ ｈｖ ａ ｈｖ ，报 告 基 ａ
因是新霉素磷酸转移酶基因（ Ｐ Ⅱ） Ｎ Ｔ 和胭脂碱合成 酶基 因 。 由中国农业 科学 院生物 工程 中心 提供 。
程 植 物 已取 得 较 大 的 进 展 。而 在 大 量 的基 因工 程
料试 管苗 、茎 段 、块茎 作 为外植 体 材料 。 试 管苗 采用 切段保 存 和繁 殖 ，将带 有 ２ ３个腋 ～
芽 的茎段 扦插 于 Ｍ ０培养基 上 ，置 于 ２ 左 右 ， Ｓ ５ 室 内散 射光下 培 养和保 存 ，每 月继 代繁 殖一 次 。
ｌ 材 料与方法
１１ 供试材 料 ． Ｉ１ 植 物材 料 ．． １
甘农 薯 １ 、澳 布 、Ｈ Ｓ 号 Ｌ 、夏 波 蒂 。用 上述 材
则 为 马 铃 薯抗 病 育 种 开 辟 了 广 阔 的 途 径 。 随着 基 因工 程 技 术 的 发 展 ，人 们 利 用 该 技 术 进 行作 物 品 质 的改 良 ，培 育 出抗 病 、抗 虫 、抗 逆 性 较 强 的 工