miR-664b-3p调控Caspase-1介导细胞焦亡在深静脉血栓形成中的作用

miR -664b -3p 调控Caspase -1介导细胞焦亡在深静脉血栓形成中的作用
褚楚1，刘文1，郭红2，赵霖1，魏然1，张振1，郭强1，朱肖肖1，王彬3，李霞11山东第一医科大学基础医学院（基础医学研究所），济南250062；2山东德升生物工程有限公司；3山东中医药大学附属医院
摘要：目的
观察深静脉血栓形成（DVT ）患者外周血微小RNA -664b -3p （miR -664b -3p ）、半胱氨酸天冬氨酸蛋
白酶1（Caspase -1）水平变化，分析二者在细胞焦亡中的调控关系。

方法
选择健康志愿者（健康对照组）和DVT 患
者（DVT 组）各30例，空腹抽取外周静脉血，分离血清及单个核细胞（PBMC ）。

Western blotting 法检测PBMC 中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Cleaved Caspase -1）、焦孔素D （GSDMD ）活性片段（GSDMD -N ）蛋白，qPCR 法检测PBMC 中的miR -664b -3p ，ELISA 法检测血清中的细胞焦亡相关炎症因子白细胞介素（IL ）1β和IL -18蛋白。

采用Target Scan 7.2生物信息学软件，预测miR -664b -3p 与Caspase -1mRNA 的3′非翻译区（3′UTR ）是否存在互补结合位点；分别构建包含结合位点的野生型及突变型Caspase -1mRNA 3′UTR 质粒，双荧光素酶报告基因系统检测miR -664b -3p 对其荧光素酶报告基因活性的影响。

结果
DVT 组PBMC 中Cleaved Caspase -1、GSDMD -N 蛋白表达及血清IL -1β、
IL -18蛋白水平均高于健康对照组，miR -664b -3p 表达低于健康对照组（P 均<0.05）；生物信息学分析显示，miR -664b -3p 与Caspase -1mRNA 的3′UTR 存在互补结合位点；转染miR -664b -3p mimics 可以降低野生型Caspase -1mRNA 3′UTR 荧光素酶报告基因活性（P <0.05），但对突变型Caspase -1mRNA 3′UTR 报告基因活性无显著影响（P >0.05）。

结论
DVT 患者PBMC 中miR -664b -3p 表达降低，可解除对靶基因Caspase -1的表达抑制，Caspase -1活性增强使GS⁃
DMD -N 表达升高，进而导致细胞焦亡及相关炎症因子（IL -1β、IL -18）表达升高，最终导致DVT 。

关键词：深静脉血栓形成；细胞焦亡；微小RNA -664b -3p ；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1；
焦孔素D ；白细胞介素
doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.08.005中图分类号：R392
文献标志码：A
文章编号：1002-266X （2021）08-0020-04
Regulatory role of miR -664b -3p in caspase -1-mediated pyroptosis in patients with deep vein thrombosis CHU Chu 1，LIU Wen ，GUO Hong ，ZHAO Lin ，WEI Ran ，ZHANG Zhen ，GUO Qiang ，ZHU Xiaoxiao ，WANG Bin ，LI Xia
1School of Basic Medicine （Institute of Basic Medicine ），Shandong First Medical University ，Jinan 250062，China
Abstract ：Objective
To observe the changes of microRNA -664b -3p （miR -664b -3p ）and Caspase -1levels in the
peripheral blood of patients with deep vein thrombosis （DVT ），and to explore the regulatory relationship between them in pyroptosis.Methods
Thirty cases of healthy subjects （healthy control group ）and 30cases of DVT patients （DVT
group ）were collected ，and their peripheral blood on a empty stomach was drawn to separate serum and peripheral blood
mononuclear cells （PBMCs ），respectively.The activity of Caspase -1（Cleaved Caspase -1）and the active fragment of gas⁃dermin D N （GSDMD -N ）in the PBMCs were detected by Western blotting.The expression of miR -664b -3p was detected by qPCR.The protein expression of serum interleukin -1β（IL -1β）and interleukin -18（IL -18）was detected by ELISA.
Target scan 7.2software was used to predict whether there were complementary binding sites between miR -664b -3p and Caspase -1mRNA 3′UTR ，and the wild -type and mutant Caspase -1mRNA 3′UTR plasmids containing binding sites were constructed ，respectively ，and the effect of miR -664b -3p on the luciferase reporter gene activity was detected by double lu⁃
ciferase reporter gene system.Results
The expression of Cleaved Caspase -1，GSDMD -N ，IL -1β，and IL -18proteins
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81673981）；山东省重点研发项目（2017GSF19118）。

第一作者简介：褚楚（1994-），女，硕士研究生，主要研究方向为表观遗传免疫调控。

E -mail ：2711001483@ 通信作者简介：王彬（1979-），男，博士，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向为炎症与静脉血栓。

E -mail ：2801505631@
李霞（1979-），女，博士，研究员，博士研究生导师，主要研究方向为表观遗传免疫调控。

E -mail ：lixia@.
cn
开放科学（资源服务）
标识码（OSID ）
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was higher and miR-664b-3p expression was lower in PBMC of the DVT group than in the healthy control group（all P< 0.05）.Bioinformatics analysis showed that there were complementary binding sites between miR-664b-3p and3′UTR of Caspase-1mRNA；transfection of miR-664b-3p mimics could reduce the activity of3′UTR luciferase reporter gene of wild-type Caspase-1mRNA（P<0.05），but had no significant effect on the activity of3′UTR reporter gene of mutant Caspase-1 mRNA（P>0.05）.Conclusion The expression of miR-664b-3p in PBMC of DVT patients decreased，and then the inhi⁃bition on the expression of its target gene Caspase-1was released；elevated Caspase-1activity significantly increased the expression of GSDMD-N protein，which resulted in pyroptosis and increased expression of IL-1βand IL-18，and ultimately led to the formation of DVT.
Key words：deep venous thrombosis；pyroptosis；microRNA-664b-3p；Caspase-1；gasdermin D；interleukin
深静脉血栓形成（DVT）是临床常见的周围血管疾病，因血液在深静脉内不正常凝固导致静脉回流障碍［1］。

目前DVT的发病机制尚不清楚，探讨其发病机制对于寻找有效的防治措施具有重要意义。

细胞焦亡是一种炎性程序性细胞死亡，由两种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）介导，包括经典的Cas⁃
pase-1和非经典的Caspase-4/5/11。

其中，Caspase-1可激活白细胞介素（IL）1β和IL-18前体产生成熟的IL-1β和IL-18，同时裂解焦孔素D（GSDMD）形成具有成孔作用的活性片段GSDMD-N以诱导细胞焦亡［2］。

微小核糖核酸（miRNAs）通过与其靶基因3′非翻译区（3′UTR）结合抑制基因转录或翻译［3］。

越来越多的研究表明，miRNAs参与了DVT的发生和发展，但其调控细胞焦亡在DVT中的作用尚未见报道。

2020年2月—10月，我们通过检测DVT患者外周血细胞焦亡相关蛋白及miR-664b-3p水平变化，探讨miR-664b-3p通过靶向调控Caspase-1介导细胞焦亡在DVT发病中的作用，为临床治疗DVT提供新的靶点与依据。

1资料与方法
1.1临床资料将2019年1月—2020年1月收治的急性期DVT患者纳入研究。

纳入标准：①符合第3版《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》［4］中的诊断标准，属于急性期混合型单纯下肢DVT；②单侧肢体发病，病程<15d；③年龄18~80岁；④尚未采用溶栓等药物治疗。

排除标准：①合并活动性下肢溃疡；②合并心、脑、肺疾病及肝、肾功能异常；③有出血性疾病或出血倾向；④妊娠期妇女。

本研究共收集DVT患者30例（DVT组），男18例、女12例，年龄（56.8±6.2）岁；选取同期健康志愿者30例（健康对照组），男14例、女16例，年龄（54.8±7.6）岁。

两组性别、年龄具有可比性。

本研究经山东中医药大学附属医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2标本采集与试剂准备受试对象均于清晨空腹抽取静脉血6mL，分离血清用于ELISA检测，经
人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞（PBMC）用于qPCR和Western blotting检测。

实验主要试剂：人外周血淋巴细胞分离液、RIPA裂解液购于索莱宝科技有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture 均购于北京康为世纪生物科技公司；miRNA1st
Strand cDNA Synthesis Kit购于南京诺唯赞生物科技有限公司；293T细胞购于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；人IL-1β、IL-18蛋白ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；miR-664b-3p mimics（上游序列为5′-UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA-3′，下游序列为5′-UAGGCUGGGAGGCAAAUGAAUU-3′）、阴性对照（NC，上游序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCAC⁃GUTT-3′，下游序列为5′-ACGUGACACGUUCG⁃GAGAATT-3′）及miR-664b-3p、内参U6引物由上海吉玛公司设计合成，引物序列见表1；Caspase-1抗体、GAPDH抗体购自英国Abcam公司；GSDMD-N抗体购于美国Novus Biologicals公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购于北京中杉金桥公司；野生型与突变型Caspase-13′UTR载体均由美国Promega公司设计合成。

1.3PBMC中活化的Caspase-1（Cleaved Caspase-1）、GSDMD-N及miR-513c-5p检测
1.3.1Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白检测采用Western blotting法。

用RIPA裂解液提取各组PBMC总蛋白，SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，转膜；5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜；1×PBST洗膜（10min×4次），二抗室温摇床孵育1h；1×PBST洗膜表1miR-664b-3p、U6基因引物序列及产物片段
基因
miR-664b-3p
上游引物
下游引物
U6
上游引物
下游引物
引物序列（5′→3′）
GTGTACTTCATTTGCCTCCCAG
TATCCTTCTTCACGACTCCTTAC
CAGCACATATACTAAAATTGGAACG
ACGAATTTGCGTGTCATCC
产物长度（bp）
73
76
21
（10min×4次），加入显影液显影，化学发光法染色；Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与GAPDH灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

1.3.2miR-664b-3p检测采用qPCR法。

用TRIzol法进行提取各组PBMC中的RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度与纯度。

按照miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行miRNA的cD⁃NA合成，选用UltraSYBR Mixture PCR反应体系进行PCR扩增，以2－ΔΔCt计算miR-664b-3p相对表达量。

1.4血清IL-1β、IL-18蛋白检测取离心所得血清，以ELISA法检测IL-1β、IL-18蛋白，按照试剂盒说明书操作。

使用酶标仪测定双波长（450nm、630 nm）处的光密度（OD）值，依据标准品OD值绘制标准曲线，计算IL-1β、IL-18蛋白水平。

1.5miR-664b-3p与Caspase-1的关系预测采用Target Scan7.2生物信息学软件，预测miR-664b-3p 与Caspase-1mRNA3′UTR之间是否存在直接结合位点。

1.6miR-664b-3p靶向调控Caspase-1情况观察以pmirGLO为载体构建包含结合位点的野生型及突变型Caspase-1mRNA3′UTR质粒，然后转染293T 细胞，同时分别转染miR-664b-3p mimics及NC，24h 后收集细胞并检测双荧光素酶报告基因活性。

1.7统计学方法采用GraphPad Prism7.0统计软件。

计数资料以-x±s表示，两组数据比较行配对t 检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1两组PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表达水平比较由表2可见，DVT组较健康对照组PBMC中Cleaved-Caspase-1、GSDMD-N 蛋白表达升高而miR-664b-3p表达降低（P均<0.05）。

2.2miR-664b-3p与Caspase-1关系的生物信息学预测结果miR-664b-3p与Caspase-1mRNA3′UTR 之间具有潜在的互补结合位点，提示miR-664b-3p 可能通过结合Caspase-1mRNA的3′UTR进而抑制其表达。

2.3miR-664b-3p对Caspase-1mRNA3′UTR荧光素酶报告基因活性的影响由表3可见，转染miR-664b-3p mimics可以降低野生型Caspase-1mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性（P<0.05），但对突变型Caspase-1mRNA3′UTR报告基因活性无显著影响（P>0.05）。

2.4两组血清IL-1β、IL-18蛋白水平比较由表4可见，DVT组较健康对照组外周血IL-1β及IL-18蛋白水平升高（P均<0.05）。

3讨论
DVT是因静脉壁损伤、静脉血流滞缓、血液高凝状态引起的周围血管疾病，其急性期导致的肺栓塞及慢性期血栓形成后的综合征严重危害患者生命安全及生活质量［5］。

因此，DVT的发病机制具有重要的研究意义。

内皮细胞损伤和功能障碍是DVT 发生的重要因素，然而导致血管内皮细胞损伤的机制尚未完全阐明。

细胞焦亡是一种炎性程序性细胞死亡，其特征是GSDMD介导的细胞膜肿胀破裂和IL-1β、IL-18引起的炎症反应［6］。

当炎症小体被激活时，Caspase-1和其他非经典Caspase将其GSDMD切割成N-端和C-端，从而破坏蛋白之间的抑制作用。

游离的GSD⁃MD-N末端能够与质膜结合，并在细胞膜上产生内径12~14nm的孔隙，导致细胞肿胀、裂解，并成为释放炎症因子（如IL-1β、IL-18）的通道［7］。

炎症反应是区别细胞焦亡与细胞凋亡的重要标志。

适当的细胞焦亡及炎症反应对于阻断病原体复制、直接杀灭胞内菌及维持机体内环境稳定具有重要作用，但细胞焦亡不足或过度将导致细胞增殖失控或组织损伤，引起疾病的发生和发展［8］。

研究发现，细胞焦亡减少可导致肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力增强，而细胞焦亡过度导致的组织损伤参与了动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病等疾病的病理过程［9-10］。

然而，目前细胞焦亡在静脉血栓性疾病中的作用和调控机制尚未
表2两组PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表达比较（-x±s）
组别DVT组
健康对照组n
30
30
Cleaved
Caspase-1
2.04±0.11*
1.00±0.04
GSDMD-N
2.37±0.05*
0.99±0.05
miR-664b-3
0.67±0.05*
1.02±0.08
注：与健康对照组相比，*P<0.05；表3miR-664b-3p对Caspase-1mRNA3′UTR荧光素酶报告基因活性的影响（-x±s）
转染物
miR-664b-3p mimics
NC
Caspase-1mRNA3′UTR荧光素酶
报告基因活性
野生型
0.74±0.00*
1.00±0.04
突变型
1.00±0.08
0.99±0.03
注：与转染NC的细胞相比，*P<0.05。

表4两组血清IL-1β、IL-18蛋白水平比较（-x±s）
组别
健康对照组
DVT组
n
30
30
IL-1β
1.45±0.13
5.56±0.17*
IL-18
123.00±15.55
526.00±16.03*注：与健康对照组相比，*P<0.05。

22
见报道。

本研究发现，DVT患者外周血细胞焦亡相关蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18表达均上调，提示Caspase-1介导的细胞焦亡引起内皮细胞损伤参与了DVT的发病。

探索DVT发病过程中细胞焦亡的调控机制，可能为DVT的临床治疗提供新的有效靶点。

miRNAs是非编码RNA领域研究的热点。

越来越多的证据表明，miRNAs参与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导等生理过程的调控，以及多种疾病的发生发展［11］。

近年来，miRNAs在血管内皮损伤和DVT发展中的作用越来越受到重视。

研究发现，miR-195-5p表达升高，促进血管内皮细胞凋亡，从而参与DVT发病［12］。

我们前期研究发现，miR-338-5p 表达降低导致的IL-6表达升高，以及miR-374a-5p、miR-374b-5p表达升高导致的IL-10表达降低，均与DVT的发生发展有关［13-14］。

同时，有研究发现miR⁃NAs对细胞焦亡有调节作用。

例如，miR-590-3p通过靶向NLRP1/NOX4信号通路抑制细胞焦亡从而减轻糖尿病视网膜病变［15］；miR-214可通过抑制Caspase-1介导的细胞焦亡，抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移［16］。

尽管已有上述发现，但miRNAs影响细胞焦亡在DVT发病中的作用仍不清楚。

有研究报道，miR-664b-3p参与了喉鳞状细胞癌、胰腺癌等肿瘤发生发展［17］。

本研究发现，DVT 组患者外周血PBMC中miR-664b-3p表达较健康对照组降低，细胞焦亡相关蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N及IL-1β、IL-18蛋白表达升高。

生物信息软件Target Scan预测显示，miR-664b-3p与Caspase-1 mRNA的3′UTR之间存在潜在碱基互补结合位点。

双荧光素酶报告基因系统证实，miR-664b-3p能够与Caspase-1mRNA3′UTR之间通过碱基互补配对直接结合，进而抑制Caspase-1的转录与翻译。

以上结果提示，miR-664b-3p表达降低能够解除其对靶基因Caspase-1表达的抑制，Caspase-1活性增强可通过切割GSDMD形成有活性的N片段，进而在细胞膜上形成孔道，导致细胞焦亡及炎症因子释放，损伤血管内皮功能，最终导致DVT。

总之，本研究进一步阐释了DVT的发病机制，提示miR-664b-3p调控Caspase-1介导的细胞焦亡参与了DVT的发生发展；因此，靶向上调miR-664b-3p 表达以抑制Caspase-1及血管内皮细胞焦亡、保护血管内皮功能可能成为临床治疗DVT新的有效方式。

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