药品微生物检验基础知识 ppt课件

险较小 · 保存期比较短， · 反复传代有引 · 比较容易掌握 起变异的可能；
A：甘油冷冻管保藏法
保藏温度
缺点：操作相对复杂，成本较高。 操作简便， 斜面低温 4℃左右 1～3个月 · · 成本低， 保藏法 B：斜面低温保藏法
· 铜绿假单胞菌 保藏温度4℃左右，保藏时间1～3个月，但铜绿假单胞菌不宜 不宜用本法保 用本法保存。
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2白色念珠菌 白色念珠菌（Monilia albican 或 canidia Albicans），是一 种真菌，通常存在于正常人 口腔，上呼吸道，肠道及阴 道，是医学全身性真菌感染 病的重要途径，可以引起心 膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口 疮、阴道炎、脑膜炎、及败 血症。
白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂白色念珠菌
“种”是最本的分类单位，例：大肠埃希菌
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一、微生物基本介绍
3、微生物的特点
体形微小；
结构简单；
生长繁殖快；
种类繁多，分布广，适应性强。
包括：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、 支原体和病毒等。
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一、微生物基本介绍 4.1细菌 药典收录的有代表性的常见细菌有
1大肠埃希菌
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二、培养基
4、培养的再融化方式 水浴加热 微波炉 电热炉加热 注意： 固体培养基灭菌后的再融化只允许一次 融化的培养基应置于45℃～50℃的水浴中，不得超过8小时
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二、培养基 5、培养基的性能评估
所有购回的、配制好的培养基均应进行质量控制试验（培养 基适应性检查） 理化指标（P55） 微生物学指标（P55）
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四、微生物限度检查法
1、定义
微生物限度检查法 — 系检查非规定灭菌制剂及其原 料、辅料受微生物污染程度的方法。
2、检查项目
定量检查—细菌数、霉菌及酵母菌数
定性检查 — 控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、白色念球菌）
ppt课件 检验环境：与无菌检查相同 46
四、微生物限度检查法
湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌； 高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形 成死角。
要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年；
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二、培养基 3、培养基的贮藏
贮藏注意：
灭菌后的培养基应迅速取出，避免长时间保存在灭菌锅内， 造成过度灭菌；
培养基保存前应标上名称和制备日期（或到期日期）； 琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放； 琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，在验证的期限内使 用；
结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及 适宜的鉴定试验 , 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上 没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大 肠埃希菌。
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三、菌种
铜绿假单胞菌 CMCC (B) 10104
溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，典型菌 落呈扁平，无定形、周边扩散，表面湿——灰白色， 周围有蓝绿色素扩散。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
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四、微生物限度检查法
供试品分类
液体供试品
固体、半固体或黏稠性供试品 需用特殊供试液制备方法的供试品 非水溶性供试品 膜剂供试品 肠溶及结肠制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品
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购买的成品培养基配方与药典配方核对
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中检院购买的对照培养基
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三、菌种
1、分类（概念）：
标 准 菌 株 标准储备菌株 商业派生菌株 工 作 菌 株 由国内或国际菌种保藏机构保藏的 由标准菌株经一次传代得到的培养物
由供应商提供的所有特性与标准菌株 等效的菌株
由标准储备菌株以传代得到的培养物
2金黄色葡萄球菌
3枯草芽孢杆菌
4生孢梭菌
5铜绿假单胞菌
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1大肠埃希菌
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）通常被称为大肠杆菌，是 Escherich在1885年发现的，在 相当长的一段时间内一直被当 作正常肠道菌群的组成部分认 为是非致病菌。 一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条 件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强， 引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。人体感染致病EHEC 后，会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻， 同时伴有发热、呕吐等表现，多为EHEC产生的毒素所 ppt课件 致。
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大肠埃希菌(Escherichia coli)
供试液制备和增菌培养 取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微 生物计数法” （通则1105）制成1：10 供试液。取相当于1g 或1mL 供 试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大 豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24 小时。
氧化酶实验：阳性 绿脓菌素：阳性 革兰氏染色：阴性，杆菌；
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三、菌种
白色念珠菌 CMCC (B) 98001 沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色， 表面光滑有浓酵母气味。 革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。 芽管试验：阳性
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三、菌种
3、菌种的保藏
保藏 优点 缺点 有效期 -30 ℃ ～ 80 ℃℃； 保存期较长，1～ · 操作相对复杂， 甘油冷冻管 1～ 2年 · 保藏温度：－ 30 ℃ ～ 80 保藏菌种有效期： 2年 · 反复传代导致 · 成本较高 保藏法 菌种变异的风 优点：保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小；
三、菌种
标准菌株：
①冻干粉（图P63）
②甘油冻存管（图P64）
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三、菌种
菌种保藏机构：
CMCC
中国医学微生物菌种保藏管理中心
GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心
ATCC
美国典型菌种保藏中心
例： CMCC （B） 26003
菌种保藏机构 细菌 菌种编号（金黄葡萄球菌）
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细菌鉴别革兰氏染色
格兰仕阳性菌例如：金黄色葡萄球菌，也称“金葡菌”，细胞壁含 90% 的肽聚糖和 10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密， 染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色 革兰氏阴性菌例如:大肠埃希菌的细胞壁肽聚糖层薄、交联度差，脂类含 量高，所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。
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一、微生物基本介绍
（未清洗的手）
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（清洗过的手）
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二、培养基
1、培养基的制备
培养基的配制：
按处方配制，使用按处方生产的符合规定的脱水 培养基
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二、培养基 配制时注意：
不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基；
常用的溶剂是纯化水、蒸馏水，避免使用自来水，因其中含 有氯等抗菌物质；
微生物检验技术 基础知识
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目 录
一、微生物基本介绍 二、培养基 三、菌种 四、微生物限度检查法
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一、微生物基本介绍
1、微生物的定义
微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、甚 至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称。
2、微生物的分类
微生物的主要分类单位：域、界、门、纲、目、科、 属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系）
3、检验量
指一次检验用量； 10g或10ml，膜剂为100cm2，贵 重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
4、供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物特性，采取适宜的方 法制备供试液； 供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超 过45℃。 47 ppt课件
四、微生物限度检查法
制备原则：
简便、快速！
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白色念珠菌
左图：白色念珠菌在该批念 珠菌显色对照培养基表面培 养 24 小时的生长形态；
右图：白色念珠菌在该批念 珠菌显色对照培养基表面培 养 48 小时的生长形态。
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一、微生物基本介绍 5、微生物与我们
每张人民币带细菌：900万个； 人体体表及体内存在大量的微生物； 皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米； 口腔“细菌种类超过500种； 肠道：微生物总量达100万亿；
革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色
染色结果
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一、微生物基本介绍
4.2真菌（包括酵母菌和霉菌） 1黑曲霉菌
2白色念珠菌
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1黑曲霉菌 黑曲霉，半知菌亚门，丝孢 纲，丝孢目，丛梗孢科，曲 霉属真菌中的一个常见种。 广泛分布于世界各地的粮食、 植物性产品和土壤中。
脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌； 加热助溶，注意不要过度加热； 如需要添加其它组分，加入后应充分混匀； 配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器； ppt课件
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二、培养基 2、培养基的灭菌
已配制好的培养基最好尽快灭菌；
一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是 121 ℃ 15 分钟；
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三、菌种
2、菌种的鉴定 金黄色葡萄菌 CMCC (B) 26003 甘露醇平板上划线分纯，典型菌落 为黄色圆形突起，表面湿润光滑； 革兰氏染色：阳性，球菌。
ppt课件 血浆凝固霉酶实验：阳性 34
三、菌种
2、菌种的鉴定 大肠埃希菌 CMCC (B) 44102 大肠埃希菌在麦康凯培养基上的菌落形态特征：鲜 桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘 整齐,表面光滑,湿润 革兰氏染色：阴性，杆菌。
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4生孢梭菌 生孢梭菌 （Clostridium sporogenes） 又译产孢梭菌，能够产生孢 子，革兰氏染色阳性，以周 生鞭运动，严格厌氧的梭菌。
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5铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌的学名是 Pseudomonas aeruginosa ， 绿脓假单胞菌属为革兰染色阴 性需氧菌，存在于土壤、尘埃、 水和少数人体肠道中，亦可暂 时寄生于皮肤，主要寄生在肛 门、生殖器部位、腋窝和外耳 道等处。在正常情况下一般不 致病，当机体抵抗力低下时可 ppt课件 致病，还可引起病人死亡。
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2金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌， 隶属于葡萄球菌属有“嗜 肉菌"的别称，是革兰氏阳 性菌的代表，可引起许多 严重感染。
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的 病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺 炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、 脓毒症等全身感染。
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三、菌种
注意：
标准储备菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认
工作菌株的传代次数不得超过5代（从菌种收藏机构 获得的标准菌株为第0代） “1代”是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜 培养基中培养。 实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、 贮藏、保存、确认试验及销毁的记录。
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2金黄色葡萄球菌
典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄 串状。
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3枯草芽孢杆菌
枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属 的一种。单个细胞0.7～ 0.8×2～3微米，着色均匀。无 荚膜，周生鞭毛，能运动。革 兰氏阳性菌，芽孢0.6～ 0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱 状，位于菌体中央或稍偏，芽 孢形成后菌体不膨大。菌落表 面粗糙不透明，污白色或微黄 色，在液体培养基中生长时， 常形成皱醭。需氧菌。
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革兰氏染色 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等 四个步骤，具体操作方法是：
1）涂片固定。
2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6 ）加 95% 酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 20 秒 13 ppt课件 后水洗，吸去水分。
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大肠埃希菌(Escherichia coli)
选择和分离培养 取上述预培养物1mL 接种至100mL 麦康凯液体培养基 中，42～44℃培养24～48 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康 凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 小时。
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大肠埃希菌(Escherichia coli)
优点：操作简便，成本低，比较容易掌握；
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存。
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甘油冷冻管保存菌种
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甘油冷冻管保存菌种
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甘油冷冻柜保存菌种
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三、菌种
4、菌种的使用和销毁
过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃30分钟的生 物灭活处理。 121℃45min高温蒸汽灭活。并进行菌种销毁记录。