橡胶草apx基因家族的全基因组鉴定及表达分析

西北植物学报,２０１９,３９(１１):１９３５－１９４２
A c t a
B o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n
．
㊀㊀d o i :１０．７６０６/j ．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１９．１１．１９３５㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀h t t p ://x b z w x b ．a l l j
o u r n a l ．n e t 收稿日期:２０１９Ｇ０７Ｇ１８;修改稿收到日期:２０１９Ｇ１０Ｇ１５
基金项目:海南省自然科学基金创新研究团队项目(２０１８C X T D ３４１);国家自然科学基金面上项目(３１５７０３０１
)作者简介:高㊀璇(１９９５－),女,在读硕士研究生,主要从事橡胶草基因功能分析和生物技术研究.E Ｇm a i l :１５７７３８４８０８＠q q
．c o m ∗通信作者:张雪妍,副研究员,硕士生导师,主要从事天然橡胶生物合成调控机制研究.E Ｇm a i l :z h a n g x u e y
a n _c a a s ＠１２６．c o m 橡胶草A P X 基因家族的全基因组鉴定及表达分析
高㊀璇１,２
,刘进平１,于㊀莉２,袁博轩２,王旭初２,张雪妍２∗
(１海南大学热带作物学院,海口５７０２２８;２海南师范大学生命科学学院,海口５７１１５８
)摘㊀要:该研究利用生物信息学方法,在橡胶草(T a r a x a c u mk o k Ｇs a g h y z )全基因组中鉴定出７个T k A P X s 基因家族成员,进一步分析发现７个成员中有１对是复制基因(T k A P X ４/T k A P X ６).进化分析结果显示,７个基因可分为４个亚组;染色体定位分析表明,T k A P X 基因家族成员分布广泛,７个T k A P X s 基因位于７条不同的染色体上;
亚细胞定位结果表明,T k A P X １㊁T k A P X ３㊁T k A P X ５和T k A P X ７定位于细胞质,T k A P X ４和T k A P X ６定位于质膜,T k A P X ２定位于叶绿体.启动子区域顺式作用元件分析结果显示,橡胶草A P X 基因含有大量的应激反应元件,推测A P X 基因可能对各种外界刺激和胁迫存在灵敏的应激反应机制.实时荧光定量P C R 分析表明,橡胶草７个T k A P X s 基因家族成员在花萼㊁花瓣㊁花梗中表达量均较低,大多数T k A P X s 在根茎叶中的表达水平大于花及胶乳,其中T k A P X １在根和茎中的表达水平最高,推测T k A P X １基因可能在橡胶草生长发育过程中起重要作用.进一步对T k A P X s 基因家族在逆境胁迫(冷㊁热㊁盐㊁旱)和激素(乙烯㊁茉莉酸甲酯)处理下的表达分析显示,T k A P X ３在根及叶中的表达水平均较对照有大幅度升高,推测T k A P X ３基因可能在橡胶草应答逆境胁迫和激素处理反应过程中起重要作用.
关键词:橡胶草;抗坏血酸过氧化物酶;系统进化;基因表达分析中图分类号:Q ７８６;Q ７８９
文献标志码:A
G e n o m e Ｇw i d e I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o f A P X G e n eF a m i l y
i n T a r a x a c u mk o k Ｇs a g h y z G A O X u a n １,
２,L I UJ i n p i n g １,Y U L i ２,Y U A NB o x u a n ２,WA N G X u c h u ２,Z H A N G X u e y
a n ２∗(１C o l l e g e o f T r o p i c a l C r o p s ,H a i n a nU n i v e r s i t y ,H a i k o u ,５７０２２８,C h i n a ;２C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e ,H a i n a nN o r m a l U n i v e r s i t y
,H a i k o u ,５７１１５８,C h i n a
)A b s t r a c t :I n t h i s s t u d y ,７T k A P X s g e n e sw e r e i d e n t i f i e d i n T a r a x a c u mk o k Ｇs a g h y z w h o l e g e n o m eu s i n g b i o i n f o r m a t i cm e t h o d s ．F u r t h e ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a t２g e n e s (T k A P X ４/T k A P X ６)w e r er e p
l i c a t i o n g e n e s ．A c c o r d i n g t ot h er e s u l t so f p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p
s ,７T k A P X g e n e s w e r ed i v i d e di n t of o u r g r o u p s ．T h e c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o na n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e ７T k A P X g e n e sw e r ew i d e l y d i s t r i b u t e d a n dl o c a t e d o n ７d i f f e r e n t c h r o m o s o m e s ．S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t T k A P X １,T k A P X ３,T k A P X ５a n d T k A P X ７w e r e l o c a l i z e d i n t h e c y t o p
l a s m ,T k A P X ４a n d T k A P X ６w e r e l o c a l i z e d o n t h e p l a s m am e m b r a n e ,a n d T k A P X ２w a s l o c a l i z e d i n t h e c h l o r o p l a s t ．T h e a n a l y s i s o f t h e c i s Ｇa c t i n g e
l e Ｇm e n t i n t h e p r o m o t e r r e g i o ns h o w s t h a t t h e r e a r e a l a r g en u m b e r o f s t r e s s r e s p
o n s e e l e m e n t s i n T k A P X s s e q u e n c e ,s u g g e s t i n g t h a t t h e r em i g h t b e s e n s i t i v e s t r e s s r e s p
o n s eo f T k A P X s t ov a r i o u s e x t e r n a l s t r e s s ．R e a l Ｇt i m e q u a n t i t a t i v eP C Ra n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f ７T k A P X g e n e s f a m i l y m
e m b e r s i n c a l y x e s ,p e t a l s a n d p e d i c e l sw e r e l o w．T h ee x p
r e s s i o n l e v e l o fm o s t T k A P X s i nr o o t sa n d l e a v e sw a s g r e a t e r t h a n t h a t o f f l o w e r s a n d l a t e x ．T k A P X １h a s t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n l e v e l i n r o o t s a n d s t e m s ,s u g
Ｇ
g e s t i n g t h a t i tm a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f T．k o kＧs a g h y z．F u r t h e r m o r e, w ed e t e c t e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f T k A P X g e n e sa f t e rs t r e s s(c o l d,h o t,s a l t,d r o u g h t)a n dh o r m o n e (e t h y l e n e,m e t h y l j a s m o n a t e)t r e a t m e n t s．T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f T k A P X３i n r o o t s a n d l e a v e s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l i n d i c a t e d t h a t T k A P X３m a y b e i n v o l v e d i n t h e s t r e s s r e s p o n s e a n d h o r m o n e r e s p o n s e i n T．k o kＧs a g h y z．
K e y w o r d s:T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z;a s c o r b a t e p e r o x i d a s e;p h y l o g e n y a n a l y s i s;g e n e e x p r e s s i o na n a l y s i s
㊀㊀橡胶草(T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z R o d i n,简称T K S),属菊科(A s t e r a c e a e)蒲公英属(T a r a x a c u m)大角蒲公英组(S e c t．M a c r o c o r n u t a V．S o e s t),与巴西橡胶树㊁银胶菊并称世界三大产胶植物,又俗称俄罗斯蒲公英(R u s s i a nd a n d e l i o n)[１],或者新疆橡胶草(X i n j i a n g R u b b e rG r a s s)[２Ｇ３],原产于哈萨克斯坦和中国的天山区域[４],在中国东北㊁华北及西北等地均有小规模野生种群分布,是一种多年生草本植物.其根部天然橡胶含量高达２０％以上,个别植株可达２０％~２７．８７％[５].橡胶草具有生长周期短,产胶量较大,适应性广,遗传转化相对容易,当年播种即可收获,并且具有适合机械规模化生产等优点,是最有发展前景的天然橡胶产胶潜在替代植物之一.随着中国天然橡胶自给率逐年下降以及对进口橡胶的依赖程度日益增强,新型天然橡胶资源的开发和高效利用是保障天然橡胶战略安全的有效途径[６].因此,在世界经济快速发展㊁中国天然橡胶刚需巨大的背景下,橡胶草将有可能成为新世纪重要的新型天然橡胶产胶替代作物,有着巨大的发展前景.
生物在有氧代谢的过程中会产生活性氧(R O S),其在植物细胞应答环境因素中起着重要作用[７].H２O２作为主要的活性氧类型的信号分子,广泛参与植物细胞的发育及抗逆的调节,比如根毛的伸长㊁干旱及盐胁迫响应等[８].在生长发育及应激反应中,活性氧可通过与其他信号或植物激素的相互作用协同或拮抗许多细胞回路[９Ｇ１０].生物或非生物胁迫(干旱㊁盐㊁高温㊁低温等)会使植物产生过多的活性氧物质,对细胞膜和细胞器造成不同程度的损伤[１１].在天然橡胶合成过程中,乳管细胞内活性氧代谢失调会引起黄色体膜破裂,最终导致胶乳原位凝固和产胶衰竭[１２].高温的胁迫还会提高氧扩散速度并且活化氧化反应,从而加速橡胶氧化反应速度,影响天然橡胶的质量[１３].因此在橡胶草中的活性氧清除和相关酶的进一步利用,对天然橡胶的质量极为重要.
植物体中存在酶类和非酶类两种清除细胞内活性氧的抗氧化系统,其中抗氧化物酶类系统中包括了超氧化物歧化酶(S O D)㊁过氧化氢酶(C A T)㊁谷胱甘肽还原酶(G R)㊁抗坏血酸过氧化物酶(A P X)等[１４].
抗坏血酸过氧化物酶(A P X;E C１．１１．１．１１)是含有血红素的过氧化物酶家族,它以抗坏血酸作为特异性电子供体,催化H２O２生成水,通过清除活性氧维持细胞氧化还原稳态[１５].在高等植物中, A P X基因多以家族的形式存在,并根据不同的亚细胞定位分为４种类型,分别为细胞质型㊁叶绿体型㊁线粒体型和微体型[１６].拟南芥A P X有８个家族成员,其中３个位于细胞质,２个位于叶绿体,另外３个位于过氧化物酶体.目前,棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m)[１１]㊁水稻(O r y z as a t i v a)[１７]㊁菠菜(S p iＧn a c i a o l e r a c e a)[１４]等物种的A P X基因家族成员已经被鉴定分析.
优质橡胶草品系的培育及推广将成为天然橡胶商业化应用的重要原料来源,是应对当前中国大量进口天然橡胶问题的途径之一.橡胶草较易进行组织培养和遗传转化,可以利用分子改良的方法创制新材料,用于橡胶草的品系培育,但前提是需要对其生长发育及各种抗逆境的分子机制开展相关研究.本研究从橡胶草基因组中鉴定出７个T k A P X s家族成员,利用生物信息学技术全面分析橡胶草A P X 基因家族成员的染色体定位㊁基因结构㊁进化关系㊁启动子区域的顺式作用元件及表达模式等,为深入探索T k A P X在橡胶草生长发育及响应非生物胁迫过程中的分子机制提供一定的理论基础.
１㊀材料和方法
１．１㊀材㊀料
实验于２０１８~２０１９年进行,选取生长良好㊁大小一致的播种后２０d橡胶草无菌幼苗为材料,分别进行以下处理:
１)低温处理:将环境温度(２４ʃ２)ħ下生长的植株转移到４ħ的生长室.
２)高温处理:将环境温度(２４ʃ２)ħ下生长的植株转移到３７ħ的生长室.
６３９１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷
３)干旱处理:将植株从培养基中取出,用自来水洗净根部后,迅速浸泡于１０％P E G６０００溶液中.４)盐分处理:将植株从培养基中取出,自来水洗净根部后迅速浸泡于２００m m o l/LN a C l溶液中.５)激素处理:叶面分别喷施１００m g/L乙烯利和０．８m m o l/L茉莉酸甲酯,以喷施含２．２％无水乙醇的蒸馏水处理的橡胶草为对照.
收集对照(未处理)及以上处理３㊁６㊁１２和２４h 后植物材料的叶片及根,用于分析T k A P X响应胁迫及激素的表达情况,每个处理３次重复.
选取生长于人工气候室的橡胶草植株,采集不同生长阶段不同组织(花萼㊁花瓣㊁花梗㊁主根㊁侧根㊁茎㊁幼叶㊁老叶㊁一年胶乳㊁两年胶乳),用于T k A P X 组织特异性表达分析.
１．２㊀方㊀法
１．２．１㊀橡胶草A P X基因家族成员的鉴定㊀从N CＧB I上获得橡胶草基因组数据库,利用已经鉴定的拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)及水稻(O r y z a s a t i v a) A P X基因家族成员的蛋白序列作为查询序列,通过本地B l a s t p得到橡胶草A P X候选基因(e v a l u e 小于１e－１０)[１８].对所获得的序列利用I n t e r P r o S c a n (h t t p://w w w．e b i．a c．u k/i n t e r p r o/)检测是否有A P X基因保守结构域(I P R００２０１６),得到７个最终确定的橡胶草A P X基因家族成员.使用E x p a s y数据库的在线分析工具C a l c u l a t e(h t t p://c a．e x p a s y．o r g/t o o l s/p i_t o o l．h t m l)预测蛋白相对分子质量和等电点[１９].利用在线软件S o f t b e r r y(h t t p://l i n u x１．s o f t b e r r y．c o m/)分析其亚细胞定位[２０].１．２．２㊀染色体定位和复制分析㊀用M a p I n s p e c t软件[１８]分析橡胶草A P X基因的染色体分布情况.用D N AMA N软件分析橡胶草A P X基因间的亲缘关系,核酸序列相似性大于９０％定义为复制基因[２１].１．２．３㊀M o t i f分析㊀利用在线软件M E M E(h tＧt p://m e m eＧs u i t e．o r g/t o o l s/m e m e)分析氨基酸序列,得到橡胶草A P X基因的保守基序[２２].１．２．４㊀系统进化树构建及基因结构分析㊀使用分子进化分析软件M E G A６．０的C l u s t a lW程序[２３]对橡胶草㊁拟南芥㊁水稻及向日葵(H e l i a n t h u sa n nＧu u s)A P X蛋白序列进行比对,采用相邻连接法(n e i g h b o rＧj o i n i n g,N J)构建系统发育树,对构建的发育树进行评估.使用基因结构在线分析软件G SＧD S(h t t p://g s d s．c b i．p k u．e d u．c n/i n d e x．p h p),通过比较橡胶草A P X基因的C D S与其相应的基因组序列来分析内含子Ｇ外显子结构[２４].１．２．５㊀启动子区域的顺式作用元件分布㊀为了研究橡胶草A P X基因启动子区域中的顺式作用元件,从橡胶草基因组数据库中检索每个A P X基因起始密码子上游１５００b p区域的序列.然后将这些序列提交到在线分析软件P l a n t C A R E(h t t p:// b i o i n f o r m a t i c s．p s b．u g e n t．b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/ h t m l/)以预测其顺式作用元件[２５].１．２．６㊀基因特异性表达分析㊀使用天根植物R N A 提取试剂盒(D P４４１ＧH)提取橡胶草的总R N A, T h e r m o s c i e n t i f i c R e v e r t A i d F i r s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i sK i t用于将总R N A反转为c D N A.利用P r i m e r软件设计T k A P X１Ｇ７的特异性引物.使用C h a m Q T M U n i v e r s a lS Y B R Q p c r M a s t e r M i x在A B I S t e p O n e P l u s上进行实时荧光定量P C R.采用２－әәC T法计算基因的相对表达水平,T k A c t i n作为内参基因,每个基因３个独立的生物学重复.热图使用M u l t i E x p e r i m e n tV i e w e r(M e V)软件绘制[２０].２㊀结果与分析
２．１㊀橡胶草A P X基因家族成员鉴定
在橡胶草基因组数据库中,利用拟南芥和水稻A P X基因家族蛋白序列进行B l a s t p分析,经过保守结构域确认,得到７个橡胶草T k A P X s基因,分布于７个独立的基因组组装脚手架片段(s c a f f o l d)上.根据其所在s c a f f o l d的大小分别命名为T k A P X１㊁T k A P X２㊁T k A P X３㊁T k A P X４㊁T k A P X５㊁T k A P X６和T k A P X７(图１).橡胶草A P X基因家族成员的开放阅读框长度分布于７５３b p(T k A P X３㊁T k A P X５)至１３４１b p(T k A P X１)之间,由其编码的蛋白质氨基酸长度为２５０~４４６a a.蛋白质相对分子质量在２７．３６~５０．１８k D之间,等电点最小为５．０８(T k A P X１),最大为８．１(T k A P X４㊁T k A P X６).
亚细
图１㊀A P X基因在橡胶草染色体上的定位
F i g．１㊀L o c a t i o no f A P X g e n e s o n c h r o m o s o m e s o f
T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z
７３９１
１１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀高㊀璇,等:橡胶草A P X基因家族的全基因组鉴定及表达分析
表１㊀橡胶草A P X 基因家族信息
T a b l e １㊀I n f o r m a t i o no f A P X g e n e f a m i l y i n T a r a x a c u mk o k Ｇs a g h y
z 基因G e n e 基因编号
G e n e I D 开放阅读框
O R F /b p P r o t e i n 蛋白长度S i z e /a a 分子量MW /k D
等电点p I 亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n
T k A P X １e v m．T U．u t g ５４２１．９１３４１４４６５０．１８５．０８细胞质C y t o p l a s m i c T k A P X ２e v m．m o d e l ．u t g ８９４３．１０１０５３３５０３８．０３６．７７叶绿体C h l o r o p
l a s t T k A P X ３e v m．m o d e l ．u t g ５２６０．６７５３２５０２７．５２５．２３细胞质C y t o p l a s m i c T k A P X ４e v m．m o d e l ．u t g ９５２８．１０１２９３４３０４６．４９８．１０质膜P l a s m am e m b r a n e T k A P X ５e v m．m o d e l ．u t g
２６４４６．１２７５３２５０２７．３６５．５４细胞质C y t o p l a s m i c T k A P X ６e v m．m o d e l ．u t g ４４８．５１２９３４３０４６．４６８．１质膜P l a s m am e m b r a n e
T k A P X ７
e v m．T U．u t g
１８３７９．５８５５
２８４
３１．２８
５．８５
细胞质C y t o p l a s m i
c 图２㊀橡胶草A P X 家族成员M o t i f 分析
F i g ．２㊀M o t i f a n a l y s i s o f t h eT k A P Xf a m i l y m
e m b e r s 胞定位结果表明,T k A P X １㊁T k A P X ３㊁T k A P X ５和
T k A P X ７定位于细胞质,T k A P X ４和T k A P X ６定位
于质膜,T k A P X ２定位于叶绿体(表１).２．２㊀橡胶草A P X 基因家族蛋白保守基序分布分析
为了研究橡胶草A P X 蛋白序列的保守性,
进行了保守基序分布分析,利用M E M E 对橡胶草A P X
蛋白序列进行分析,预测到１０个保守基序.发现亲缘关系相近的成员具有相似的保守基序分布(图２).每个T k A P X m o t i f 数目在２~１０之间,m o t i f １和
m o t i f ７存在于所有T k A P X 中.T k A P X １㊁
T k A P X ３㊁T k A P X ５和T k A P X ７具有相同的m o t i f
.m o t i f ８和m o t i f ９为T k A P X ４和T k A P X ６特有.
２．３㊀橡胶草A P X 基因家族进化分析
为了明确橡胶草A P X 基因家族与其他物种间
的进化关系,利用拟南芥(８个A P X 基因)㊁水稻(８个A P X 基因)㊁向日葵(９个A P X 基因)
及橡胶草A P X 基因家族的蛋白序列构建系统进化树(图３),根据进化分析,将其分为５个亚组.T k A P X ３和T k ．橡胶草;A t ．拟南芥;O s ．水稻;H a ．向日葵
图３㊀橡胶草和其他植物A P X 基因家族进化树T k ．T a r a x a c u mk o k Ｇs a g h y z ;A t ．A r a b i d o p
s i s t h a l i a n a ;O s ．O r y
z a s a t i v a ;H a ．H e l i a n t h u s a n n u u s F i g ．３㊀P h y l o g
e n e t i c t r e e o fA P X
f a m i l i e s i n T a r a x a c u mk o k Ｇs a
g
h y
z a n do t h e r p l a n t s ８３９１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷
T k A P X５聚类到A亚组,T k A P X１和T k A P X７聚类到B亚组,T k A P X４和T k A P X６属于C亚组, T k A P X２属于E亚组,而D亚组没有橡胶草A P X 基因家族的成员,可能是因为在长期进化过程中T k A P X的功能发生了分化.根据以上分析可以看出,橡胶草不同的A P X家族成员之间存在着一定的进化差异,推测可能通过多重机制来清除细胞内的活性氧,达到抗氧化的效果.
由图４可以看出,T k A P X的外显子数目为７~１２个,且亲缘关系相近的成员外显子数目保持一致,如T k A P X１和T k A P X７,鉴定的复制基因(T k A P X４/T k A P X６)具有完全一致的内含子(i nＧt r o n)Ｇ外显子(e x o n)结构.
２．４㊀橡胶草A P X基因家族启动子区域的顺式作用元件分布
㊀㊀翻译起始位点上游的１５００b p
序列用来分析顺
T k．橡胶草;A t．拟南芥
图４㊀橡胶草A P X基因家族进化及基因结构
T k．T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z;A t．A r a b i d o p s i s t h a l i a n a
F i g．４㊀P h y l o g e n e t i c a n de x o nＧi n t r o n s t r u c t u r e a n a l y s e s o f A P X g e n e s i n T a r a x a c u mk o kＧs a g h y
z
图５㊀T k A P X启动子区域的顺式作用元件分布
F i g．５㊀D i s t r i b u t i o no f c i sＧe l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r r e g i o n s o f T k A P X g e n e s
９３９１１１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀高㊀璇,等:橡胶草A P X基因家族的全基因组鉴定及表达分析
式作用元件的分布,根据系统发育关系将T k A P X 分为４组.不同的顺式作用元件用不同颜色的大写字母表示(图５),其中包括２个转录起始(红色)㊁６个响应植物激素反应(绿色)和１７个应激反应(紫色)的顺式作用元件,这意味着应激反应和激素共同调控橡胶草A P X的表达.从图５可以看出,复制基因T k A P X４/T k A P X６启动子具有相似的顺式作用元件分布.
２．５㊀橡胶草A P X基因家族成员表达模式分析图６显示,７个T k A P X s家族成员在花萼㊁花瓣㊁花梗中表达量均较低;复制基因T k A P X４/ T k A P X６在８个不同组织中的表达水平相似; T k A P X５在８个组织中均低丰度表达;随着橡胶草的生长发育,叶和胶乳中的T k A P X１㊁T k A P X２㊁T k A P X７表达水平有不同程度的上升,且T k A P X１在根和茎中的表达水平最高.大多数T k A P X在根茎叶中的表达水平大于花及胶乳.
分析乙烯及茉莉酸甲酯处理后A P X基因家族成员的表达规律发现:在叶中除了T k A P X３,其他均低于对照材料叶中对应的T k A P X的表达水平,推测T k A P X３在橡胶草响应乙烯及茉莉酸信号的过程中起重要作用,其他家族成员反向调节,尤其是T k A P X５的表达水平显著低于对照,对激素处理表现负反馈;茉莉酸甲酯处理后的橡胶草根部中,７个T k A P X s表达量与叶中规律完全不同,除了T k A P X５的表达水平显著低于对照,其余６个家族成员表达水平均有不同程度的升高,其中T k A P X１及T K A P X３提高的程度最为明显,且均为６h达到最高;乙烯处理后的橡胶草根中,却是只有T K A P X３表达量升高,其他成员表达量均降低.
低温㊁高温和盐分处理后,橡胶草的根及叶中T K A P X３表达水平也均大幅度升高,说明其在响应冷㊁热㊁盐胁迫中起着重要作用.其中,P E G处理后叶及根中T K A P X３出现先升高后降低的趋势
;
图６㊀T k A P X表达模式分析
F i g．６㊀E x p r e s s i o n p a t t e r na n a l y s i s o f T k A P X
０４９１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷
T k A P X１表达水平在高低温和盐分处理后叶中均变化不大,只有干旱胁迫后有降低;T K A P X５的表达在各种胁迫后均大幅降低.
３㊀讨㊀论
A P X是重要的抗氧化酶类之一,对于维持植物体内活性氧代谢平衡有着重要作用[７,２６].当高等植物受到生物或者非生物胁迫时,A P X会调控一系列生理生化反应,快速清除植物细胞中过量的H２O２,使细胞免受活性氧的毒害.目前对A P X基因克隆及功能的研究主要集中在拟南芥㊁棉花等植物,而在橡胶草中却罕见报道.
橡胶草基因组数据的获得为其基因家族的分析提供了基础,便于进一步了解基因功能及调控机制.本研究从橡胶草的全基因组序列中鉴定出７个A P X家族成员,与拟南芥(８个)㊁水稻(８个)㊁玉米(９个)相近.通过进化分析,可以看出亲缘关系近的成员具有相同的亚细胞定位,比如１对复制基因T k A P X４和T k A P X６均定位于细胞质膜.基于不同成员的亚细胞定位分析结果,可以推测他们的功能具有多样性,通过多细胞器配合,多重机制清除细胞内多余的活性氧.
基因结构的差异在基因家族的进化过程中起着重要的作用[２７].对拟南芥及橡胶草的A P X基因家族成员基因结构分析,发现同一个亚组的成员具有相似但不完全相同的内含子㊁外显子结构,表明在长期的进化过程中T k A P X的功能发生了分化.错义突变K a和同义突变K s比值可用来估算复制基因在进化过程中受到的自然选择类型.如K a/K s大于１,则认为有正选择效应;反之则认为有纯化选择作用;如K a/K s等于１,则为中性选择.本研究对具有复制关系的T k A P X４/T k A P X６进行K a/K s 计算,结果小于１,处于纯化选择.
从启动子区域的顺式作用元件分析可看出,橡
胶草A P X基因的启动子均含有大量的应激反应元件,由此可推测其表达可能受应激反应严格控制.
实时荧光定量P C R结果表明,T k A P X１在未做处理的不同组织中均表达且表达量高于其他家族成
员,推断其在橡胶草生长发育中起着更重要作用. T k A P X５在不同组织中均低丰度表达.复制基因T k A P X４/T k A P X６表达模式基本一致,由此推测其在橡胶草生长发育中发挥着相似的作用.在４ħ㊁３７ħ㊁N a C l㊁P E G处理橡胶草后,根和叶中的T k A P X３表达水平均上升,说明其可能在橡胶草响应胁迫中起着重要的作用.T K A P X５的表达在各种胁迫后表现了负反馈,均大幅降低,推测其有可能在相关的分子机制中有重要的作用.４ħ冷处理橡胶草叶后,T k A P X４/T k A P X６表达水平先升高后下降到处理前水平,T k A P X１的表达量变化不大.茉莉酸甲酯是一种重要的植物激素,其与植物的生长发育及抗逆反应息息相关.马海霞等[２８]研究发现,一月生的橡胶草叶面喷施M e J A促进橡胶草乳管分化,同时M e J A诱导植物活性氧的积累[２９],橡胶草的主根长度㊁主根粗度㊁叶绿素含量㊁根系活力㊁P A L活性和木质素含量均高于对照处理,还有利于橡胶草植株抗性的增强.本研究发现M e J A处理橡胶草的根后,T k A P X１和T k A P X３表达水平均提高,且T k A P X１在胶乳中的表达水平相对较高,推测其可能在胶乳活性氧代谢调控中起着重要的作用.
本研究首次鉴定了橡胶草A P X基因家族,基于系统进化关系将７个基因分为４个亚组,并鉴定出１对复制基因(T k A P X４/T k A P X６).进一步的表达分析表明,该家族可能在橡胶草生长发育及应激反应中起重要作用.可作为后续研究的候选基因,开展相关功能验证的研究,并用于橡胶草分子改良新材料的创制.
参考文献:
[１]㊀中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志[M]．北京:科学出版社,１９９９．
[２]㊀谢全亮,李鸿彬,王旭初．橡胶草９０年来主要研究成果及最新研究进展[J]．植物科学学报,２０１９,３７(３):４０４Ｇ４１２．
X I E QL,L IH B,WA N GXC．R e c e n t p r o g r e s s i n t h e s t u d y o fr u b b e r g r a s s(T a r a x a c u m k o kＧs a g h y z R o d i n)a n d m a i n
a c h i e v e m e n t so v e rt h e p a s tn i n e t yy e a r s[J]．P l a n tS c i e n c e
J o u r n a l,２０１９,３７(３):４０４Ｇ４１２．
[３]㊀X I E QL,D I N G G H,Z HU LP,e t a l．P r o t e o m i c l a n d s c a p e o f t h e m a t u r er o o t s i nar u b b e rＧp r o d u c i n gg r a s s T a r a x a c u m
k o kＧs a g h y z[J]．I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f M o l e c u l a rS c i e n c e s,２０１９,２０(１０):２５９６．
[４]㊀K I R S C H N E RJ,ŠTĚP N E KJ,C㊅E R N T,e t a l．A v a i l a b l e
e xs i t u g e r m p l a s m o ft h e p o t e n t i a lr u b b e rc r o p T a r a x a c u m k o kＧs a g h y z b e l o n g s t oa p o o rr u b b e r p r o d u c e r,T．b r e v i c o rＧn i c u l a t u m(C o m p o s i t a eＧC r e p i d i n a e)[J]．G e n e t i c R e s o u r c e s a n d
C r o p E v o l u t i o n,２０１３,６０(２):４５５Ｇ４７１．
[５]㊀仇㊀键,张继川,罗世巧,等．橡胶草的研究进展[J]．植物学报,２０１５,５０(１):１３３Ｇ１４１．
Q I UJ,Z HA N GJC,L U OSQ,e t a l．R e s e a r c h a d v a n c e s a n d p e r s p e c t i v e so n r u b b e rＧp r o d u c i n g T a r a x a c u m[J]．C h i n e s e
１４９１
１１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀高㊀璇,等:橡胶草A P X基因家族的全基因组鉴定及表达分析
B u l l e t i no f B o t a n y,２０１５,５０(１):１３３Ｇ１４１．
[６]㊀高玉尧,刘㊀洋,许文天,等．不同施肥处理对橡胶草生物量积累与分配变化及相关性分析[J]．分子植物育种,２０１８,１６(９):２９７９Ｇ２９８６．
G A O Y Y,L I U Y,X U W T,e t a l．C h a n g e s o f b i o m a s s a c c uＧ
m u l a t i o na n dc o r r e l a t i o na n a l y s i si nd i f f e r e n tf e r t i l i z e rt r e a tＧm e n t s i n T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z[J]．M o l e c u l a rP l a n tB r e e dＧi n g,２０１８,１６(９):２９７９Ｇ２９８６．
[７]㊀P A N D E Y S,F A R T Y A L D,A G A RWA L A,e t a l．A b i o t i c s t r e s s t o l e r a n c e i n p l a n t s:m y r i a d r o l e s o f a s c o r b a t e p e r o x i d a s e [J]．F r o n t i e r s i nP l a n t S c i e n c e,２０１７,８:５８１．[８]㊀Q U AL,D I N GYF,J I A N GQ,e t a l．M o l e c u l a rm e c h a n i s m s o f t h e p l a n th e a ts t r e s sr e s p o n s e[J]．B i o c h e m i c a la n d B i oＧp h y s i c a lR e s e a r c hC o m m u n i c a t i o n s,２０１３,４３２(２):２０３Ｇ２０７．[９]㊀P A T E R S O N A H,W E N D E LJF,e t a l．R e p e a t e d p o l y p l o i d i z aＧt i o n o f G o s s y p i u m g e n o m e s a n d t h e e v o l u t i o n o f s p i n n a b l e c o t t o n f iＧ
b r e s[J]．N a t u r e,２０１２,４９２(７４２９):４２３Ｇ４２７．
[１０]㊀T A O C C,J I N X,Z HU L P,e t a l．T w oＧd i m e n s i o n a l g e l
e l e c t r o p h o r e s i sＧb a s e d p r o t e o m i ca n a l y s i sr e v e a l s NＧt e r m i n a l
t r u n c a t i o no f t h eH s c７０p r o t e i n i nc o t t o n f i b e r s i n v i v o[J]．
S c i e n t i f i c R e p o r t s,２０１６,６:３６９６１．
[１１]㊀刘㊀娜,吴金华,安亚茹,等．陆地棉抗坏血酸过氧化物酶基因家族全基因组生物信息学分析[J]．棉花学报,２０１７,２９
(１):１７Ｇ２８．
L I U N,WUJH,A N YR,e t a l．B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f
t h e a s c o r b a t e p e r o x i d a s e g e n e f a m i l y i n t h e G o s s y p i u mh i r s uＧ
t u m L．g e n o m e[J]．C o t t o n S c i e n c e,２０１７,２９(１):１７Ｇ２８．[１２]㊀郭秀丽．橡胶树H b G R X基因的克隆及其在死皮病发生过程中的功能分析[D]．海口:海南大学,２０１７．
[１３]㊀吴文剑．大分子受阻酚抗氧剂的合成与表征及其对天然橡胶抗热氧老化作用的研究[D]．广州:华南理工大学,２０１５．[１４]㊀郁征宇,葛晨辉,王小丽,等．菠菜抗坏血酸过氧化物酶基因家族的鉴定及表达分析[J]．上海师范大学学报(自然科学
版),２０１８,４７(６):６６４Ｇ６７２．
Y UZY,G ECH,WA N GXL,e t a l．I d e n t i f i c a t i o n a n d e xＧ
p r e s s i o na n a l y s i s o f a s c o r b a t e p e r o x i d a s e g e n e f a m i l y i n s p i nＧ
a c h[J]．J o u r n a l o f S h a n g h a iN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l
S c i e n c e s),２０１８,４７(６):６６４Ｇ６７２．
[１５]㊀乔㊀枫,耿贵工,曾㊀阳,等．枸杞抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆与表达分析[J]．中国农业大学学报,２０１９,２４(４):６４Ｇ７２．
Q I A OF,G E N G G G,Z E N G Y,e t a l．M o l e c u l a rc l o n i n g
a n de x p r e s s i o n p a t t e r n so f L c A P X f r o m L y c i u mc h i n e n s e
[J]．J o u r n a l o f C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,２０１９,２４(４):
６４Ｇ７２．
[１６]㊀S H I G E O K AS．R e g u l a t i o na n d f u n c t i o no f a s c o r b a t e p e r o x iＧ
d a s ei s o
e n z y m e s[J]．J o u r n a lo
f E x p e r i m e n t a l B o t a n y,
２００２,５３(３７２):１３０５Ｇ１３１９．
[１７]㊀T E I X E I R AFK,M E N E Z E SＧB E N A V E N T EL,G A L VÃOV C,e t a l．R i c e a s c o r b a t e p e r o x i d a s e g e n e f a m i l y e n c o d e s f u n cＧ
t i o n a l l y d i v e r s ei s o f o r m sl o c a l i z e di n d i f f e r e n t s u b c e l l u l a r
c o m p a r t m e n t s[J]．P l a n t a,２００６,２２４(２):３００Ｇ３１４．[１８]㊀T A OCC,J I N X,Z HU LP,e t a l．G e n o m eＧw i
d
e i n v e s t i g aＧt i o na n d e x p r e s s i o n p r o
f i l i n
g o f A P X g e n e f a m i l y i n G o s s y p iＧ
u mh i r s u t u m p r o v i d e n e w i n s i g h t s i n r e d o xh o m e o s t a s i sm a i nＧ
t e n a n c e d u r i n g d i f f e r e n t f i b e r d e v e l o p m e n t s t a g e s[J]．M o l e cＧ
u l a r G e n e t i c s a n dG e n o m i c s:M G G,２０１８,２９３(３):６８５Ｇ６９７．[１９]㊀A R T I MO P,J O N N A L A G E D D A M,A R N O L D K,e t a l．
E x P A S y:S I B b i o i n f o r m a t i c sr e s o u r c e p o r t a l[J]．N u c l e i c
A c i d sR e s e a r c h,２０１２,４０(W１):W５９７ＧW６０３．
[２０]㊀J I NX,Z HULP,Y A OQ,e t a l．E x p r e s s i o n p r o f i l i n g o fm iＧt o g e nＧa c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e g e n e sr e v e a l s t h e i re v o l u t i o nＧ
a r y a n df u n c t i o n a l d i v e r s i t y i nd i f f e r e n t r u
b b e r t r e e(H e v e a
b r a s i l i e n s i s)
c u l t i v a r s[J]．G e n e s,２０１７,８(１０):２６１．[２１]㊀T A N G K,D O N GCJ,L I UJY．G e n o m eＧw i
d
e c o m p a r a t i v e
a n a l y s i s o f t h e p h o s p h o l i p a s eD g e n e f a m i l i e s a m o n g a l l o t e tＧ
r a p l o i dc o t t o na n di t sd i p l o i d p r o g e n i t o r s[J]．P L o S O n e,
２０１６,１１(５):e０１５６２８１．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．
０１５６２８１．㊀
[２２]㊀B A I L E Y T L,W I L L I AM SN,M I S L E H C,e t a l．M E M E:
d i s c o v
e r i n g a n da n a l y z i n g D N Aa n d p r o t e i ns e q u e n c em o t i
f s
[J]．N u c l e i cA c i d sR e s e a r c h,２００６,３４(W e bS e r v e r i s s u e):
３６９Ｇ３７３．
[２３]㊀T A M U R A K,S T E C H E R G,P E T E R S O N D,e t a l．M E G A６: m o l e c u l a r e v o l u t i o n a r y g e n e t i c s a n a l y s i s v e r s i o n６．０[J]．M o l e c uＧ
l a r B i o l o g y a n dE v o l u t i o n,２０１３,３０(１２):２７２５Ｇ２７２９．[２４]㊀HU B,J I NJ,G U OA Y,e t a l．G S D S２．０:a n u p g r a d e d g e n e
f e a t u r ev i s u a l i z a t i o ns e r v e r[J]．B i o i n f o r m a t i c s,２０１４,３１
(８):１２９６．D O I:１０．１０９３/b i o i n f o r m a t i c s．
[２５]㊀L E S C O T M,DÉH A I SP,T H I J S G,e t a l．P l a n t C A R E,a
d a t a b a s eo f p l a n t c i sＧa c t i n g r
e g u l a t o r y e l e m e n t s a n da p o r t a l
t o t o o l s f o r i n s i l i c o a n a l y s i s o f p r o m o t e r s e q u e n c e s[J]．N uＧ
c l e i cA c i
d sR
e s e a r c h,２００２,３０(１):３２５Ｇ３２７．
[２６]㊀王亦学,杜建中,郝曜山,等．过量表达G h A P X基因提高中林美荷杨耐盐性[J]．分子植物育种,２０１７,１５(７):２５７９Ｇ２５８３．
WA N G Y X,D UJZ,H A O YS,e t a l．O v e rＧe x p r e s s i o no f
G h A P X g e n e i n t h e i m p r o v e m e n t o f s a l t t o l e r a n c e i nP o p u l u s s p
[J]．M o l e c u l a r P l a n tB r e e d i n g,２０１７,１５(７):２５７９Ｇ２５８３．[２７]㊀Z HU XD,WA N G M Q,L I XP,e t a l．G e n o m eＧw i d e a n a l yＧs i s o f t h e s u c r o s e s y n t h a s e g e n e f a m i l y i n g r a p e(V i t i s v i n i fＧ
e r a):s t r u c t u r e,e v o l u t i o n,a n d e x p r e s s i o n p r o
f i l e s[J]．
G e n e s,２０１７,８(４):E１１１．
[２８]㊀马海霞,何丽娜,海春燕,等．茉莉酸甲酯对橡胶草生理生化及乳管分化的影响[J]．石河子大学学报(自然科学版),
２０１７,３５(４):４５１Ｇ４５７．
MA H X,H ELN,H A ICY,e t a l．E f f e c t s o fm e t h y l j a sＧ
m o n a t e o n p h y s i o l o g y,b i o c h e m i s t r y a n d l a t i c i f e r d i f f e r e n t i aＧ
t i o no f T a r a x a c u mk o kＧs a g h y z[J]．J o u r n a l o f S h i h e z iU n iＧ
v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e),２０１７,３５(４):４５１Ｇ４５７．[２９]㊀吕静祎,张㊀睿,张梦媛,等．茉莉酸甲酯处理对采后苹果果皮活性氧相关代谢的影响[J]．食品工业科技,２０１８,３９
(７):２７１Ｇ２７５,２８５．
LÜJY,Z H A N GR,Z HA N G M Y,e t a l．E f f e c t s o fm e t h y l
j a s m o n a t e t r e a t m e n to nr e l a t e d m e t a b o l i s m o f r e a c t i v eo x yＧ
g e ns p e c i e s i n t h e p e e l o f p o s t h a r v e s t a p p l e f r u i t[J]．S c i e n c e
a n d T e c h n o l o g y o f F o o d I n d u s t r y,２０１８,３９(７):２７１Ｇ
２７５,２８５．
(编辑:宋亚珍)㊀㊀
２４９１西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３９卷。