分子生物学实验(上)

实验方案
外源基因
外源基因信息：/gene/?term=3504452 AFL1-1（Gene ID=3504452）序列信息统计如下：
1 atggcttctc caattctgcg atcaccgatt acttcggacc tcgccaacgt aacacccgat 61 ttggtggatg ttagcactcc cgaaaaattg aaatcctacc gcgaatcact tgaaccaatc 121 ttcactttgg agaatatcat ccgagggaaa gagaacatca tctcctacga ggaactggac 181 atcccaggcc ccgcaggacc gatgcgggcc accatcttcc gccccaagca ccaaacccac 241 cctatcgatg aaatccctgg tatcctacac atccacggcg ggggcctcgc cacgggaaac 301 cgcttcctgg gcttcaccat gctcgactgg gtcgagtccc tcggtgccgt ctgcctgacg 361 gccgagtacc gtctcgcccc ggaacatcac cagcccgccc agctggaaga cagctacgcc 421 gcgctgcagt ggatgagcga ccacgccgcc gagctgggct tcaacccgcg caagctggtt 481 gtctgcggta gctcggcggg gggcaatctc acggcggggg tcaccttact cgcgcgggac 541 cgctcgggcc cgcaaatccg cggccaggtg ttgatctatc cgtgggttga cgatggcatg 601 gactacgtgt ccatgcggca gtatgcggat attgcgcctg tgagggacgt ggacgccgcc 661 gtgttggcta attatgcgtt tggcgagagg cgcgagcacg cggatatgta tactgtgccg 721 atgcgcgcga cgaatttcgc gggcttgccc ccgacgttta tcgatgtggg tgaggcggat 781 gtgtttcgtg atcaggatat cgcgtacgcg tcggctttgt ggaaggatgg tgtctcgact 841 gagttgcatc tgtggccggg cagttggcat gggtttgatg tctttgttcc tgatgctccc 901 attagtcggc gggcgagggc tgctcggttg gaatggcttc ggaagttgtt aagtgtgcct
实验安排——第二次
质粒的抽提（质粒小量制备试剂盒）
DNA电泳
50μL 洗脱，取4μL电泳（P）
质粒DNA的预酶切体系
组份
N(μL)

ddH2O
9.25
10× Buffer
1.5
质粒DNA
4
酶
0.25
总体积
15
B(μL) 9.25 1.5
4 0.25 15
酶切反应条件
N+B(μL)
C(μL)
9
9.5
能同时存在于一个细胞 ➢ 携带特殊遗传标记：物质抗性和物质合成相关基因
实验原理
质粒DNA的制备方法 ➢ 氯化铯密度梯度离心 ➢ 碱溶法（碱裂解法） ➢ 沸水浴法
实验原理
碱溶法（碱裂解法）
➢ 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； ➢ 加溶菌酶裂解细菌细胞壁；
T-DNA ocDNA
➢ 加NaOH和SDS的混合溶液破膜释放内含物；
分子生物学实验（上）
烟曲霉脂肪酶编码基因的克隆 与表达分析
基因工程基本流程
分离 PCR
切
接
转
增
检
酶切 鉴定
分离
分子生物学实验（上游）总体思路
脂肪酶编码基因的扩增、克隆与鉴定
DNA水平
脂肪酶编码基因在大肠杆菌中的异源表达
转录水平 mRNA抽提 RT-PCR
蛋白水平 重组菌蛋白表达 （SDS-PAGE）
实验原理
DNA连接反应的影响因素 ➢ 温度与时间 ➢ DNA末端与浓度 ➢ 缓冲体系 ➢ 酶量
实验原理
融合表达
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 ➢ 启动子（Promoter） ➢ 终止子（Terminator） ➢ 核糖体结合位点（RBS） ➢ 密码子 ➢ 质粒拷贝数
实验原理
大肠杆菌表达盒的基本组成
实验原理
DNA电泳
DNA电泳的原理
根据核酸的解离性质，在中性或偏碱性的缓冲液中核酸解离成负离 子，因此在一定的电场中会向正极（阳极）方向迁移。常用琼脂糖 （agarose）凝胶或聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶作为电泳 支持介质，不同浓度的凝胶形成不同大小的网孔，具有分子筛效应， 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分 离的目的。
0.6+0.6 40.0
37℃水浴保温30min
酶切样品全部电泳
实验安排——第一次
酶切产物的回收（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒） DNA电泳
30μL洗脱，取3μL电泳（待做） 吸附柱暂留
本次上交样品：外源基因回收样品（标好组号）
实验原理
PCR扩增
PCR反应的基本构成
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），指在引物 指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应， 是模拟体内 DNA 复制过程，在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技 术，故又称基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片段两侧和与其两 侧互补的两个寡核苷酸引物， 经变性、 退火和延伸若干个循环后， DNA扩增2n倍。
酶切产物的回收
DNA电泳
30μL洗脱，取4μL电泳（F）
电泳样品
载体质粒（P） 载体酶切片段（F） 外源片段（A）
BamHI NdeI/BamHI
5329bp
NdeI
实验安排——第二次
连接
DNA电泳（待做）
连接体系
组份 10× Buffer 载体片段（F） 外源片段（A） T4 DNA连接酶 ddH2O 总体积
基本操作 ➢ 制胶 ➢ 电泳 ➢ 紫外观察
实验原理
电泳缓冲液
紫外灯下观察结果
实验原理
电泳结果分析 ➢ 条带大小 ➢ 条带数目
实验原理
DNA的回收
DNA回收试剂盒的原理
回收试剂盒的原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH）使核酸吸附 在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，通过改变溶液 环境使DNA溶解到纯水或TE（低盐、高pH）中进行洗脱，可去除 PCR反应中的dNTPs、引物、矿物油和聚合酶等及DNA样本中的其 它杂质，得到的DNA片段可用于酶切、连接、测序、PCR反应模板 等后续操作。
AFL1-1 C端融合序列 （深红色部分）
实验原理
酶切
限制性内切酶 ➢ 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主
要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。 ➢ II 型限制性内切酶识别切割位点较专一， 因此广泛用于
实验原理
模板DNA的变性 模板DNA与引物的退火 引物的延伸
PCR反应的五个元素 引物 DNA聚合酶 dNTP 模板DNA Mg2+
循环
PCR反应的基本过程
实验原理
PCR反应的特点 ➢ 强特异性 ➢ 高灵敏度 ➢ 快速简便 ➢ 低纯度模板
实验原理
PCR结果异常分析 ➢ 无特异性产物条带 ➢ 出现非特异性条带
载体质粒pET-28a(+)的抽提
质粒酶切回收
连接
DH5感受态细胞制备
快抽质粒
菌落PCR鉴定
扩增
转化
转化BL21(DE3) 感受态细胞
重组菌RNA抽提 重组菌蛋白表达
RT-PCR鉴定 SDS-PAGE电泳
实验安排——第一次
AFL1-1基因的PCR扩增
PCR反应体系
组份 ddH2O 10× PCR Buffer MgCl2 (25mM) dNTP (各2.5mM) P1 (5pmol/μL) P2 (5pmol/μL) 模板DNA Taq酶 (5U/μL)
实验原理
连接
DNA体外连接的方式 ➢ 粘性末端连接 ➢ 平头末端连接 ➢ 人工粘性末端连接
实验原理
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl MgCl2 ATP DTT Volume TT
50-100 mM pH 7.5 10 mM 0.5 - 1 mM 5 mM 10 - 20 μL 4-15 ℃ 4 - 16hr
1#(μL) 32.0 5.0 3.0 4.0 2.0 2.0 1.0 0.25
2#(μL) 31.0 5.0 3.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.5
DNA电泳 PCR反应条件
预变性：95℃，5min
30 变性：95℃，30s
个 循
退火：61℃，30s
环 延伸：72℃，1min
延伸：72℃，10min
➢ 加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染 色体DNA及大部分蛋白质；
➢ 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；
➢ 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；
➢ 用无DNase的RNase去除残余的RNA。
D-DNA L-DNA cccDNA
实验原理
质粒制备试剂盒的基本原理 ➢ 碱溶法分离质粒DNA ➢ 膜吸附技术纯化DNA
L(μL) 1.5 X Y 0.5 0 15.0
LC(μL) 1.5 X Y 0 0.5 15.0
连接反应条件
4℃水浴保温过夜 -20℃保存待检测和转化
本次上交样品：载体质粒（P）、载体酶切片段（F） 连接液（L）及连接对照（LC）（标好组号）
实验原理
质粒DNA的制备
质粒的基本特征 ➢ 自主复制性：严紧型复制和松弛型复制控制 ➢ 可转移性：接合型质粒和非接合型质粒 ➢ 不相容性：任何含有相似复制子结构的不同质粒，一般不
1.5
1.5
4
4
0.25+0.25
0
15
15
实验安排——第二次
质粒的酶切
DNA电泳
质粒DNA的双酶切体系
组份 ddH2O 10× Buffer 质粒DNA NdeI/BamHI 总体积
组号(μL) 34-X 4 X 1+1 40
酶切反应条件
37℃水浴保温30min
酶切样品全部电泳
实验安排——第二次
P
SD
Gene ORF
T
ATG ……………………………………………………… TAG
起始密码子
3n bp
终止密码子
实验原理
融合型异源蛋白的表达
将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放 型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在 这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于 C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异 性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。
pET-28a(+)
试剂盒溶液组成
Solution I：Tris-HCl、EDTA、葡萄糖（RNase A） Solution II：NaOH、SDS Solution III：KAc
实验原理
沸水浴法
➢ 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体； ➢ 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； ➢ 沸水浴20-40秒钟； ➢ 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； ➢ 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。
➢ 优缺点
稳定性高 易于回收 表达率高 溶解性好 需要回收
实验原理
融合表达质粒的构建（本实验方案）
PCR扩增 NdeI/BamHI联合酶切
实验原理
BamHI
NdeI
pET-28a(+)片段（5329bp）
T4 DNA连接酶
AFL1-1 N端融合序列 （深红色部分）
AFL1-1的氨基酸序列 （绿色部分）
4℃保存
取5μL电泳
实验安排——第一次
PCR产物的纯化（PCR产物纯化试剂盒）
DNA电泳
30μL 洗脱，取5μL电泳
PCR产物的酶切 PCR产物的酶切体系
DNA电泳 酶切反应条件
组份 ddH2O 10× Buffer PCR纯化产物 NdeI/BamHI 总体积
组号(μL) 15.0 4.0 20.0
实验方案
载体
实验方案
宿主
E. coli DH5α 克隆宿主 不含T7 RNA 聚合酶基因
E. coli BL21(DE3) 表达宿主 含T7 RNA 聚合酶基因
表达方案
实验方案
T7 His.tag
AFL1-1
T7 terminator pET-28a(+)
实验流程
PCR扩增AFL1-1基因
PCR产物酶切回收