SPR技术简介

SPR基本原理
当入射光波长固定时， 反射光强度是入射角的 函数，其中反射光强度 最低时所对应的入射角 称为共振角
SPR检测原理
SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感 ,当表面 介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此， SPR 谱（共振角的变化 vs 时间）能够反映与金属膜表面接 触的体系的变化。
SPR原理
什么是等离子体？
等离子体 = PLASMA = 电浆 等离子体通常指由密度相当高的自由正、负电荷 组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等 ，是 物质存在的一种状态，与固态、液态和气态并列，称 为物质的第四态。宇宙中大部分物质处于等离子状态。
等离子体的发现：
1879年，英国物理学家 William Crookes----物质第四状态 1929年，美国化学物理学家 Langmuir----等离子体
表面等离子体波（Surface plasma wave，SPW）
表面等离子体振动产生的电荷密度波，沿着金属和 电介质的界面传播，形成表面等离子体波，其场矢量在 界面处达到最大，并在两种介质中逐渐衰减。表面等离 子体波是TM极化波，即横磁波（Transverse Magnetic mode），其磁场矢量与传播方向垂直，与界面平行，而 电场矢量则垂直于界面。
多波长SPR成像
a 630 nm，b 690 nm，c 750 nm.
Rev. Sci. Instrum. 2000, 71: 3530-3538
SPR-MS
Anal. Chem. 2000, 72,4193-4198
SPR-MS
Anal. Chem. (2000) 404 A-411 A
微型化
SPR缺点
1. 难以区分非特异性吸附 2. 对温度、样品组成等干扰因 素敏感
SPR技术发展动态
1. 提高检测灵敏度
2. 高通量检测（SPR imaging）
3. 与质谱等高分辨仪器联用
4. 敏感器件及测量装置的微型化
提高SPR检测灵敏度的方法
• 纳米技术的应用
以纳米粒子作为载体，夹心法测定
• 采用新型检测方法
对生物分子进行识别及定量检测 研究生物分子间的相互作用
用SPR可获得的信息：
1. 两个分子之间结合的特异性
2. 目标分子的浓度 3. 结合以及解离过程的动力学参数 4. 结合的强度
Applications in life science research
Elucidate the function of novel proteins in proteomics
传感器的基本原理
• 表面等离子体子共振的产生与入射光的角度θ、波长、 金属薄膜的介电常数s及电介质的折射率ns有关，发生共 振时θ和分别称为共振角度和共振波长。对于同一种金 属薄膜，如果固定θ，则与ns有关；固定，则θ与ns有 关。
• 如果将电介质换成待测样品，测出共振时的θ或，就可 以得到样品的介电常数s或折射率ns；如果样品的化学或 生物性质发生变化，引起ns的改变，则θ或也会发生变 化，这样，检测这一变化就可获得样品性质的变化。
Biacore 2000 Dimensions: 760 x 350 x 610 mm Net Weight: 50 kg Spreeta 2000
微流控SPR芯片
The Integrated microfluidics Cartridges used in the Biacore®3000
SPR的应用
1902年，Wood在光学实验中发现SPR现象 1941年，Fano解释了SPR现象 1971年，Kretschmann结构为SPR传感器奠定了基础 1983年，liedberg将SPR用于IgG与其抗原的反应测定 1987年，Knoll等人开始SPR成像研究 1990年，Biacore AB公司开发出首台商品化SPR仪器 ••• •••
分子敏感膜
成膜方法： 1. 金属膜直接吸附法 2. 共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖凝 胶、水凝胶、高分子膜、多肽等） 3. 单分子复合膜法 4. 分子印膜技术
SPR的优点
1. 待测物无需标记
2. 适用于混浊、不透明或者有色溶液 3. 能实时、连续监测反应动态过程 4. 检测方便、快捷
5. 应用范围广
SPR传感器的基本结构
1. 光波导耦合器件 2. 金属膜 3. 分子敏感膜
光波导耦合器件
Krestschmann 棱镜型 光栅型
光纤在线传输式
光纤终端反射式 Otto棱镜型 金属膜 分子敏感膜
金属膜
反射率高 化学稳定性好
Au 膜和Ag 膜是SPR 中最常用的两种金属薄膜
膜的厚度：50-100nm
different conditions, for example, health, disease, drug treatment
Investigate the binding properties of protein isoforms Find antagonists to critical binding events Identify disease markers in clinical samples Optimize therapeutic antibodies Evaluate ion selectivity in signaling pathways Identify DNA damage – mutations, DNA adducts etc
界面12spr基本原理它利用p偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时渗透到金属薄膜内的消失波引发金属中的自由电子产生表面等离子体子当表面等离子体与消失波的频率相等时二者将发生共振界面处的全反射条件将被破坏呈现衰减全反射现象入射光被金属表面电子吸收使反射光能量急剧下降13spr基本原理当入射光波长固定时反射光强度是入射角的函数其中反射光强度最低时所对应的入射角称为共振角14spr检测原理spr对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感当表面介质的属性改变或者附着量改变时共振角将不同
4种检测方式
1. 角度调制：固定λ 2. 波长调制：固定θ
in，改变θ in in
，改变λ
in
3. 强度调制：固定θ
4. 相位调制：固定θ
in
in
、λ
、λ
in，改变光强
in，测相差
• 一个SPR传感器的主要性能特点，如灵敏度、稳定性、分辨率、选择性 和响应时间等，取决于其各个组成部分的性能。
• SPR传感器使用时，一般是先在金属薄膜表面修饰一层敏感物质，以便 与样品中的待测组分选择性地作用。这一相互作用会引起敏感层折射率 的改变，导致SPR信号的变化，从而获得待测样品的化学或生物信息。 如果不对金属薄膜进行修饰，这样的传感器也可用于一些简单体系的检 测，如一些浓度随折射率变化的溶液（乙醇、蔗糖、葡萄糖等的水溶 液）。金和银相对来说比较稳定，且反射率高，是比较常用的两种金属。 在生物体系的测量中，常常有氯离子存在，用银膜不太合适，一般都用 金膜。
表面离子体共振 Surface plasmon resonance
组员：
Outline
• SPR技术简介 • SPR仪器介绍 • SPR应用
• SPR技术简介
1.表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）， 又称表面等离子体子共振，表面等离激元共振，是一种物理 光学现象，有关仪器和应用技术已经成为物理学、化学和生 物学研究的重要工具。 2.发展概史
全反射
菲涅尔定理： n1
当光从光密介质射入 光疏介质（n1＞n2）， 入射角增大到某一角 度，使折射角达到 90°时，折射光将完 全消失，而只剩下反 射光，这种现象叫做 全反射。
sinθ1 = n2 sinθ2
密
疏
密
疏
消逝波
密
界面
疏
当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射 光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质 约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介 质，而光的总能量没有发生改变。则透过光疏介质的波被称 为消逝波。
棱镜耦合
棱镜是SPR研究中应用最为广泛的光学耦合器件。棱镜由高折射率的非 吸收性的光学材料构成，其底部镀有厚度为50nm左右的高反射率的金属薄 膜（一般为金或银），膜下面是电介质。在SPR传感器中，该电介质即为待 测样品。由光源发出的p-偏振光以一定的角度θ0入射到棱镜中，在棱镜与 金属的界面处将发生反射和折射。当θ0大于临界角θc时，光线将发生全 内反射，即全部返回到棱镜中，然后，从棱镜的另一个侧面折射出去。这 里入射光应当用p-偏振光，因为其电场分量与界面垂直，这与表面等离子 体波的情况一致。
什么是金属等离子体？？？
在金属中，价电子为整个晶体所 共有，形成所谓费米电子气。价电 子可在晶体中移动，而金属离子则 被束缚于晶格位置上，但总的电子 密度和离子密度是相同的，从整体 来说金属是电中性的。人们把这种 情况形象地称为“金属离子浸没于
电子的海洋中”。这种情况和气体
放电中的等离子体相似，因此可以 把金属看作是一种电荷密度很高的 低温（室温）等离子体，而气体放 金属板中电子气的位移 （上）金属离子（+）位于“电子海洋”中（灰 色背景），（下）电子集体向右移动
等离子体成分，对外呈现电中性
等离子体是由大量带电粒子组成的非凝聚系统，它的 主要特征是： 1、离子间存在长程库仑作用。 2、等离子的运动与电磁场的运动紧密耦合，形态和 性质受外加电磁场的影响强烈。 3、存在极其丰富的集体效应和集体运动模式(如各种 静电波、漂移波等)。 4、等离子体对边界条件十分敏感。
• 固定入射光的波长，改变入射角，可得到角度随反射率变 化的SPR光谱；同样地，固定入射光的角度，改变波长， 可得到波长随反射率变化的SPR光谱。SPR光谱的改变反映 了体系性质的变化。
传感器的基本结构
• 一般来说，一个SPR传感器的包括：光学系统、敏感元件、数据采集和 处理系统。
• SPR传感器的光学部分包含光源、光学耦合器件、角度（或波长）调节 部件以及光检测器件，用于产生SPR并检测SPR光谱的变化。 • 敏感元件主要指金属薄膜及其表面修饰的敏感物质，用于将待测对象的 化学或生物信息转换成折射率的变化，是SPR传感器的关键。从SPR的 原理可知，实际上是样品的折射率的变化引起SPR光谱的变化。如果金 属薄膜未经任何修饰，这样的传感器是没有什么选择性的，只能用于一 些简单体系的测定，因而一般都要进行修饰，以获得对被测对象的选择 性识别能力。 • 数据采集和处理系统用于采集和处理光检测器产生的电子信号。现在光 检测器越来越多地采用阵列检测器，如光电二极管阵列和电荷耦合器件， 以便同时检测多个角度或波长处的信号变化。数据采集和处理均由计算 机完成。
research
Identify binding partners to any target molecule – ligand
fishing
Determine
function
the nature of protein complexes and their
Unravel the intricate molecular interactions involved in
光声光谱( PAS) 、光热偏转光谱(PDS)、反 射干涉光谱、Ellipsometric Microscopy、电化 学法
微流控多通道SPR检测
Hale Waihona Puke Anal. Chem. 2001,73: 5525-5531
SPR扫描显微镜
Optics Communications 2000, 182 : 11–15
SPR基本原理
它利用 P 偏振光在玻 璃与金属薄膜界面 处发生全内反射时 渗透到金属薄膜内 的消失波 , 引发金属 中的自由电子产生 表面等离子体子, 当表面等离子体与 消失波的频率相等 时 , 二者将发生共振 , 界面处的全反射条 件将被破坏, 呈现衰 减全反射现象，入 射光被金属表面电 子 吸收 , 使反射光能 量急剧下降
cell signaling pathways
Study
membrane associated molecules in near native environments
Applications in life science research
Determine expression levels of selected proteins under
电中的等离子体是一种高温等离子
体，电荷密度比金属中的低。
等离子波
电子间相 互斥力
正电荷过 剩区域
库仑力
e
引力斥力 平衡点
当金属受到电磁干扰时，金属中的电子密度分布就会变得不均匀。 设想在某一区域电子密度低于平均密度，那么就会形成局部的正电荷 过剩。这时由于库仑引力作用，会把近邻的电子吸引到该区域，而被 吸引的电子由于获得附加的动量，又会使该区域聚集过多的负电荷， 然而，由于电子间的排斥作用，使电子再度离开该区域，从而形成价 电子相对于正电荷背景的起伏振荡。由于库仑力的长程作用，这种局 部的电子密度振荡将形成整个电子系统的集体振荡，即等离子震荡， 并以密度起伏的波的形式来表现，称为等离子波。