fugene 4k 转染试剂中文说明书

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2022版 CTM694原英文技术手册
TM694
中文说明书
适用产品目录号：
E5911和E5912
FuGENE ®
4K Transfection
Reagent
普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909
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1. 描述 (2)
2. 产品组分和储存条件 (2)
3. 一般注意事项 (2)
3. A. 转染试剂与DNA的比例 (3)
3. B. DNA (3)
3. C. 时间 (3)
3. D. 血清 (3)
3. E. 细胞培养条件 (3)
3. F. 稳定转染 (3)
4. 推荐操作步骤 (4)
4. A. 细胞铺板 (5)
4. B. FuGENE® 4K Transfection Reagent准备 (5)
4. C. 一般转染操作步骤 (6)
4. D. 稳定转染操作步骤 (8)
4. E. 转染优化 (9)
4. F. 报告基因活性和细胞健康的多重检测方案 (11)
5. 疑难解答 (12)
FuGENE® 4K Transfection Reagent
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21. 描述
FuGENE® 4K Transfection Reagent是一个多组分，非脂质体试剂，用于将DNA高效、低毒地转染至多种哺乳动物细胞系中，无需在加入试剂-DNA复合物后更换培养基。

FuGENE® 4K Transfection Reagent在有血清或无血清的情况下均可发挥作用，并且适用于瞬时和稳定转染。

2. 产品组分和储存条件
产品规格目录号FuGENE® 4K Transfection Reagent
1ml E5911
5 × 1ml E5912
1 mL规格含有足量试剂可转染333 μg DNA。

这相当于以3：1的FuGENE® 4K Transfection Reagent：DNA比例，在96孔板中进行3300个孔的转染实验（每孔0.3 μl试剂：100 ng DNA）。

实际转染次数因试剂：DNA的比例、转染体积和细胞类型而异。

储存条件：将FuGENE® 4K Transfection Reagent储存在＋2℃至＋10℃。

使用后盖紧盖子。

防止在0℃以下冷冻或储存；成分可能会沉淀。

如果试剂意外冷冻，在37℃下短暂加热以溶解沉淀物。

配方和包装：FuGENE® 4K转染试剂是一种100%合成、专有脂质和其他成分混合物，储存于70%乙醇中。

该转染试剂已经过无菌过滤，并储存于无菌玻璃瓶中。

FuGENE® 4K Transfection Reagent不含有任何人源或动物源成分。

特殊处理：在使用前，请将FuGENE® 4K Transfection Reagent平衡至室温，并通过颠倒或涡旋简单混匀。

试剂中不应有可见的沉淀物。

使用标准24孔组织培养板作为FuGENE® 4K Transfection Reagent的架子。

始终将FuGENE® 4K Transfection Reagent直接稀释到培养基中，避免未稀释的试剂与塑料管直接接触。

不要使用硅化移液器吸头或试剂管。

不要将FuGENE® 4K Transfection Reagent从原始玻璃小瓶中分装到其他容器。

FuGENE® 4K Transfection Reagent 也可以预先稀释到转染培养基中，但应立即添加到DNA溶液中以形成转染复合物。

3. 一般注意事项
成功的转染包括优化FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比例、使用的DNA量、形成复合物时间、使用的细胞和培养基等。

详细的优化方案见4.E.章节。

具有报告基因功能的质粒可用于监测转染效率。

理想的报告基因是细胞独具的，可以通过质粒DNA表达并很方便检测。

通常，报告基因检测在转染后1-2 天进行。

萤光素酶、绿色荧光蛋白(hMGFP)和β-半乳糖苷酶以及共价蛋白标签（HaloTag®蛋白）等报告基因及相关检测方法都可以从获得。

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3.A. 转染试剂与 DNA 的比例
要将DNA成功转染到培养细胞中，必须优化FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比例（参见4.E章节）。

FuGENE® 4K Transfection Reagent（μl）与 DNA（μg）的比例设置为3：1至5.5：1，对于许多细胞系适用。

但是，对于其他细胞类型或应用，也可能超出此范围的比率是最佳的。

3.B. DNA
用于转染的质粒DNA应不含蛋白质、RNA和化学污染（A
260
/A280比率应为1.7-1.9）。

PureYield TM Plasmid Purification Systems可为大多数细胞系统提供足够质量的DNA。

在无菌的水或TE缓冲液中制备纯化的DNA，终浓度为0.2-2mg/ ml。

质粒DNA浓度必须通过260nm下的吸光度准确测定。

根据所用的DNA类型和靶细胞系的不同，用于转染的最佳DNA量会有很大差异。

对于贴壁细胞，我们建议最初以4：1和3：1的FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比例，在96孔板中测试每孔100 ng DNA。

增加DNA的量并不一定会产生更高的转染效率。

3.C. 时间
FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA复合物的形成所需时间是在22℃下处理5-15分钟。

在检测前将转染的细胞孵育24-72小时，以便有时间表达转染的DNA。

3.D. 血清
转染操作步骤通常需要用无血清条件以获得最佳性能，因为血清会干扰许多市售的转染试剂。

FuGENE® 4K Transfection Reagent可用于有血清条件下的转染操作步骤，用于转染需要持续接触血清的细胞类型，例如原代细胞培养物。

然而，试剂-DNA复合物需要在没有血清的情况下形成。

3.E. 细胞培养条件
在细胞系培养过程中可以使用抗生素。

然而，转染过程中抗生素的存在可能会对转染效率和转染细胞的整体健康产生不利影响。

我们不建议在转染培养基中使用抗生素，除非之前在被转染的细胞类型中进行了测试。

为了尽量减少转染效率的实验内和实验间差异，请使用增殖良好（最好处于对数生长期）、已定期传代并以一致的密度接种以便在转染当天达到50-90%汇合度的细胞。

3.F. 稳定转染
FuGENE® 4K Transfection Reagent可用于生产稳定的转染子。

但是，我们建议在使用选择性压力生成稳定的转染子之前使用瞬时转染研究优化转染条件。

transfection conditions for a particular cell type.
1
8
1
3
9
M
A
GloMax Discover System
Dilute DNA in serum-free medium
on the day of transfection.
Plate cells one day prior to
transfection.
Add FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA
mixture to cells, and mix gently.
Incubate for 24–72 hours.
Measure experimental results.
Add FuGENE® 4K Transfection Reagent.
Incubate for 5–15 minutes.
4. 推荐操作步骤
图1提供了转染步骤的概述，我们建议使用96孔板形式来优化特定细胞类型的转染条件。

在转染前一天进行细胞铺板。

转染当天在无血清培养基中稀释DNA。

加入FuGENE® 4K Transfection
Reagent。

孵育5-15分钟。

加入FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA
混合物于细胞中，并且轻柔混匀。

孵育24-72小时。

读取试验结果。

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用户提供的材料
• 适合被转染细胞类型的含血清的细胞培养基
• 用于复合物形成的不含血清的细胞培养基（可用Opti-MEM ® I reduced-serum medium 、standard medium 或无菌水）• 96孔或其他培养板
• 用作FuGENE ® 4K Transfection Reagent 支架的24孔培养板。

• 无菌TE （Tris EDTA ）溶液或无菌水溶解的质粒DNA 溶液（0.2-2.0μg/μl ）。

4.A. 细胞铺板
转染前一天将贴壁细胞铺板，使细胞在转染当天达到50-90%汇合度。

悬浮细胞可以在转染当天铺板。

作为通用指导，在96孔板的每孔中加入1-3×104个贴壁细胞或2.5-5×104个悬浮细胞，每孔100μl 。

针对不同尺寸的培养板按比例调整细胞数量（参见表2）。

要制备细胞，请收集足够完成转染实验的数量的细胞，并在吊篮式转子中以300×g 离心5分钟。

将细胞沉淀在培养基中以适当浓度重悬，然后铺板。

表2.用于细胞生长的培养板面积。

4.B. FuGENE ® 4K Transfection Reagent 准备
1. 使用前，将小瓶FuGENE ® 4K Transfection Reagent 和稀释液平衡至室温。

2. 通过短暂颠倒或涡旋混匀FuGENE ® 4K Transfection Reagent 。

试剂中不应有可见的沉淀物。

如果试剂意外冻结并观察到沉淀，则在37°C 下短暂加热以溶解沉淀，然后冷却至室温。

1此信息是针对Corning ®培养皿计算得出的。

2相对面积表示为推荐用于优化研究的以96孔板的总生长面积为基础的一个因子（即相对于96孔板每一孔的生长面积的倍数）。

要确定适当的贴壁细胞铺板密度，请将1-3×104
细胞乘以该因子。

培养板规格生长面积(cm 2)1相对面积2
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64.C.
一般转染操作步骤
我们强烈建议您优化每个细胞系的转染条件。

如果您已如第4.E章节所述优化转染参数，请使用由经验确定的条件进行实验转染。

如果您选择不优化转染参数，请使用下面推荐的一般条件。

注意：以下方案是转染大约10-50个孔的指南，具体取决于所用的FuGENE® 4K Transfection Reagent/DNA混合物的体积。

如使用其他数量的孔，需相应调整体积。

1. 96 孔板每孔添加的无血清培养基、DNA和FuGENE® 4K Transfection Reagent的总体积为 2-10 μl（表 3）。

向无
菌管或U型或V型底板中加入 90-98 μl预热至室温的培养基，使加入DNA后的最终体积为100 μl。

加入2 μg的质粒 DNA（0.2-1 μg/μl）于培养基中，并通过涡旋或移液器混合。

对于FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比例为4：1的，加入8 μl的FuGENE® 4K Transfection Reagent并立即混合。

直接加入FuGENE® 4K Transfection Reagent至培养基。

不要让未稀释的FuGENE® 4K Transfection Reagent 接触试管或U形或V形底板的侧面。

即使待转染细胞存在于有血清的培养液中，FuGENE® 4K Reagent-DNA复合物也必须在不含血清的培养基中制备。

表3.FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比例为4：1时用于96孔板的培养基、DNA和FuGENE® 4K Transfection Reagent的总体积。

1关于放大更大孔或板的信息，请参见表2和表4。

不同reagent-to-DNA比例的FuGENE® 4K Transfection Reagent体积，请参见表 5。

孔板规格转染总体积（每孔）1DNA用量（每孔）1FuGENE® 4K Reagent用量（每孔）1
2. 将FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA混合物在室温下孵育5-15分钟。

注意：我们建议从15分钟的孵育条件开始测试。

然而，最佳时间可能是5-45分钟，具体取决于所使用的细胞系。

优化孵育时间以获得最佳性能。

3. 将每孔2-10 μl的FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA混合物加入到含有100 μl细胞的96孔板的生长培养基中。

我们建议以5 μl混合物为起点。

以逐滴加入的方式将转染复合物添加到细胞中。

使用移液器吹打、微孔板震荡仪或手动晃动培养板，以确保滴加进培养细胞的试剂-DNA混合物被完全混匀且均匀分布在整个细胞表面。

将细胞放回孵育器并孵育24-72小时。

注意：具体取决于孔板形式和标准实验室操作，总生长培养基体积可能会有所不同。

4. 使用适合报告基因的检测方法测量转染效率。

对于瞬时转染，通常在转染后24-72 小时检测细胞。

all
Us
wo all
Us
wo
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表4.适用于各种培养容器规格的FuGENE ® 4K 转染试剂-DNA 复合物制备指南。

添加到不同培养容器中的起始体积和DNA 比例（基于第4.C.章节所述的方法制备100 μl 转染复合物）。

为获得最佳效果，请以不同比例制备100 μl 复合物，并在优化转染条件时添加不同体积的每种比例的混合物。

表 4列出了建议的接种密度，具体实验时需取决于所用培养基、传代水平、实验室经验和所选细胞系。

转染实验仅使用对数期培养物进行传代培养，并使用适当接种密度进行转染试验。

观察培养物并进行铺板，使单层细胞在转染时达到50-90%的汇合度。

汇合度必须根据经验或预实验确定。

如果您希望在检测时（转染后24-72小时）细胞融合度较低，请尝试接种细胞使它们在转染当天<50%
，并使用较少的转染复合物进行转染。

推荐接种密度推荐的分配到每个孔的100 μl 转染复合物的起加入100 μ l
转染复合物后，在每孔中分配
到的最终的转
染试剂量(µl)
培养容器培养基总体积细胞/孔（贴壁细胞1）细胞/孔（小型或悬浮细胞2）4:1比值3:1
比值1贴壁细胞的推荐接种密度=30,000-70,000细胞每cm 2
2悬浮细胞的推荐接种密度=250,000-500,000细胞每ml
3按比例放大更大容器的总体积
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84.D. 稳定转染操作步骤
稳定转染的目标是分离和增殖含有转染DNA的单个克隆。

因此，有必要将未转染的细胞与引入了外源DNA的细胞区分开来。

当转染的DNA中包含适当的抗性标记时，可以通过药物选择来完成这种筛选。

通常，细胞在转染后在非选择性培养基中培养1-2天，然后接种在选择培养基（含有适当化合物的培养基）中。

用选择培养基持续培养2-3周，频繁更换培养基以消除死细胞和碎片，直到可以看到明显的细胞克隆形成。

然后将单个克隆株用胰蛋白酶消化并转移到烧瓶中用于进一步繁殖，或转移到多孔板中以在选择性培养基存在下进行有限稀释克隆。

几种药物选择标记通常用于长期转染研究。

例如，用含有细菌氨基糖苷(如新霉素)磷酸转移酶基因的重组载体转染的细胞，可以选择在抗生素G-418存在的情况下进行稳定筛选。

类似地，转染的载体中表达潮霉素B磷酸转移酶基因将赋予细胞对药物潮霉素B的抗性。

可在以下网址查找到对G-418、潮霉素B、嘌呤霉素或杀稻瘟素具有抗性的载体：www.
在使用特定药物进行选择之前，请确定杀死您将使用的细胞所需的药物量。

这可能因细胞类型而异。

可使用不同浓度的药物构建杀伤曲线以确定选择抗性克隆所需的药物量。

最佳药物浓度通常是在5-7天内诱导＞90%的未转染细胞死亡的量。

对于稳定的转染，应使用4.C和4.E章节中概述的转染操作步骤，用具有耐药基因的质粒转染细胞。

可选：可使用不含耐药基因的DNA转染细胞作为选择药物阴性对照。

1. 转染后48小时，收获贴壁细胞，并在选择性培养基中以几种不同的稀释度（例如，1：2、1：5、1：10）铺板。

2. 在接下来的 14 天内，每3到4天更换一次选择性培养基。

3. 在第二周，监测不同细胞克隆株中存活的细胞。

在用阴性对照质粒转染的培养物中应该发生完全的细胞死亡。

4. 通过标准技术（例如，使用克隆环或有限稀释克隆）将单个克隆转移到96孔板中，并继续在选择性培养基中持续培养。

注意：如果不需要单个克隆，可以维持稳定转染细胞池并冻存。

对于这个初始优化，在不同的FuGENE ® 4K Transfection Reagent 与DNA 的比率下，每孔使用40-200 ng DNA （表5）。

表5.使用不同比例的FuGENE ® 4K Transfection Reagent 与DNA 的优化方案。

应优化添加的DNA 和FuGENE ® 4K Transfection Reagent 复合物的体积。

我们建议每孔测试2-10 μl ，但其他体积可能是最佳的，具体取决于转染参数。

我们还建议包括以下对照组：
• 仅细胞对照：仅添加培养基（例如 5 μl 纯培养基，不含DNA 及转染试剂）
• DNA 对照：不含FuGENE ® 4K Transfection Reagent 的DNA （例如，5 μl 体积中100ng DNA ）
• 试剂对照：不含DNA 的FuGENE ® 4K Transfection Reagent （例如，5 μl 体积中加入0.4 μl 试剂）
1. 对于96孔板，转染前每孔培养基和细胞的总体积应为100 μl 。

参照表2计算其他每种转染容器所需的复合物总量。

在无菌聚苯乙烯管或 U 型或 V 型底板中，将指定量的培养基（预热至室温）和质粒DNA 混合。

添加指定量的 FuGENE ® 4K Transfection Reagent ，并立即涡旋或通过移液器混匀。

将FuGENE ® 4K Transfection Reagent 直接添加到培养基中；避免让未稀释的FuGENE ® 4K Transfection Reagent 接触管或板的侧面。

如果需要，FuGENE ® 4K Transfection Reagent 也可以在与稀释的DNA 混合之前立即在转染培养基中稀释。

2. 使FuGENE ® 4K Transfection Reagent-DNA 复合物在室温下孵育5-15 分钟。

虽然15分钟是一个很好的初始孵育时间，但可以通过测试5-45分钟之间的不同孵育时间来进一步优化转染效率。

孵育时间超过30分钟会导致转染效
率降低。

培养基终体积1100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 1针对每个比例按照共需要96孔板的20孔（5 μl/孔）的总体积计算
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10图2.用于转染优化的板布局。

4.E. 转染优化（续）
3. 短暂涡旋或混匀FuGENE® 4K Transfection Reagent-DNA复合物。

向含有100 μl生长培养基的96孔板中每孔添
加2-10 μl复合物（参见图2的板布局示例），吹打混匀或使用平板振荡器混匀10-30秒。

将培养板放回培养箱。

对于许多报告系统来说（萤光素酶、CAT、β-半乳糖苷酶等），24-48小时孵育已充足。

4. 使用适合报告系统的检测方法检查转染效率。

如需将报告基因检测与细胞活力或毒性检测相结合进行多重检测，请
参阅第4.F章节。

5. 如果FuGENE® 4K Reagent与DNA的比例为5.5：1这个条件产生了目前最高的转染效率，请使用更高比例的混合
物（例如5.5：1至12：1）重新优化。

同样，如果3：1的比例条件产生了最高的转染效率，请使用更低比例的混合物（例如1.5：1至3：1）重新优化。

(luciferase, CAT, β-galactosidase, etc.) a 24- to 48-hour incubation is sufficient.
C
o
n
t
r
o
l
s
3:1
3.5:1
4:1
4.5:1
5:1
5.5:1
FuGENE® 4K Reagent-to-DNA Ratio
Cells control (medium only)
DNA control
Reagent control
2µl Mix5µl Mix10µl Mix
6. 其他优化参数包括：
• 铺板的细胞数量：铺板更多的细胞将克服过量转染复合物对生长的负面影响。

对于具有特殊生长特性的细胞，不要将此作为优化的第一个参数。

• 转染复合物形成的孵育时间：改变转染复合物形成的孵育时间长度。

将试剂和DNA结合后，在不同时间点向细胞添加复合物（例如5、15和30分钟）。

• 处理敏感细胞：减少接触转染复合物的时间（最多2-3 小时）并更换培养基。

或者，使用较低的试剂与DNA比率，允许复合物形成花费更长的时间，并添加更少的复合物。

说明：
a. 转染试剂与DNA的最佳比例和复合物的最佳总量可能因细胞系、细胞密度、检测日期和表达的基因而异。

b. 在执行了测试多个比率的优化实验后，选择一个处于平台期中间的比率进行未来的实验。

4.F. 报告基因活性和细胞健康的多重检测方案
最佳转染步骤将提供最高的转基因表达和最低的毒性。

通常，96孔板可以提供足够数量的样品孔来进行优化，并为进行细胞平台检测提供相对简单的设计。

为了准确地建立最佳条件，我们发现使用多重检测来测量单个孔中单个样品的细胞存活率和报告基因活性是非常实用的。

使用ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter 和 Cell Viability Assay （目录号：E7110）进行该检测的操作步骤如下：
1. 按照第4.E章节中的说明建立具有不同转染条件的滴定和重复的孔板。

使用一个编码组成型报告基因的质粒DNA，
如pGL4.13[luc2/SV40]载体（目录号： E6681）、pGL4.50[luc2/CMV/Hygro]载体(目录号：E1310)或pGL4.51[luc2/ CMV/Neo]载体(目录号：E1320)。

2. 孵育细胞24-48小时。

3. 向所有孔中加入20μl CellTiter-Fluor™ Reagent（由在2 ml Assay Buffer中加入10 μl底物制备），并通过回旋振
荡器短暂混合（300-500rpm，约30秒）。

在37℃孵育至少30分钟。

注意：更长的孵育时间可以提高检测灵敏度和动态范围。

然而，不要孵育超过3小时，并确认检测板避光孵育。

4. 使用荧光计或多模式微孔板读数仪（例如GloMax® Discover System（目录号 GM3000））测量产生的荧光值
(380-400nm Ex/505nm Em)。

注意：您可能需要调整仪器增益（应用光电倍增管能量）。

5. 加入与孔板中已存在的混合液体（每孔 100-120 μl）等体积的ONE-Glo™ Luciferase Assay Reagent，在室温下孵
育3分钟，然后使用光度计或多模式读微孔板读数仪测量发光信号，例如GloMax® Discover系统。

6. 确定可提供最高萤光素酶活性和细胞存活率的条件。

联系信息见：wechat. 电子邮箱：*************************
问题原因和参考建议
低转染效率
低质量DNA或DNA量不足。

• 确认核酸用量、纯度和序列。

• 使用市售的转染级质粒制剂进行对照转染实验。

• 化学污染物可能存在于质粒制剂中。

请避免用磷酸盐缓冲液保存质粒DNA，除非
您已经在转染系统中测试过其可行性。

• 内毒素对于部分非常敏感的细胞系具有毒性。

细胞数量不足。

使用的贴壁细胞汇合度至少要80%。

低细胞密度导致了可用于吸收转
染复合物的细胞减少，而过量的复合物可能具有细胞毒性。

更少的细胞会产生更少的
蛋白质。

过多的细胞或细胞已过对数生长阶段。

当对汇合的培养物进行传代培养或细胞以过高
的密度铺板时，细胞无法在被转染后分裂。

这导致次优表达。

次优的FuGENE® 4K Transfection Reagent与DNA的比率、复合物孵育时间、添加
的转染复合物总量或细胞密度。

如第4.E章节所述，优化 FuGENE® 4K Transfection
Reagent与DNA的比例、复合物孵育时间、添加到细胞中的复合物量和细胞密度。

FuGENE® 4K Transfection Reagent进行了分装。

检查FuGENE® 4K Transfection Reagent是
否储存在合适的容器中。

如果试剂分装到了塑料容器中，试剂将会失活。

通过涡旋或
吹打10-15次确保试剂立即与稀释的DNA混合。

FuGENE® 4K Transfection Reagent 与塑料进行了接触或未充分混匀。

重复转染步
骤，小心地将FuGENE® 4K Transfection Reagent直接移入无血清培养基中，将转染
试剂添加到稀释的DNA中时小心避开容器的侧面。

如果FuGENE® 4K Transfection
Reagent吹打过于轻柔，试剂可能会在培养基顶部分层，导致与塑料接触。

在含血清培养基中形成转染复合物。

检查用于复合物形成的培养基的原始培养基瓶。

使用不含任何添加剂（如血清、抗生素、生长促进剂、肝素、硫酸葡聚糖等）的新
瓶培养基重复实验。

尝试在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）或普通Dulbecco’s Modified
Eagle Medium （DMEM）中形成复合物。

培养基和培养基组分可能影响转染。

• 不同的培养基和培养基组分可能会影响转染效率的水平和转染细胞的后续生长，以
及重组蛋白的表达。

一些批次的血清已报告会对最优转染有影响。

• 血清和培养基质量和/或批间差异均被发现会影响转染实验。

检查培养基和/或血
清是否来自之前使用过的同一批次。

尝试新批次或新供应商。

培养的细胞可能被支原体污染。

培养物被支原体污染会降低转染效率。

通过市售的支
原体污染检测确定培养物是否被支原体污染。

问题原因和参考建议
前后矛盾的结果转染复合物的比例或数量处于性能平台期的边缘。

进行初始优化实验以确定比率、要添加的复合物数量和复合物形成所需时间。

根据我们的经验，我们发现平台期相对广阔。

我们建议未来的实验用处于平台期中间的比率、孵育时间和复合物用量的条件进行实验。

如果在平台期边缘选择试验条件，非常小的程序差异可能会导致蛋白质表达结果的巨大差异。

通过将参数从平台期边缘变为平台期中部来提高一致性。

转染复合物的形成受时间、数量和比例的影响。

复合物的形成涉及转染试剂和DNA以及生物学参数之间的多方面相互作用。

任何组分或技术上的差异都可能导致不一致。

如果结果不符合预期，则重复优化实验，选择先前实验中发现的平台期附近的区域。

对于当前的实验，确定是否应使用不同的比率、时间长度或复合物用量以获得更一致的转染结果。

不良培养的细胞。

为了获得一致的结果，必须正确维持细胞。

细胞随传代水平、传代条件、培养基和血清而变化。

对于某些细胞系，这些变化对转染实验几乎没有影响，但对于其他细胞系，这些变化具有深远的影响。

每种细胞类型可能有不同的最佳转染条件。

单个细胞类型的最优值也可能随着载体构建和表达的蛋白质类型而略有变化。

表现出细胞毒性产生的高水平转染的蛋白质是具有细胞毒性的。

降低的活力或缓慢的生长速率可能是由高蛋白质表达水平导致的结果，因为细胞代谢资源直接用于异源蛋白质的生产。

表达的蛋白质在表达水平上也可能对细胞具有毒性。

为了分析细胞毒性，请准备如下所述的实验对照。

准备如下额外的质控孔：
• 未被转染的细胞
• 仅用DNA处理的细胞（例如，没有FuGENE® 4K Transfection Reagent）
• 仅用FuGENE® 4K Transfection Reagent处理的细胞（未添加DNA）
• 用无毒性或分泌型的蛋白进行细胞转染
将实验转染细胞与对照孔中的细胞进行比较（如上所述）。

考虑使用分泌型报告基因重复实验，例如分泌型胚胎碱性磷酸酶 (SEAP)、人类生长激素（hGH）或标准β-半乳糖苷酶对照载体。

表达SEAP的细胞应几乎没有细胞毒性的迹象。

对于细胞数量转染复合物过多。

增加铺板的细胞数量，减少添加到细胞中的复合物总量或两者均施行。

尝试不同的比例，让复合物在不同的时间间隔内形成。

加入不同量的复合物；如，构建复合物步骤一致，但在每个孔中添加常用量的75%、50%或25%。

优化转染条件参见第4.E章节。

细胞培养可能被支原体污染。

培养物被支原体污染会降低转染效率。

通过市售的支原体污染检测确定培养物是否被支原体污染。

细胞可能不健康。

评估细胞的生理状态和孵化条件（例如，检查培养箱的二氧化碳浓度、湿度和温度水平）。

在每次传代前观察细胞的形态和是否存在污染物。

确保细胞未过生长。

在细胞长满前进行日常传代。

确保培养基和添加剂在有效期内并妥善保存。

稀释液对细胞具有毒性。

对于部分昆虫细胞系来说DMEM具有毒性。

对于此类细胞，使用无菌水制备转染复合物。

还可以尝试在细胞生长的培养基中形成复合物，前提是培养基不含血清、肝素或硫酸葡聚糖。

质粒被内毒素污染。

内毒素对于敏感细胞系来说具有细胞毒性。

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