211105474_肿瘤相关中性粒细胞对人子宫内膜癌细胞EMT进程及自噬的影响研究

中国免疫学杂志2023 年第 39 卷
肿瘤相关中性粒细胞对人子宫内膜癌细胞EMT 进程及自噬的影响研究①
方秋满 邓青春 周小飞 王发辉 （海南医学院第二附属医院妇科，海口570311）
中图分类号 R737.33 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）03-0494-06［摘
要］ 目的：探究肿瘤相关中性粒细胞（TAN ）对子宫内膜癌（EC ）细胞上皮-间质转化（EMT ）过程及自噬的影响及机
制。

方法：通过免疫组织化学染色观察EC 组织内TAN 浸润情况，分离人TAN ，经瑞氏-吉姆萨染色和流式细胞术鉴定TAN ；建立EC 细胞系HEC -1-A 与TAN 共培养体系，并给予自噬抑制剂3MA 干预，具体分为HEC -1-A 组、TAN+HEC -1-A 组、TAN+3MA -HEC -1-A 组，处理结束后收集各组HEC -1-A 细胞，细胞免疫荧光染色观察HEC -1-A 细胞内E -钙黏蛋白（E -cadherin ）与波形蛋白
（Vimentin ）染色情况，Western blot 测定细胞中EMT 相关蛋白E -cadherin 、Vimentin 、N -cadherin 、MMP -2、MMP -9表达水平，Tran⁃swell 检测细胞的迁移数目与侵袭数目，免疫荧光染色观察细胞内自噬标志物LC3表达情况，Western blot 测定细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin -1、p62表达水平。

结果：EC 组织内TAN 标志物CD15阳性表达高，TAN 浸润明显；分离的TAN 呈圆形或椭圆形，细胞核多呈分叶状（2~5叶），且CD11b +Ly6G +标记的细胞比例达91.0%；与HEC -1-A 组细胞相比，TAN+HEC -1-A 组细胞内E -cadherin 荧光染色强度明显减弱，Vimentin 荧光染色强度明显增强，细胞中E -cadherin 蛋白相对表达量显著下调， Vimentin 、N -cadherin 、MMP -2和MMP -9蛋白相对表达量显著上调，细胞迁移数目与侵袭数目均显著增加，细胞内LC3荧光染色强度明显增强，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著上升，Beclin -1蛋白相对表达量显著上调，而p62蛋白相对表达量显著下调，差异均有统计学意义（P <0.05）；与TAN+HEC -1-A 组相比，TAN+3MA -HEC -1-A 组细胞内E -cadherin 荧光染色强度明显增强，而Vimentin 荧光染色强度明显减弱，细胞中E -cadherin 蛋白相对表达量显著上调，Vimentin 、N -cadherin 、MMP -2和MMP -9蛋白相对表达量显著下调，细胞迁移数目与侵袭数目均显著减少，同时，细胞内LC3荧光染色强度明显减弱，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著下降，Beclin -1蛋白相对表达量显著下调，p62蛋白相对表达量显著上调，差异均有统计学意义（P <0.05）。

结论：TAN 能够促进EC 细胞EMT 进程并增强细胞自噬，使用自噬抑制剂3MA 干预后，TAN 诱导的EC 细胞EMT 与自噬均受到抑制。

［关键词］ 子宫内膜癌；肿瘤相关中性粒细胞；上皮-间质转化；自噬
Effects of tumor -associated neutrophils on EMT process and autophagy in human endometrial cancer cells
FANG Qiuman ， DENG Qingchun ， ZHOU Xiaofei ， WANG Fahui. Department of Gynecology ， the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College ， Haikou 570311， China
［Abstract ］ Objective ：To explore the effect and mechanism of tumor associated neutrophil （TAN ） on epithelial -mesenchymal transition （EMT ） in endometrial cancer （EC ） cells. Methods ：Infiltration of TAN in EC tissue was observed by immunohistochemical staining ， human TAN was isolated and identified by Wright's -Giemsa staining and flow cytometry ； co -culture system of EC cell line HEC -1-A and TAN was established ， and given autophagy inhibitor 3MA to intervene ， specific groups were HEC -1-A group ， TAN+HEC -1-A group and TAN+3MA -HEC -1-A group. After treatment ， HEC -1-A cells in each group were collected. Cell immunofluores⁃cence staining was used to observe the staining of E -cadherin and Vimentin in HEC -1-A cells ， Western blot was used to determine expression levels of EMT -related proteins E -cadherin ， Vimentin ， N -cadherin ， MMP -2， MMP -9 in cells ， Transwell was used to deter⁃
mine the number of migration and invasion of cells ， immunofluorescence staining was used to observe expression of autophagy marker
LC3 in cells ， Western blot was used to determine expression levels of autophagy -related proteins LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ， Beclin -1， p62 in cells. Results ：Positive expression of TAN marker CD15 in EC tissue was high ， and TAN infiltration was obvious ； the isolated TAN was round or oval ， the nuclei were mostly lobulated （2~5 lobes ）， and proportion of CD11b +Ly6G + labeled cells reached 91.0%； com⁃pared with cells in HEC -1-A group ， fluorescence staining intensity of E -cadherin in cells of TAN+HEC -1-A group was significantly weak⁃
ened ， while fluorescence staining intensity of Vimentin was significantly increased ， relative expression of E -cadherin protein in cells
doi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.03.008
①本文为海南省科协青年科技英才创新计划项目（QCXM202018）。

作者简介：方秋满，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤方面的研究，E -mail ：lili03021@ 。

通信作者及指导教师：邓青春，男，医学博士，副主任医师，主要从事妇科肿瘤方面的研究，E -mail ：qingchun0503@ 。

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方秋满等肿瘤相关中性粒细胞对人子宫内膜癌细胞EMT进程及自噬的影响研究第 3 期
was significantly down-regulated， while relative protein expressions of Vimentin， N-cadherin， MMP-2 and MMP-9 were significantly up-regulated， the number of migration and invasion cells were significantly increased， intensity of intracellular LC3 fluorescent stain⁃ing was significantly increased， and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ was significantly increased， relative expression of Beclin-1 protein was signifi⁃cantly up-regulated， while relative expression of p62 protein was significantly down-regulated， the differences were statistically signifi⁃cant （P<0.05）； compared with TAN+HEC-1-A group， intracellular E-cadherin fluorescence staining intensity in TAN+3MA-HEC-1-A group was significantly enhanced，while Vimentin fluorescence staining intensity was significantly reduced，relative expression of E-cadherin protein in cells was significantly up-regulated， relative protein expressions of Vimentin， N-cadherin， MMP-2 and MMP-9 were significantly down-regulated， the number of migration and invasion cells were significantly reduced. At the same time， intracellular LC3 fluorescence staining intensity was significantly weakened，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ was significantly decreased，relative expression of Beclin-1 protein was significantly down-regulated， while relative expression of p62 protein was significantly up-regulated， the diffe-rences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion：TAN can promote EMT process of EC cells and enhance autophagy， after intervention with autophagy inhibitor 3MA， both EMT and autophagy induced by TAN in EC cells are inhibited.
［Key words］Endometrial cancer；Tumor-associated neutrophils；Epithelial-mesenchymal transition；Autophagy
在我国，子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）发病率不断上升，且发病年龄趋于年轻化［1］。

根据生物学行为和预后，将EC分为两种类型：Ⅰ型EC常出现在肥胖、高脂血症和雌激素过多症患者中，显示出子宫内膜样肿瘤良好至中度分化的组织学特点；而Ⅱ型EC组织学分化差，多为浆液性癌、透明细胞癌或癌肉瘤，临床侵袭性特征表现为有深度侵入子宫肌层的趋势，诊断时已处于晚期，频繁复发并导致预后不良［2-3］。

近年来，已将靶向治疗与常规治疗相结合用于复发性或转移性EC患者的临床治疗，并取得了良好效果。

肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutro⁃phil，TAN）在许多癌症类型的免疫微环境中发挥重要作用，其表面蛋白组成和细胞因子/趋化因子活性方面与循环中性粒细胞不同，能够起到促肿瘤功能，增强肿瘤细胞的侵袭和转移、血管生成及细胞外基质重塑，同时具有抑制抗肿瘤免疫监视作用［4-5］。

目前，已有大量研究分析TAN和肿瘤细胞间的相互作用，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）作为一种特征明确的胚胎学过程，已确定其在肿瘤进展、侵袭和转移中发挥关键作用，并且是肿瘤细胞获得更强攻击性的一种方式［6］。

但关于TAN对EC细胞EMT的影响及作用机制尚未见报道。

自噬是一种相对保守的生物学过程，与肿瘤发生发展密切相关，其可降解肿瘤细胞中错误折叠的蛋白质和受损细胞器，为肿瘤细胞提供所需的营养物质以维持其生长，从而阻止细胞凋亡。

鉴于此，本研究通过构建EC细胞系HEC-1-A与TAN共培养体系，旨在明确TAN对EC细胞EMT进展及自噬的调控作用，为EC的临床诊疗提供新思路。

1 材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　实验细胞　人EC细胞系HEC-1-A购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2　主要材料与试剂　DMEM培养基、山羊血清购于美国Gibco公司；自噬抑制剂3MA购于江苏凯基生物技术公司；免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物公司；Matrigel基质胶、Transwell小室购于美国Corning公司；瑞氏吉姆萨染色液、DAB显色试剂盒购于北京百奥博莱生物公司；TritonX-100试剂购于上海西格生物科技公司；DAPI染料、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物研究所；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG购于北京康为世纪生物科技公司；小鼠抗CD15单克隆抗体（ab233867）、兔抗CD11b单克隆抗体（ab133357）、兔抗Ly6G单克隆抗体（ab238132）、兔抗E-cadherin单克隆抗体（ab40772）、兔抗Vimentin单克隆抗体（ab92547）、兔抗N-cadherin单克隆抗体（ab76011）、兔抗MMP-2单克隆抗体（ab92536）、兔抗MMP-9单克隆抗体（ab76003）、兔抗LC3-Ⅱ单克隆抗体（ab192890）、兔抗LC3-Ⅰ多克隆抗体（ab128025）、兔抗Beclin-1单克隆抗体（ab207612）、兔抗GAPDH 多克隆抗体（ab9485）购于英国Abcam公司；异硫氰酸荧光素（FITC）荧光标记的山羊抗兔（131156-0.1）购于北京天恩泽基因科技有限公司。

1.1.3　临床资料　收集2021年3月至 2022年2月于海南医学院第二附属医院接受手术治疗的EC患者肿瘤组织标本和癌旁组织标本各25例，并采集外周血标本，所有患者均经影像与病理组织学检查确认，患者临床资料按相关标准收集并保存。

纳入标
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本的EC患者年龄为39~68岁，平均年龄为（51.65±5.17）岁。

患者无其他部位肿瘤及肿瘤病史，无高血压、心脏病、传染性疾病等病史，尚未接受激素、化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗。

患者均签署知情同意书，本研究方案经海南医学院第二附属医院伦理委员会审批通过。

1.2　方法　
1.2.1　免疫组化染色　将收集的EC组织及癌旁组织浸入4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片机制成约4 μm厚的切片。

取制备的组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，以柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢溶液水浴加热孵育后，将切片与10%山羊血清共孵育，37 ℃孵育封闭1 h。

加入鼠抗人CD15单克隆抗体，4 ℃过夜，复温后，PBS清洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS再次清洗，DAB显色，苏木精染细胞核。

流水反复冲洗后，中性树胶封固，光学显微镜下观察组织染色结果，CD15标记的中性粒细呈棕黄色至棕褐色，对中性粒细胞进行计数，随机选取不重复的6个视野，结果以平均每视野中的中性粒细胞比例表示。

1.2.2　中性粒细胞的分离　空腹采集患者肘静脉血5 ml置于无菌离心管，加入等量PBS混合均匀，取中性粒细胞分离液4 ml，以1∶1比例将稀释好的血液加于分离液的液面上，2 000 r/min离心20 min，此时离心管中液体出现两层环状乳白色细胞层，弃掉1、2层液体，以适量PBS重悬沉淀，加入羟乙基淀粉混合均匀，室温静置30 min。

吸取上层液体，加入4 ml红细胞裂解液裂解2 min，再以2 000 r/min离心20 min，弃上清，PBS重悬，重复该操作3次，得到中性粒细胞，加入培养基常规培养备用。

1.2.3　瑞氏-吉姆萨染色　取培养的中性粒细胞，调整密度为1×106个/ml，取细胞悬液均匀涂于载玻片上，自然晾干，甲醇固定10 min，滴加瑞氏-吉姆萨染液覆盖玻片上的细胞，室温染色25 min，PBS清洗后，流水冲洗干净，晾干后，中性树胶封固，光学显微镜下观察细胞染色结果。

1.2.4　流式细胞术　取1 ml中性粒细胞悬液加入无菌离心管，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入100 μl PBS重悬，加入1 μl FC Block，4 ℃孵育5 min，并依次加入1 μl APC标记的CD11b抗体与PE标记的Ly6G抗体，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗，再加入500 μl PBS重悬，流式细胞仪检测CD11b+Ly6G+标记的中性粒细胞比例。

1.2.5　细胞共培养体系建立　利用Transwell小室建立TAN细胞与HEC-1-A细胞的共培养体系，实验分为3组，具体处理如下：①HEC-1-A组，HEC-1-A 细胞正常培养；②TAN+HEC-1-A组，Transwell小室底层为HEC-1-A细胞，上层为TAN细胞；③TAN+
3MA-HEC-1-A组，Transwell小室底层为自噬抑制剂3MA（5 mmol/L）与HEC-1-A细胞，上层为TAN细胞。

将上述分组处理的细胞体系均置于37 ℃、5%CO2恒温箱内培养24 h，然后收集各组HEC-1-A细胞进行后续实验检测。

1.2.6　细胞免疫荧光染色　收集处理后的3组HEC-1-A细胞，PBS冲洗，4%多聚甲醛室温固定30 min，滴加0.5%TritonX-100透膜处理15 min，10%山羊血清室温封闭后，加入兔抗人E-cadherin 多克隆抗体（1∶100）、兔抗人Vimentin单克隆抗体（1∶100）与兔抗人LC3多克隆抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜，次日，复温后，PBS洗涤，加入对应荧光二抗，室温避光孵育1 h，清洗干净，DAPI避光染色，室温处理10 min，PBS再次洗涤，中性树胶封固，荧光显微镜下观察细胞染色情况。

1.2.7　Western blot　在收集的3组HEC-1-A细胞中加入RIPA裂解液，置于冰上裂解，提取总蛋白后通过BCA法定量。

将提取的蛋白样品与上样缓冲液混合，100 ℃沸水浴5 min变性。

配制10%分离胶和5%浓缩胶，将蛋白加入胶孔后经电泳分离，电转至PVDF膜。

5%山羊血清封闭1 h，将印迹分别与E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、N-cadherin （1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）特异性一抗在4 ℃下共孵育过夜。

TBST清洗后，加入对应二抗室温孵育1 h，TBST再次清洗。

利用ECL避光显影，Image-Pro Plus 6.0软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的灰度值之比统计各蛋白相对表达量。

1.2.8　Transwell实验　将Matrigel胶稀释后，涂于Transwell小室上室内表面，置于37 ℃下形成基质屏障层。

以不含胎牛血清的新鲜培养液将收集的3组HEC-1-A细胞密度均调整为2×104个/ml，吸取200 μl 悬液加入上室，再吸取600 μl含胎牛血清的新鲜培养液加入下室。

将小室孵育24 h后取出，棉签擦去未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色10 min，光学显微镜下观察细胞分布，统计穿膜细胞数目，随机选取不重复的6个视野，结果以平均每视野中的侵袭细胞数目表示。

迁移细胞数目检测除
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不在Transwell小室上室内表面涂Matrigel胶外，其他步骤与上述一致。

1.3　统计学分析　采用SPSS23.0软件进行数据分析，GraphPad Prism 8.30软件绘制统计图。

符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示。

多组间比较采用单因素方差分析，LSD-t检验进行组内两两比较，P<
0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果
2.1　EC组织内TAN的浸润情况及鉴定结果　免疫组化染色结果如图1A所示，相较于癌旁组织，EC 组织内染色较多且颜色加深，中性粒细胞标志物CD15阳性表达率达76.80%，说明组织内TAN浸润较为明显。

通过瑞氏-吉姆萨染色观察到细胞呈圆形或椭圆形，胞膜和核膜较薄，细胞核多呈分叶状（2~5叶），细胞质内染色均匀，见图1B；流式细胞术检测结果显示，CD11b+Ly6G+标记的细胞比例达91.00%，见图1C，以上结果提示分离得到了纯度较高的TAN。

2.2　TANs对EC细胞EMT的影响　免疫荧光染色结果显示，与HEC-1-A组细胞相比，TAN+HEC-1-A 组细胞内E-cadherin荧光染色强度明显减弱，Vi⁃mentin荧光染色强度明显增加；而与TAN+HEC-1-A 组相比，TAN+3MA-HEC-1-A组细胞内E-cadherin荧光染色强度明显增强，Vimentin荧光染色强度明显减弱，见图2。

Western blot测定各组MC3T3-E1细胞EMT相关蛋白表达，结果见图3，与HEC-1-A组细胞相比，TAN+HEC-1-A组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量显著下调，Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量显著上调（P<0.05）；与TAN+
HEC-1-A组相比，TAN+3MA-HEC-1-A组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量显著上调，而Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量显著下调（P<0.05）。

2.3　TANs对EC细胞迁移与侵袭的影响　Tran⁃swell检测细胞迁移与侵袭，结果见图4，TAN+HEC-1-A组HEC-1-A细胞迁移数目与侵袭数目均较HEC-1-A组显著增多（P<0.05），而TAN+3MA-HEC-1-A组细胞迁移数目与侵袭数目均显著少于TAN+ HEC-1-A组（P<0.05）。

2.4　TANs对EC细胞自噬水平的影响　免疫荧光染色观察各组MC3T3-E1细胞内自噬标志物LC3表达，结果见图5A，与HEC-1-A组细胞相比，TAN+ HEC-1-A组细胞内LC3荧光染色强度明显增强；与TAN+HEC-1-A组相比，TAN+3MA-HEC-1-A组细胞内LC3荧光染色强度明显减弱。

Western blot测定各组MC3T3-E1细胞自噬相关蛋白表达，结果见图5B，与HEC-1-A组相比，TAN+ HEC-1-A组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著上升，Beclin-1蛋白相对表达量显著上调，而p62
蛋白相对表达量
图1　EC组织内TAN的浸润与鉴定（×100）
Fig.1　TAN infiltration and identification in EC tissue
（×100
）
图2　免疫荧光染色检测各组MC3T3-E1细胞内E-cad⁃
herin、Vimentin荧光表达（×100）
Fig.2　Fluorescence expressions of E-cadherin and Vimen⁃
tin in MC3T3-E1 cells of each group detected by
immunofluorescence staining （×100）
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显著下调（P <0.05）；与TAN+HEC -1-A 组相比，TAN+3MA -HEC -1-A 组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著下降，Beclin -1蛋白相对表达量显著下调，p62蛋白相
对表达量显著上调（P <0.05）。

3 讨论
考虑到靶向治疗在实体恶性肿瘤中的有效性及相对较小的副作用，根据肿瘤个体分子表型的特征采用个体化靶向治疗，有望改善多种肿瘤的治疗结果［7］。

近年来，靶向疗法已在EC 治疗方面取得重大进展，然而，在建立EC 的标准靶向治疗方案上仍存在一些问题：第一，由于相当大的遗传畸变取决于肿瘤的发生背景，因此，应进行全面的临床前研究以阐明遗传畸变的确切功能；第二，应持续探索
适合靶向药物的特异性生物标志物，以改善治疗结果；第三，靶向药物的临床益处应在大型前瞻性临床试验中得到验证，开发分子靶向药物的研究也有望通过扩展临床适用的治疗方式改善治疗结果，尤
其是在EC 高等级组织学亚型中［8］。

中性粒细胞参与先天性和适应性免疫系统调节，并可响应环境信号而极化为不同表型，其主要功能包括自身的吞噬作用、释放裂解酶和产生活性氧。

然而，越来越多的证据表明，在肿瘤微环境下肿瘤组织中TAN 浸润与不良的临床结果相关，并且能够促进各种类型肿瘤的生长、侵袭、血管生成及转移［9-10］。

TAN 通过旁分泌作用释放具有促肿瘤或抗肿瘤功能的细胞因子和趋化因子来影响肿瘤进展，此外，TAN 还可通过释放中性粒细胞胞外陷阱捕获循环肿瘤细胞，促进肿瘤在体内的转移［11］。

ANCEY 等［12］研究发现在肺部肿瘤组织中TAN 积累与肿瘤细胞活性增加，通过介导其内在的Glut1表达进而促进肺癌生长及对放射治疗的抵抗；OGAWA 等［13］研究表明结直肠癌组织内存在大量TAN 积累，同时，趋化因子CXCL1和CXCL8在TAN 浸润的肿瘤组织中均高表达，并促进结直肠癌的发生发展；WANG 等［14］研究指出，在纳入研究的322例胃癌早期患者的肿瘤基质中均检测到TAN 浸润，
其水平与
Note ：1.HEC -1-A group ； 2.TAN+HEC -1-A group ； 3.TAN+3MA -HEC -1-A group. Compared with HEC -1-A group ， *. P <0.05； com⁃
pared with TAN+HEC -1-A group ， #. P <0.05.
图3　Western blot 测定各组MC3T3-E1细胞EMT 相关
蛋白表达
Fig.3　Western blot for expressions of EMT -related pro⁃
teins in MC3T3-
E1 cells in each group
Note ：Compared with HEC -1-A group ， *. P <0.05； compared with
TAN+HEC -1-A group ， #. P <0.05.
图4　Transwell 观察各组MC3T3-E1细胞迁移与侵袭Fig.4　Transwell to observe migration and invasion of
MC3T3-
E1 cells in each group
Note ：1.HEC -1-A group ； 2.TAN+HEC -1-A group ； 3.TAN+3MA -HEC -1-A group. Compared with HEC -1-A group ， *. P <0.05； com⁃
pared with TAN+HEC -1-A group ， #. P <0.05.
图5　各组MC3T3-E1细胞内自噬水平检测（×100）Fig.5　Detection of autophagy level in MC3T3-E1 cell in
each group （×100）
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肿瘤大小、Lauren分型、淋巴血管浸润及淋巴结转移呈正相关。

本研究同样发现，EC组织中CD15标记的TAN表达水平明显升高，说明肿瘤组织内TAN浸润现象严重。

结合上述既往研究揭示的TAN在肿瘤进展中的作用，推测靶向TAN可能是一种潜在的新型抗EC疗法。

在EMT过程中，上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞，在此过程中，上皮源性标志物
E-cadherin表达降低，同时，Vimentin、N-cadherin等间充质标志物表达水平升高［15］。

转化后的上皮细胞获得成纤维细胞样特性，表现出细胞间黏附性降低和运动性增加特点，这对于肿瘤转移的发生至关重要，能够提高肿瘤复发的可能性，导致预后不良［16］。

本研究检测结果显示，将TAN与HEC-1-A细胞共培养后，HEC-1-A细胞内E-cadherin荧光染色强度明显减弱、Vimentin荧光染色强度明显增强，细胞中E-cadherin蛋白相对表达量降低，Vimentin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量升高，说明TAN促进了HEC-1-A细胞的EMT过程。

MMP 家族成员在肿瘤的恶性行为中发挥关键作用，包括肿瘤生长、血管生成、增殖、凋亡、侵袭和转移，该家族成员MMP-2和MMP-9在EC中加速肿瘤生长并促进细胞侵袭，MMP-2可水解细胞间基质成分和基底膜Ⅳ型胶原蛋白，MMP-9的主要功能是降解与重塑细胞外基质的动态平衡，两者均是影响恶性肿瘤的EMT进程的重要因素［17-18］。

此外，本实验结果还显示，TAN与HEC-1-A细胞共培养后，HEC-1-A细胞的迁移数目和侵袭数目均增加，提示TAN可促进HEC-1-A细胞的EMT过程，进而提高细胞的迁移与侵袭能力。

自噬的激活可能是肿瘤细胞在缺氧、高酸性、有毒等胁迫环境中存活的一种自我保护机制。

此外，自噬通过塑造炎症性、缺氧性、免疫抑制性和代谢性肿瘤微环境，在肿瘤发生和抗癌治疗中发挥环境依赖性作用［19-20］。

在初始阶段，细胞质中游离的LC3-Ⅰ与PE结合并经历脂化形成LC3-Ⅱ，其位于自噬体外膜，因此，LC3-Ⅱ是自噬体形成的特异性靶标［21］。

Beclin-1是众所周知的自噬关键调节因子，该蛋白通过调节Ⅲ类PI3K依赖性生成的3-磷酸磷脂酰肌醇及随后募集促进自噬体形成的自噬相关ATG蛋白控制自噬过程［22］。

p62在选择性自噬中充当形成蛋白质聚集体的支架，并通过将泛素标记的蛋白质聚集体与自噬体连接以进行降解，从而充当自噬受体［23］。

本研究结果显示，TAN与HEC-1-A 细胞共培养后，HEC-1-A细胞内LC3荧光染色强度明显增强，细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ上升，Beclin-1蛋白相对表达量上调，而p62蛋白相对表达量下调，说明细胞自噬水平提高；而在TAN与HEC-1-A细胞共培养中加入自噬抑制剂3MA处理HEC-1-A细胞后，不仅细胞自噬水平受到抑制，细胞的EMT过程及迁移、侵袭均受抑制。

综上所述，在EC肿瘤细胞与TAN共培养的实验研究中发现TAN能够促进EC肿瘤细胞EMT过程进而提高细胞的迁移与侵袭能力，同时增强自噬水平，而在该共培养体系下，使用自噬抑制剂3MA干预能够抑制EC肿瘤细胞EMT进展。

本研究为进一步探明TAN在EC转移过程中发挥的具体作用打下基础，并可能为EC的治疗提供新思路。

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（编辑陈阳）
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