利拉鲁肽可能通过AMPK通路减轻2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠的脂质代谢

·临床研究·
糖尿病新世界
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糖尿病新世界2021年9月
[基金项目]内蒙古自然科学基金项目(2018LH08069);包头医学院自然科学类扬帆项目(BYJJ-YF-2018026);包头医学院自然科学类青苗项目(BYJJ-QM-201758)。

[作者简介]朱宏伟(1981-),女,硕士,副主任医师,研究方向为代谢性疾病。

[通信作者]李华(1976-),女,本科,副主任医师,研究方向为内分泌,营养,全科医学,E-mail:********************。

DOI:10.16658/ki.1672-4062.2021.18.050
利拉鲁肽可能通过AMPK 通路减轻2型糖尿病合并
非酒精性脂肪肝小鼠的脂质代谢
朱宏伟1,李华2,郝芳2,刘文军2,李志辉3
1.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院内分泌科,内蒙古包头
014030;2.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院营
养科,内蒙古包头
014030;3.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院医务部,内蒙古包头
014030
[摘要]目的探究利拉鲁肽对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠血糖和脂肪代谢的影响以及利拉鲁肽调控该过程中是否有AMPK 信号通路的参与。

方法KK/upj-ay/J 小鼠(以下简称为KKay 小鼠)随机分为普通饮食20只,高脂饮食40只,连续饲养4周,4周后每周检测血糖水平,确定造模是否成功。

高脂饮食小鼠随机分为两组,一组利拉鲁肽,一组未治疗。

尾静脉采少量血,进行血糖测定。

空腹过夜后,左心室穿刺采集血样,检测总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。

蛋白质印迹分析AMPK 的磷酸化修饰是否改变。

结果利拉鲁肽改善了KKay 糖尿病脂肪小鼠的血糖和血脂水平,AMPK 信号通路可能参与利拉鲁肽调节的脂质代谢和血糖改变。

结论利拉鲁肽可能通过AMPK 通路减轻T2DM 合并NAFLD 小鼠的代谢,为临床治疗T2DM 合并NAFLD 提供更多理论依据。

[关键词]利拉鲁肽;血糖;2型糖尿病;AMPK 信号通路[中图分类号]R587.1
[文献标识码]A
[文章编号]1672-4062(2021)09(b)-0050-04
Liraglutide May Reduce Lipid Metabolism in Mice with Type 2Diabetes and Non-alcoholic Fatty Liver through AMPK Pathway
ZHU Hongwei 1,LI Hua 2,HAO Fang 2,LIU Wenjun 2,LI Zhihui 3
1.Department of Endocrinology,the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou,Inner Mongolia Autonomous region,014030China;
2.Department of Nutrition,the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou,Inner Mongolia Autonomous region,014030China;
3.Department of Medical,the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou,Inner Mongolia Autonomous region,014030China
[Abstract]Objective To explore the effect of liraglutide on blood glucose and fat metabolism in type 2diabetic mice with non-alcoholic fatty liver and whether liraglutide is involved in the AMPK signaling pathway during the regulation of this process.Methods KK/upj-ay/J mice (hereinafter referred to as KKay mice)were randomly divided into 20normal diets and 40high-fat diets.They were reared for 4weeks.After 4weeks,blood glucose levels were measured every week to determine if the model succeeded.High-fat diet mice were randomly divided into two groups,one group with liraglutide and one group
untreated.A small amount of blood was collected from the tail vein for blood glucose measurement.After an overnight fasting,blood samples were collected by left ventricular puncture to detect total cholesterol,triacylglycerol,high-density lipoprotein cholesterol,and low-density lipoprotein cholesterol.Western blot analysis whether the phosphorylation modification of AMPK was
changed.Results Liraglutide improved the blood glucose and blood lipid levels of KKay diabetic fat mice.AMPK signaling pathway may be involved in the lipid metabolism and blood glucose changes regulated by liraglutide.Conclusion
Liraglutide may reduce the metabolism of type 2diabetes with non-alcoholic fatty liver in mice through AMPK pathway,and provide more theoretical basis for clinical treatment of type 2diabetes with non-alcoholic fatty liver.[Key words]Liraglutide;Blood glucose;Type 2diabetes;
AMPK signaling pathway
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糖尿病(DM)是一种常见的代谢性疾病,其中50%~70%的DM 患者为2型糖尿病(T2DM),而T2DM 患者
更容易合并脂肪肝[1-3]。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与DM、肥胖和血脂异常等代谢因素密切相关。

DM 促进NAFLD 从过度的肝脂肪沉积向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化甚至肝癌发展,增加了肝脏相关疾病的病死率[4-5]。

T2DM 的特点是胰岛素抵抗和胰腺β细胞病变,导致血糖控制恶化。

如果DM 药物或基础胰岛素无法控制机体血糖,需注射一定量的胰岛素。

但在大多数情况下,由于胰岛素剂量不当导致机体血糖紊乱和体质量增加,使脂肪肝进一步恶化。

T2DM 患者NAFLD 的缓解较困难。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠促激素,由肠细胞分泌。

GLP-1在哺乳动物中具有多种功能,包括促进胰岛素分泌,抑制胰高血糖素释放,减缓胃排空,减少胰岛素介导的葡萄糖摄取[6-9]。

GLP-1激动剂艾塞那
肽、利拉鲁肽等作为一类新型的降糖药物,已在临床上应用于T2DM 的治疗。

GLP-1激动剂和基础胰岛素联合治疗可协同降低血糖水平,减少餐后血糖水平。

但大多数结论来自临床试验,其潜在机制仍然未知。

报道如下。

1对象与方法1.1研究动物
KK/upj-ay/J 小鼠(以下简称为KKay 小鼠)雄性60
只,SPF 级,10~12周龄,体质量28~35g,随机分为普通
饮食20只,高脂饮食40只,连续饲养4周,4周后每周检测血糖水平,以确定造模是否成功。

KKay 小鼠由北京联合利华提供。

1.2血糖水平检测
尾静脉采少量血,置于血糖仪(罗氏血糖仪,货号:KDLSZYSZ001),收集数据。

1.3血液生化分析
尾静脉采少量血,置于血糖仪空腹过夜后,左心室穿刺采集血样,室温静置3h 后,以3000r/min 离心10min。

总蛋固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、采用Cobas Integra 400Plus 全自动生化分析仪(Roche Diagnostics,
瑞士)测定。

1.4蛋白质印迹分析
蛋白质印迹分析以研究肝脏组织中蛋白质的表达及其磷酸化水平。

将肝脏组织研磨成液体用RIPA 裂解缓冲液进行裂解。

每组提取的蛋白通过SDS-PAGE 分离并转移到PVDF 膜上。

5%脱脂牛奶阻断非特异性结合,然后用特异性一抗孵育过夜。

抗AMPK 和抗p-AMPK 购
自Santa Cruz(Biotechnology,Santa Cruz,CA,United States )。

采用Perkinelmer western lightning Plus-ECL 检测特异性条带。

使用Quantity One 软件(Bio-Rad,Hercules,美国)对蛋白质印迹进行密度分析。

1.5统计方法
采用SPSS Version19.0(SPSS,Chicago,IL,美国)分析数据,组间比较采用t 检验和单向ANOVA 检验。

P <0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1T2DM 合并NAFLD 小鼠模型的建立
KKay 小鼠高脂饮食4周后,检测正常饮食组和高
脂饮食组小鼠血糖水平,结果发现高脂组小鼠血糖水平均>13.8mmol/L(前一天饥饿行血糖检测),血清TC≥6.2mmol/L,TG≥4.1mmol/L,见图1。

图1高脂饮食4周促进KKay 小鼠血糖、总胆固醇和三酰甘油水平上调
2.2利拉鲁肽改善KKay DM 脂肪小鼠的血糖
为了证实利拉鲁肽对血糖控制的影响,用利拉鲁肽治疗T2DMKKay 小鼠。

利拉鲁肽治疗12周后,检测各组小鼠的血糖水平,利拉鲁肽组小鼠的血糖明显低于未治疗组,见图2。

图2利拉鲁肽改善小鼠血糖浓度
2.3利拉鲁肽缓解体内血脂代谢
利拉鲁肽治疗12周后,进一步检测KKay 小鼠血脂,包括TC、TG、LDL-C 和HDL-C。

结果显示利拉鲁肽显著降低了KKay 小鼠的TC、TG 和LDL-C 水平,轻微降低HDL-C 水平,见图3。

样本数
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(下转第56页)
2.4AMPK 信号通路可能参与利拉鲁肽调节的脂质代谢和血糖改变
在体内AMPK 通路参与利拉鲁肽介导的下游信号转导。

利拉鲁肽治疗的KKay 小鼠肝组织中AMPK 信号通路被激活,见图4。

图4蛋白印迹显示利拉鲁肽激活AMPK 信号通路
3讨论
NAFLD 是世界范围内常见的肝病,包括NAFL 和NASH 。

脂肪肝可能不会导致严重肝功能紊乱。

但脂肪性肝炎合并炎症和纤维化可发展为肝损害并伴有许多并发症[10]。

越来越多的证据表明,T2DM 与NAFLD 密切相关。

在NAFL 和NASH 患者中,分别有23%和47%被确诊为T2DM [11]。

目
前还未见有针对NAFLD 有效的治疗药物,因此NAFLD 合并T2DM 的患者治疗策略更是甚微。

GLP-1激动剂作为一种新型的抗DM 药物可以缓解肝细胞的脂质积累和炎症[12]。

然而,其潜在机制尚未完全了解。

利拉鲁肽与
天然GLP-1具有97%的同源性,可以成功延长GLP-1活性,抑制DPP4活性,限制肾脏清除率[13]。

文献报道,
除降低血糖外,利拉鲁肽对骨、心、肾、肝等不同器官具有保护作用[14]。

猜想利拉鲁肽可能缓解NAFLD 合并
T2DM 患者血糖和血脂的代谢。

结果表明,利拉鲁肽能显著降低血糖和血脂的同时,可以激活AMPK 通路。

尽管利拉鲁肽在减轻肝脂肪堆积方面的作用一直存在争议,但该研究结论与最近的一篇报道相似,该报道称,利拉鲁肽联合二甲双胍显著降低了T2DM 和NAFLD
患者的体质量、肝内脂质和内脏脂肪组织[15]。

临床上,利拉鲁肽可以减轻体质量和肝脏脂肪堆
积[16]。

然而,对其机制的研究仍十分有限。

文献报道
AMPK 信号通路也参与利拉鲁肽刺激的肝脏和脂肪组织的脂肪降解[17]。

DPP4抑制剂可以抑制内源性GLP-1的降解,刺激AMPK 的激活和脂肪细胞的脂肪变性[18]。

在目前的研究中,发现AMPK 信号通路可能参与利拉鲁肽调控的肝脏相关代谢以及血脂水平。

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图3
利拉鲁肽改善了小鼠体内血脂的代谢
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