微载体培养技术在猪用病毒性疫苗研制中的应用进展

微载体培养技术在猪用病毒性疫苗研制中的应用进展
庄金秋;梅建国;马力;李峰;沈志强
【摘要】Microcarrier culture technology is the key technology in the production of vaccines.It reviews the progress on application of the technology in viral vaccine of swine,in order for veterinary science and technology workers and the vast majority of aquaculture owners better understanding of the technology and prepared by the technique of swine vaccine so as to provide references for rational use of vaccine and effective prevention and control of the disease.%微载体培养技术是当下疫苗生产的关键技术。

文章综述了微载体培养技术在猪用病毒性疫苗中的应用进展，以期为兽医科技工作者和广大养殖业主更好地了解该技术及通过该技术制备猪用疫苗，也为合理应用疫苗及有效地预防和控制疾病提供参考。

【期刊名称】《养猪》
【年(卷),期】2016(000)002
【总页数】5页(P124-128)
【关键词】微载体;生物反应器;疫苗;应用进展
【作者】庄金秋;梅建国;马力;李峰;沈志强
【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600
【正文语种】中文
【中图分类】S858.28
微载体（Microcarrier）是指在细胞培养中使用的直径为60～250 μm的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明可悬浮的微球颗粒[1]。

其能使贴壁依赖性的细胞在悬浮培养状态下贴附在表面呈单层生长，这极大地扩增了细胞贴附面积，可以在较短时间内得到大量的细胞，更利于大规模培养和收集细胞。

1967年荷兰学者Van率先开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养动物细胞技术，使动物细胞培养进入了高密度培养阶段[2]。

2008年，我国将动物细胞大规模培养技术生产病毒性疫苗列为“十一五”国家科技支撑计划重点项目，以推动实现疫苗生产关键技术的革新和升级[3]。

农业部自2012年2月1日起，已停止受理转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请[4]。

由于应用生物反应器进行微载体培养技术具有高比表面积、细胞产量高，便于监测、控制和取样，生产规模易于放大，不易染菌等优点，同时还可减少劳动力，提高生产效率，实现大规模自动化生产，因此，该技术无论在人用还是兽用疫苗领域均得到了飞速发展。

贴壁培养是指细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养方法，适用于一切贴壁细胞。

在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、ST细胞和Vero 细胞等[5]。

贴壁细胞培养方法包括方瓶、转瓶、多层平板培养和微载体培养等。

方瓶、转瓶和多层平板培养在产品研发的中、早期使用比较普遍。

但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较繁琐，贴附面积具有限制性，传质和传氧差，每一瓶都是一个独立的细胞培养单元，其细胞质量、病毒产量和滴度均不同，导致疫苗批次间差异大、操作劳动强度高，隐性污染也会引起高内毒素等，在大规模实际生产使用中受到很大的限制。

而微载体培养技术的出现彻底克服了传统工艺表面积不足的限制，能在有限的空间内提供巨大的表面积，实现了培养操作的自动化控制，
降低了污染的机会，减少了人力的投入，并且细胞在良好的生理状态下生长，可以获得高密度贴壁细胞，具有现代化大规模培养贴壁细胞的显著优势。

微载体培养技术自诞生起经过近50年的研究改进，目前已日趋完善和成熟，并广泛应用于细胞工程领域的生产和科研，生产具有重要商业价值和实用意义的细胞产品及生物制品，如白蛋白、病毒疫苗和基因工程产品等。

微载体培养技术中所采用的微载体通常是直径为60～250 μm的固体小珠[6]。

微载体材料按其来源可分为两大类：人工合成聚合物和天然聚合物及其衍生物[7]。

早期微载体多采用人工合成聚合物，如聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（PHEMA）、聚
苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。

这种
微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其表面的黏附、生长。

近年来，越来越多的研究者尝试用天然聚合物及其衍生物来制备微载体。

天然聚合物来源丰富，在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工合成材料，兼备材料学和生物学的特性。

在用于制备微载体的天然聚合物中，研究较多的主要有明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物以及海藻酸盐[8]。

微载体根据物理学特性主要分为固体微载体和液体微载体两类，以前者为常见，又可分为实心微载体和大孔/多孔微载体。

目前适用于微载体系统
的生物反应器有生产型、中试型和实验型。

国内外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统及灌注式生物反应器系统等。

2.1 猪瘟
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。

猪瘟的防制历来是全世界猪瘟存在国非常重视的课题，为此各国都投入了大量的人力、物力，并取得了很大的成绩。

疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。

王延辉等（2010）[9]利用有限稀释
法从现有ST细胞系中克隆出一株对CSFV疫苗株具有高敏感性的克隆细胞株STK，并且初步研究了该克隆株对病毒增殖的稳定性。

将该克隆株用微载体培养后进行攻毒试验，结果显示该克隆株对CSFV疫苗株的增殖具有明显的优势，病毒滴度可达107.0TCID50/mL。

为CSFV传代细胞疫苗的开发提供了基本保障。

漆世华等（2013）[10]采用生物反应器微载体技术大规模培养猪瘟疫苗，微载体的使用密
度为2～25 g/L，采用批式、流加或灌注培养的方式生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度增加了5～10倍，疫苗质量稳定，不存在安
全性问题。

2.2 猪伪狂犬病
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的猪的急性传
染病。

该病在猪群中呈暴发性流行。

引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪的大量死亡，肥育猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

张智明等（2012）[11]建立了应用生物反应器微载体培养ST细胞生产PRV
的方法，细胞活力≥90%、活细胞密度≥1×107cells/mL，病毒液TCID50≥108.0。

其生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污染少且易于处理，病毒液收获方便，质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

2.3 猪细小病毒病
猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV感染主要引起胚胎和胎儿死亡、重吸收、流产、木乃伊胎等，但母猪不表现
明显的症状。

近年来，PPV强毒株的出现使得此病在世界范围内的发病率急剧增加，且范围在不断扩大。

目前，猪细小病毒病的预防方式主要以接种灭活疫苗为主。

高效的灭活疫苗和佐剂能诱导猪体产生大量的病毒中和抗体。

这些抗体能有效预防野毒株的感染。

目前，大多疫苗生产企业仍采用转瓶生产模式进行病毒生产，存在
批次间差异大、占地面积多、劳动强度大等缺点。

李智力等（2015）[12]通过对PPV感染时间（Time of infection,TOI）、感染复数（Multiplicity of infection,MOI）和收毒时间进行优化，成功建立了基于PK-15细胞反应器微载体悬浮培养的工艺，在5 L反应器上最大病毒滴度达到107.2TCID50/mL。

PPV在PK-15细胞增殖的过程中，因PPV对温度敏感，当病毒滴度达到最大值后不能维持，而是持续下降，因此确定合适的收毒时间对PPV生产至关重要。

通过研究PK-15细胞接种PPV后胞外代谢特性，首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度的正相关性，当PPV滴度处于最大值时，乳酸对葡萄糖得率也达到最大值，并从能量和代谢的角度予以阐述，这将为PPV以及其他病毒收毒时间的确定提供重要依据。

2.4 猪流行性乙型脑炎
猪流行性乙型脑炎又名日本乙型脑炎，是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种急性人兽共患传染病。

猪主要特征为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。

刘汉平等（2011）[13]、岳雷等（2013）[14]先后建立了利用微载体系统和生物反应器制备猪乙型脑炎灭活疫苗的方法，使传统病毒滴度提高10倍以上。

将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。

制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。

2.5 猪传染性胃肠炎
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度接触传染性肠道疾病，尤其对2周龄以内的仔猪具有很高的致死率，死亡率可达100%。

该病呈世界性分布，是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一，给各国养猪业均造成了严重的经济损失。

目前对于TGEV仍缺乏有效的临床治疗药物，采用疫苗免疫接种是主要的预防措施。

邹勇等（2005）[15]系统地研究了微载体工艺生产TGEV
的条件。

ST最佳细胞生长条件为低糖DMEM生长液、4.5×104cells/mL细胞接
种密度和5 mg/mL微载体浓度，TGEV最佳生产条件为含0.2%LH的低糖DMEM、5.5 lgTCID50/0.2 mL接种剂量和细胞生长第3天为接种时间。

按此最
佳条件在5 L反应器中生产的TGEV效价为11.0 lgTCID50/0.2 mL，比方瓶工艺
高两个滴度。

动物免疫试验结果表明，微载体工艺生产的TGEV稀释10倍后免疫效果与方瓶工艺一致。

周燕等（2005）[16]通过孔板培养系统以及微载体和转瓶
培养系统，研究了MOI、TOI和病毒维持液对细胞生长和TGEV增殖的影响。

结
果表明，MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量，TOI影响细胞对病毒的敏
感程度以及胞内病毒的增殖速率；丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高；采用微载体和生物反应器系统生产TGEV，病毒效价可达11.3
lgTCID50/0.2 mL，比方瓶培养系统提高约100倍。

邱文英等[17]（2013）为了
大规模生产TGEV抗原，采用生物反应器及微载体进行ST细胞的培养，待微载体上的ST细胞长满至单层后接种TGEV。

共使用生物反应器培养3批TGEV抗原，每批培养过程中分别调节初始细胞密度至2.14×106个/mL、1.83×106个/mL和2.02×106个/mL，微载体浓度为3 g/L、6 g/L和9 g/L。

结果表明应用生物反应器及微载体培养得到抗原的病毒含量均达到108.0TCID50/mL，明显高于转瓶培
养的病毒含量。

何锡忠等（2014）[18]通过生物反应器制备TGEV，研究了微载体浓度、MOI、TOI和病毒维持液对病毒效价的影响，结果表明，分别以1∶500稀释种毒（8.0 lgTCID50/mL）后接种、接种72 h的ST细胞、5 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM＋0.2% LH的参数培养方式效果最为理想。

2.6 猪流行性腹泻
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diahorrea virus,PEDV）引起的以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的一种肠道传染病。

该病常导致10日龄以内仔猪100%的死亡率，为世界各国养猪业目前重要的腹泻疾病之一，给养猪业造
成了巨大的经济损失。

疫苗接种是目前预防该病最好的措施。

王建超等（2003和2004）[19-20]通过研究搅拌速度、pH、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响
以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系，对应用微载体技术和生物反应器系统生产PEDV的可行性进行了探讨。

结果表明，搅拌转速、pH、血清浓度均
对Vero细胞在CT-3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响；当接种密度为
15.0×104/mL时，即每1 mg微载体接种5.0×104细胞时，可以获得较高的细
胞密度；随着微载体浓度的提高，最高细胞密度也增加；在CelliGen反应器中，
采用优化的培养条件，细胞密度可达到174.0×104/mL，是方瓶培养的3.5倍，
每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当，制备的疫苗免疫原性好。

为进一步大规
模生产PEDV疫苗提供基础试验数据。

姜艳平等（2015）[21]为了探索PEDV在
微载体培养Vero细胞上的增殖效果，采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero
细胞和PEDV繁殖，并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件，检测病毒滴度，与
方瓶培养的病毒滴度进行比较。

结果显示，当微载体为5 g，种子细胞数约
3.05×107个，采用灌注式培养，Vero细胞经72 h长满单层，细胞数约为
3.02×109个，此时用滴度为10
4.45TCID50/mL的PEDV 1 mL感染Vero细胞，培养96 h，微载体上80%细胞脱落时收毒，培养的PEDV具有较高的病毒滴度。

相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代，经检测病毒滴度均有提高，但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/mL，明显高于方瓶培养。

这为研究PEDV能更好适应Vero细胞，提高PEDV产量提供技术支持。

2.7 猪蓝耳病
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）又称猪蓝耳病，是一种严重危害养猪业的传染病，给养猪业造成了巨大经济损失。

目前控制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的主要方法是使用疫苗进行免疫防控，而提高病毒增殖滴度是疫苗生产的一个非常重要的环节。

Marc-145细胞是实
验室中用于PRRSV增殖的细胞宿主，同时也是目前猪蓝耳病疫苗的生产用细胞株。

生物反应器微载体悬浮培养Marc-145细胞及PRRSV增殖技术整个生物过程控制精确，易于重复，保证了疫苗产品批次间质量的一致性，并具备了规模放大的可能性。

穆光慧等（2010）[22]通过研究搅拌程序、细胞接种密度、微载体浓度与细
胞生长的关系，探索Marc-145细胞在微载体上的生长条件。

结果表明，细胞接
种密度为4.28×105cells/mL时，病毒滴度可达到107.5TCID50/mL，表明利用
微载体增殖PRRSV是可行的。

梅建国等（2012）[23]应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV），并通过工艺优化，实现了病毒抗原的高效生产。

冯磊等（2012）[24]采用分批式培养方法
研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺。

结果表明，在3 g/L
的微载体用量下，采用3×105cells/mL的初始接种密度及培养至第3天进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。

采用MOI为0.05的接毒比
例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。

在5 L反应器中重复
验证上述工艺，获得较为稳定的试验结果，最大细胞密度均可高于
2×106cells/mL，PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/mL。

为PRRSV疫苗
的生物反应器规模化生产及产品质量控制奠定了基础。

杨雷等（2013）[25]研究
表明，用生物反应器微载体灌注培养Marc-145细胞制备PRRS疫苗工艺可行，
适合大规模工业化生产，有较好的应用前景。

乔自林等（2014）[26]建立了微载
体培养Marc-145细胞增殖PRRSV的多次收毒工艺，在微载体培养条件下Marc-145细胞增殖PRRSV时多次收毒方式所获符合标准的病毒液是正常收毒方式的两倍以上，提高了微载体和种子细胞的利用率，降低疫苗的生产成本。

2.8 猪圆环病毒病
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表的系列疾病的病原，主要侵害6～12周龄的仔猪。

PCV2的
感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。

PCV2感染可以导致动物免疫抑制，从而增强对其他多种病原体的易感性，使病情更加复杂化。

目前疫苗免疫仍是控制PCV2感染引起相关疾病的重要手段。

在疫苗的研制中，病
毒抗原含量对免疫效果影响较大。

由于PCV2在细胞中不产生细胞病变（CPE），体外增殖能力差，增殖滴度不高，因此筛选高滴度病毒株和提高PCV2在细胞中
的增殖滴度是PCV2疫苗研究的关键。

何锡忠（2009和2010）[27-28]研究了反应器、转瓶、方瓶不同培养系统生产PCV2，对转瓶不同参数下的病毒效价情况进行优化比较，最终参数分别以1∶10稀释种毒后接种、接种24 h的PK-15细胞、5～7 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+0.2%水解乳蛋白（LH）的培养
方式效果最为理想。

高金良（2013）[29]为了克服PCV2体外繁殖能力差、增殖
滴度低的缺点，利用微载体贴壁细胞具有高比表面积，细胞产量高、便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易污染等优点，初步探讨利用转管微载体培养PK-15细胞生产PCV2。

结果显示，相同培养液中转管培养PK-15细胞数是普通
方瓶培养细胞数的10倍左右，接毒120.8MOI组在接毒后100 h时病毒含量达
到最高5.53E+06 copies/μL，可以提高病毒滴度1.65倍左右。

表明利用微载体
培养PK-15细胞生产PCV2是可行的，为提高病毒增殖滴度和大规模工业化生产
高效价疫苗抗原提供了技术依据。

乔云龙等（2014）[30]建立了利用WAVE波浪生物反应器生产PCV2灭活疫苗的方法，通过对微载体的含量、细胞接种密度、
细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了PCV2灭活疫苗的生产效率以及免
疫保护效力。

杨霞等（2015）[31]为提高PCV2的增殖规模及单位体积内的病毒
滴度，利用转管微型反应器，采用荧光定量PCR检测方法，对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。

结果显示，转管（内置0.6 g纸片载体）中接种约2.98×107个PK-15细胞，培养7 d细胞增至1.93×108～2.0×108个，并确定培养7 d时为最佳接毒时间；病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI，最佳收
毒时间为接毒后的100 h。

细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系，在细胞生长期内（168 h）平均每个细胞耗糖量为3.09×10-8g/24 h，可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。

相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。

本研究为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。

由于微载体系统培养细胞具有显著的优点，其与生物反应器相结合进行培养具有系统化、自动化的可操作系统，国内外研究人员在微载体的研究与制备方面做了大量工作，因此随着科研方法的不断改进，微载体系统细胞大规模培养技术必将有更为广阔的应用前景。

但微载体系统大规模细胞培养还存在一定的限制因素[32]。

如微载体虽在某些方面进行了改善，但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求；在培养过程中，人们往往忽略了微载体对细胞的生物学作用，不能实现培养过程的阶段性调控；现有的生物反应器系统不能同时满足规模化、剪切力小及混合性能好等特点。

相信随着科研人员对微载体材料进行表面改性来调节其力学和生物降解性能，将生物力学和材料科学的相关成果移植于细胞工程领域，必将实现微载体技术大规模培养的仿生化、自动化和精巧化水平，推进该技术的广泛应用。

反应器细胞培养工艺技术的革新是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。

细胞培养技术在走向全悬浮培养的终极阶段，微载体培养技术必将在漫长的过渡阶段为提高我国疫苗质量、有效地发挥疫苗在我国防控政策中的基础性作用，从而对推动我国从疫苗生产大国走向疫苗生产强国等方面起着重要的示范作用和社会意义。

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为深入贯彻中办、国办《关于加强中国特色新型智库建设的意见》精神和农业部关于加强农业农村经济发展新型智库建设的要求，进一步发挥委员会作用，提升动物科学决策水平，1月8日，第二届全国动物防疫专家委员会在北京宣布成立。

2009年，农业部成立第一届全国动物防疫专家委员会，这是我国动物防疫智库的雏形。

本届全国动物防疫专家委员会选聘了夏咸柱等65名同志为委员会委员，其中包括8名院士。

专家成员中除了兽医专业领域外，还涵盖了经济、科技、质检、林业和公共卫生等领域。

本届专家委员会分设动物传染病、兽医公共卫生、兽医流行病学、外来动物疫病、动物流感、口蹄疫和血吸虫病7个专家组。

出席成立大会的农业部副部长于康震强调，成立专家委员会是保障“十三五”现代畜牧业可持续发展的迫切需要，动物防疫专家委员会要当好防控决策的智囊团，要。