获奖重要科研成果简介-山东出入境检验检疫局

获奖重要科研成果简介
1. 出口禽肉产品关键技术研究与应用
主要完成人：梁成珠、高宏伟、朱来华、徐彪、鲍蕾、雷质文。

获奖情况：质检总局2005年“科技兴检奖”一等奖、2005年度山东省科技进步二等奖。

摘要：针对我国出口禽肉产品存在的问题和面临的困难，经过多年的研究探索，建立了禽肉产品生产、加工安全卫生质量保障体系，制定了兽药残留检测、微生物快速检测、禽肉中其他动物性成分的鉴定技术、热加工变性蛋白检测技术以及禽流感和新城疫快速检测技术等方法。

其中的“复合定量RT-PCR检测禽流感和新城疫病毒的研究”课题达到国际领先水平，获得国家发明专利，已成功应用到出口禽肉产品的检测中。

该项目的应用，可提高禽流感和新城疫病毒的检测效率5倍，降低检测成本2倍。

该研究体系经过在出口企业和检验检疫的实际应用，提高了禽肉产品的安全卫生质量，降低了生产成本，减少了出口禽肉产品的风险，取得了巨大的经济效益和社会效益。

在研究过程中，主编出版了《出口禽肉产品实用技术》专著，为企业和检验检疫系统培训了大量的技术人员，为出口禽肉产品质量提供了科学的保证，同时也为其他农产品的生产加工以及出口过程中的安全卫生质量保障，提供了技术指导。

2. 山东主要港口入境船舶压舱水浮游生物入侵种和病原菌研究
主要完成人：李伟才、贾俊涛、雷质文等。

获奖情况：国家质检总局2005年“科技兴检奖”二等奖。

摘要：研究了山东主要港口入境船舶压舱水中外来浮游生物的种类组成和致病微生物污染情况，调查研究了来自日本、韩国、泰国、印度、新加坡、印尼、马来西亚、冰岛、澳大利亚、智利等十几个国家和地区的74艘入境船舶，共取得了9000多个数据，掌握了三个港口海域的浮游生物群落组成，获取了74艘入境船舶压舱水中浮游生物群落和病原菌的基本数据，在压舱水中发现了4种外来浮游植物和6种可能对海洋生态环境产生高度危害的浮游植物以及多种致病微生物，探讨了入境船舶压舱水外来浮游生物物种和病原菌对本地海洋生态系统的潜在影响，为了解压舱水对本地海区浮游植物的影响和研究外来物种入侵提供了具有十分重要意义的科学数据。

在研究过程中，还设计研制出压舱水采样器，解决了压舱水采样技术难题，申请了国家专利，专利号：ZL200420039849.1。

3. 应用多重PCR检测和区分3种马疱疹病毒的研究
主要完成人：朱来华、梁成珠、岳志芹、高宏伟、吴华、王树峰、邓明俊。

获奖情况：国家质检总局2005年“科技兴检奖”三等奖。

摘要：在详细分析3种马疱疹病毒EHV-1、EHV-2和EHV-4糖蛋白B基因序列的基础上，设计、合成了3对高特异性引物进行PCR，不仅可以在数小时内分别检测这3种马疱疹病毒，而且多重PCR在同一反应系统内可以清晰地区分EHV-1、EHV-2和EHV-4，其PCR产物大小分别为226bp、333bp、507bp，符合预期的片段大小，序列分析证实与文献资料发表的序列一致，说明本方法特异性强。

这种检测方法的灵敏度可以达到103 TCID50，并从血清中和试验阳性但病毒分离阴性的进口马的可疑组织样品检测到EHV-1病毒特异性核酸的存在，说明PCR 敏感性强于病毒分离。

本研究表明，由于多重PCR在快速度、敏感性、特异性、
可靠性等方面的优点，在需要检测低水平的非感染性马疱疹病毒或潜在感染时，是一种非常实用的替代手段。

4.引起栉孔扇贝大规模死亡的纳米细菌样微生物病原研究
主要完成人：徐彪、梁成珠等。

获奖情况：国家质检总局2007年“科技兴检奖”二等奖。

摘要：用平板画线法从患病栉孔扇贝（Chlamys farreri）体内分离到了一种原核生物（称为纳米样微生物）。

纳米细菌样微生物可以在改进的液体培养基MEM（含2.2%NaCl，5%小牛血清）和脑心浸液（含2.2% NaCl）中生长；菌落在显微镜下（150×）为无色、透明的小点状；革兰氏染色阴性；菌体为圆形或近似圆形。

纳米细菌样微生物在发育过程中有两种状态，一种为未成熟阶段，直径小于100nm；另一种为成熟阶段，直径变化很大，最小约60nm，最大可达4µm 以上。

较小的个体有拟核、核糖体和新月状的空泡，未见细胞壁；较大的个体有细胞壁，胞内大部分被空泡充满，未见拟核和核糖体。

栉孔扇贝组织超簿切片电镜观察证实纳米样微生物的存在。

纳米样微生物的密度随着生长发育时间的不同而有所变化，繁殖高峰期密度较大。

建立了密度梯度离心结合滤膜过滤分离技术，优化人工培养条件。

最适生长温度为23℃，最适生长pH值为7.4，最适生长盐度相当于细胞培养液所需的盐浓度（0.85%NaCl）。

利用分子探针及流式细胞仪技术建立了定量分析法。

提取的纳米样微生物核酸能被RNase A 降解，且没有检测到DNA。

以PCR、RT-PCR扩增其16SrRNA基因序列片段，PCR反应没有扩增出扩增子，而RT-PCR则扩增出了16S rRNA基因序列片段，经测定其序列全长度为1430bp，经与GENEBANK中的16S rRNA片段比较分析，与6种不同科的微生物的同源率最高的为95%-95.47%。

采用温度梯度和病原浓度梯度回归感染实验方法，较为系统地研究了纳米样微生物的致病性。

研究结果表明：纳米样微生物对栉孔扇贝有强烈的致病作用，高温（23℃以上）是其致病的必要条件，证实纳米样微生物是栉孔扇贝大规模死亡的病原体之一。

5. 马鼻肺炎病原和抗体快速检测技术
主要完成人：朱来华、梁成珠、邓明俊、郑小龙、高宏伟、孙敏、岳志芹、肖西志、王树峰、吴华。

获奖情况：国家质检总局2007年“科技兴检奖”三等奖。

摘要：本课题建立完善了马鼻肺炎病原和抗体快速检测技术，包括三重PCR 试验、微量补体结合试验、微量中和试验。

在详细分析3种马疱疹病毒EHV-1、EHV-2和EHV-4糖蛋白B基因序列的基础上，设计、合成了3对高特异性引物进行PCR，应用同一反应系统不仅可以在数小时内分别快速检测和清晰地区分这3种马疱疹病毒。

这种检测方法的灵敏度可以达到103 TCID50，并从血清中和试验阳性但病毒分离阴性的进口马的可疑组织样品检测到EHV-1病毒特异性核酸的存在，说明PCR敏感性强于病毒分离。

本研究表明，由于多重PCR在快速度、敏感性、特异性、可靠性等方面的优点，在需要检测低水平的非感染性马疱疹病毒或潜在感染时，是一种非常实用的替代手段。

以马鼻肺炎种毒(马疱疹病毒1型，EHV-1 Rac H株) 标准种毒，在RK-13细胞上培养后获得了最高滴度的工作用病毒，制备了标准的EHV-1补体结合抗原，建立了特异、敏感、可靠的微量补体结合试验、微量血清中和试验；通过克隆EHV-1 Rac H株gD主要抗原区域于大肠杆菌表达，以原核表达产物为包被抗原，建立了灵敏、特异的ELISA方法。

对传统的全量补体结合试验100%溶血测定法进行改进和完善，国内首次建立了微量补体结合试验50%溶血测定法来检测马鼻肺炎抗体，比常量法或半量法以及
100%溶血测定法更先进、灵敏、简便、稳定、可靠，更易标准化。

与经典的微量血清中和试验相比，补体结合试验、ELISA与中和试验符合率分别为85.6%、94.8%，补体结合试验与中和试验相对敏感性和特异性分别为63.3%、91.5%，ELISA与中和试验相对敏感性和特异性分别为100%、93.4%。

线性回归数据显示，与中和试验相比，补体结合试验具有高度相关性（R2=0.7008, p<<0.0005, t-检验），ELISA具有更高的相关性（R2=0.7415, p<<0.0005, t-检验）。

迄今为止，接受检测我国部分地区流行病学调查、全国口岸检验检疫机构以及大陆境外（土库曼斯坦、香港、澳门）委托的出入境马、驴、斑马、羊驼等马属动物血清样品共8750份，马鼻肺炎检测情况为：补体结合抗体阳性1749份，中和抗体阳性1829份，ELISA抗体阳性2285份。

在我国新疆、内蒙古等部分地区流行病学调查、出口马属动物检验检疫过程中，证实我国马鼻肺炎血清学阳性率高达20%以上。

6. 食品加工环境、过程微生物学与卫生评定标准研究
主要完成人：姜英辉、雷质文、贾俊涛、赵丽青、刘云国、房保海、刘中学、赵可军。

获奖情况：山东检验检疫局2007年科技进步二等奖。

摘要：本课题建立了5个食品加工车间和表面样品取样和检测标准化方法，用于进出口食品工艺流程的全过程监控。

即课题采用食品加工车间微生物空气取样方法、接触平板和拭子表面取样方法、菌落总数3M PetrifilmTM测试片计数法、3M PetrifilmTM大肠杆菌和大肠菌群检验测试片法、3M PetrifilmTM单核细胞增生李斯特菌检验测试片法，以水产品加工、肉鸡加工和生猪加工过程为研究对象，进行微生物跟踪检验，对数据进行统计分析，提出加工工艺流程中的关键控制点，并提出相应的控制措施。

根据对典型加工工艺流程的研究，建立了典型食品加工过程中卫生控制及评定方法。

并对生猪加工中单增李斯特菌的控制措施的有效性、准确性进行检验。

7. 水生生物主要病原快速检测技术的建立与应用
主要完成人：岳志芹、梁成珠、徐彪、朱来华、雷质文。

获奖情况：2008年度山东省科技进步三等奖
摘要：随着水产养殖业的迅速发展和各国间水产品贸易的增加，水生动物病害迅速蔓延，已成为制约水产养殖业可持续发展的主要因素。

快速、准确地检测病原、诊断疾病，成为世界各国保护本国的水产养殖业，防止外来病害传入的有效手段。

本项目对出入境水生动物病原进行了收集，利用生物学信息学手段对基因序列进行解析，并建立了常见水生动物病原的常规PCR、定量PCR、多重PCR 及基因芯片高通量检测平台，将病原的定性检测发展为定量检测。

该项目在国际上首次建立了鲤春血症病毒（SVCV）、淋巴囊肿病毒（LCDV）、黄尾鰤腹水病毒（MABV）等病原的定量PCR检测方法。

该成果对于打破国外技术壁垒，保护我国水生生物的顺利出口，减少进口风险，保护国际贸易的正常发展，有着重要的经济效益和社会效益。

8. 鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗接种的ELISA方法
主要完成人：梁成珠、朱来华、岳志芹。

获奖情况：青岛市2008年度科技进步二等奖
摘要：该研究利用基因工程的方法表达H9N2亚型禽流感病毒的NS1蛋白，将AIV NS1 A、B基因定向插入到原核表达载体，经诱导获得高效表达。

利用纯化的融合表达蛋白作为诊断抗原，建立了特异敏感的区分野毒感染和灭活疫苗免
疫的AIV抗体的间接ELISA检测方法，为鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗免疫试剂盒的研制奠定基础。

该研究在国际上首次利用禽流感病毒的NS1等位基因群A、B两个代表基因的融合表达产物，鉴别诊断禽流感野毒感染与灭活疫苗免疫禽类，提高了检测准确度。

建立的检测方法特异性强，敏感性高，操作简便，可作为一种鉴别诊断标记，能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群，为禽流感的早期诊断、实时监控和净化提供了行之有效的方法。

该检测方法已经被欧盟认可使用，在养殖企业、基层兽医站、检验检疫等部门广泛应用，有效的保证了禽肉产品的安全卫生质量，保证了禽产品的顺利出口。

9. 动物重大疫病检测及防控技术研究
主要完成人：梁成珠、岳志芹、徐彪、凌宗帅、方绍庆、张太翔、鲍蕾、吕宁、雷质文、郑小龙。

获奖情况：国家质检总局2009年科技兴检二等奖。

摘要：目前畜禽传染性疾病的发生日趋复杂化、多样化，畜禽疫病的控制程度和控制水平成为制约我国畜禽及其产品进入国际市场的主要因素。

本项目利用新型的免疫学技术和分子生物学技术，建立了多种疫病的快速诊断方法。

具体包括：鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗接种的ELISA方法；利用焦磷酸测序技术区分禽流感病毒不同亚型以及区分新城疫病毒强毒株与弱毒株的方法；禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病等禽病的检测基因芯片；禽白血病、鸭副粘病毒荧光定量PCR快速诊断方法；建立了检测猪蓝耳病抗体的间接ELISA方法、猪流感病毒的实时荧光RT-PCR快速筛选方法及焦磷酸测序技术确证方法。

在动物重大疫病的防控方面，本课题从发生机理对主要畜禽养殖品种重大检疫性传染病进行深入系统的研究，阐明其发生、流行规律，可以有效的控制传染病的发生和流行。

本项目已在全国出入境检验检疫局和农业部门、畜禽养殖企业推广应用，被广泛应用于禽流感、新城疫及口蹄疫的防控等方面。

该成果对疫病发生和流行病学进行了研究，为畜禽重大疫病的防治奠定了基础，对保护我国畜禽养殖业和进出口贸易的发展具有重要的现实意义和长远的战略意义。

10. 重要动物疾病控制技术研究
主要完成人：梁成珠等。

获奖情况：2009年度山东省科技进步二等奖。

摘要：本研究开展了针对禽流感、新城疫、传染性法氏囊病、猪瘟及口蹄疫等病毒性传染病的快速检测技术研究，包括禽流感和新城疫病毒复合定量荧光RT-PCR快速检测试剂盒的研制，猪瘟和口蹄疫RT- PCR快速检测方法的建立；克隆、表达了鸡、猪、牛和羊的细胞因子白介素-18基因成熟蛋白，并对其生物活性及其对禽流感、新城疫、传染性法氏囊病和口蹄疫的免疫增强作用进行了研究；对禽流感、新城疫、法氏囊病和口蹄疫的免疫防治技术，以及发生情况进行了调查分析，建立了相应的流行病学信息技术平台和预警监测技术体系，进一步完善和优化了兽医专家诊断系统，为畜禽疫病防治工作提供了强劲的技术支撑。

对畜禽疫病发生的诱因进行了探索，研究开发了"节能减害"制剂及"中药复方调节剂"；提出了从改善和优化畜禽生产微生态环境入手预防和控制重大疫病发生的理论。

该项目对于畜禽安全生产，减少疫病的发生,提升畜禽重大疫病的预防和控制水平和能力，减少病害和环境污染具有重要意义。

11. 食品中主要致病微生物的新型基因检测方法
主要完成人：高宏伟，梁成珠，陈颖，鲍蕾，孙伟，徐彪，王树峰，朱来华，贾俊涛，雷质文
获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步奖一等奖
摘要：食源病原微生物是食品安全的重大隐患。

检验的手段以增菌培养和生物化学特性鉴定为主。

近年来又纷纷使用核酸扩增技术检验食品源病原微生物，其中主要是PCR技术。

2003年SARS时期后，一种新的核酸扩增技术——LAMP，开始广泛应用。

该方法只需要极少的试剂费用和一个水浴锅即可完成绝大多数PCR检测的过程，无论是实验室检验还是现场检验都可以准确快速灵敏的完成，是真正普及型的核酸检测方法。

这种先进的新型核酸检测方法已经日益在医学的临床检验和农业科学中应用，取得引人注目的效果。

所以本课题拟建立使用LAMP 技术检测常见致病微生物的方法，以推动该方法在检验检疫已有的核酸检测领域尽快应用。

另一方面，检测核酸扩增后产物的方法，都以光学方法为主，并且所用的DNA嵌合剂对人体和环境有危害。

在此背景下，DNA的传感器研究是国际上研究的热点之一。

本课题对两种DNA的电化学传感器进行应用基础研究。

本课题共发表SCI收录论文6篇（合计影响影子超过14.0），EI收录论文1篇，国内核心刊物6篇论文。

12 黄曲霉毒素的生物控制及其分析检测质量控制体系研究
主要完成人：鲍蕾、许艳丽、金莹、高宏伟、吕宁、姜宗亮、张艺兵、王洪兵、梁成珠、孙静克、石媛嫄、吴振兴、包振民、Mary W. Trucksess。

获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步一等奖。

摘要：黄曲霉毒素是是国际肿瘤研究机构（IARC）界定的IA类强致癌物质，广泛地污染粮食、谷类、油料、调味品等农作物。

由于生物控制和实验室检测是黄曲霉毒素污染控制体系的关键环节, 本研究以中国出口敏感农产品为研究对象，对黄曲霉毒素的生物控制及其检测质量控制标准体系进行了研究。

本项目通过紫外诱变筛选出生长力强的不产毒黄曲霉菌株A1025作为拮抗菌株，对黄曲霉毒素的产生具有有效的抑制作用，在花生等农作物的模拟实验中能够有效地抑制黄曲霉毒素的产生。

AOAC（美国官定分析化学家协会）协作研究是申请AOAC国际标准的关键步骤。

本协作研究由来自世界7个国家的13个实验室共同参加，研究者依照AOAC提供的检测方法和测试程序，对人参和生姜中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和棕曲霉毒素A的IAC/PCD/HPLC方法进行了验证，并对30个盲样，包括空白样品、黄曲霉毒素添加样品（0.25-16.0μg/kg）、棕曲霉毒素A添加样品（0.25-8.0μg/kg）以及含有毒素的天然污染样品进行了测定。

研究结果显示，该方法简便快速，准确可靠，灵敏度高，重现性好，能够满足人参和生姜中黄曲霉毒素和棕曲霉毒素A检测的需要。

协作研究已通过AOAC的审核，成为AOAC 国际标准（Official Method 2008.02）。

本项目在国内首次建立了满足欧盟法规EC401-2006要求的花生中黄曲霉毒素检测的方法验证、质量控制和不确定度评定研究，已在全国推广使用。

13.环介导等温扩增检测试剂盒和细菌鉴定系统研究及应用
主要完成人：雷质文、姜英辉、马维兴、房保海、许艳丽、李正义、刘云国、郑晶、蔡向荣、张健
获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步一等奖
摘要：本课题建立了婴幼儿食品的环介导等温扩增快速检测方法和鉴定系统，并用于婴幼儿食品的卫生学风险调查，为政府有关部门提供强有利的技术支撑。

（1）检测技术的研制和开发：计和开发了博检®革兰氏阴性菌鉴定和查询系统，并开发出鉴定试剂盒,解决鉴定成本高的问题；设计、建立并完善LAMP细菌和真菌检测技术;（2）婴幼儿食品中致病微生物的监测：运用LAMP检测技术和
细菌鉴定系统对婴幼儿食品中的致病细菌、真菌进行监测；对测婴幼儿食品中的黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、棒曲霉素、棕曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、金黄色葡萄球菌肠毒素、A型肉毒毒素进行检测；运用传统检测方法对婴幼儿食品中的致病微生物、霉菌进行检测和菌种的分离鉴定；对所分离致病菌耐药性进行测试；（3）婴幼儿食品中致病微生物的风险调查：系统调查我国婴幼儿食品（婴儿配方食品（婴儿配方粉、婴幼儿补充谷粉、较大婴儿和幼儿配方粉）、婴幼儿辅助食品主要有谷类粉状食品、罐装食品（中的病原微生物，根据以上调查结果，对我国我国婴幼儿食品的食用风险进行分析和评估。

14. 山东入境危险性杂草危害及检疫控制技术研究
主要完成人：原永兰、邵秀玲、刘瑞军、张成标、尼秀媚。

获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步一等奖。

摘要：本课题主要对山东口岸进口的美国、阿根廷、巴西、加拿大、澳大利亚、法国等国家的大豆、大麦和小麦携带检疫性杂草规律及口岸快速鉴定技术、发生危害与检疫控制技术措施进行研究。

（1）制定了杂草种类名录、发现山东新记录种。

建立进口粮中截获杂草种子标本库，制作标本达1600余个。

制定了进口粮截获杂草种类名录和检疫性杂草名录。

发现外来新记录杂草13种，包括中国新记录种4种、中国大陆新记录种1种，山东新记录种8种。

（2）实验室检疫鉴定技术研究。

对假高粱等16种主要检疫性杂草从口岸检疫应用的角度进行了研究、区分；拍摄了山东口岸截获的25种检疫性杂草种子照片及在山东发生13种检疫性杂草和潜在危险性杂草田间植株。

探索了鉴定燕麦、野燕麦等五种杂草种子SSR标记技术。

（3）进口粮中截获的检疫性杂草规律研究。

对山东口岸各国进口的大豆、大麦和小麦的数量种类进行了统计分析。

摸清了不同国家进口粮携带检疫性杂草的规律，不同年度之间的差别。

对进口粮携带的检疫性杂草籽的种类和数量进行了统计研究。

（4）重要检疫性和危害性杂草发生规律及综合控制技术研究。

对三裂叶豚草、假高粱、毒麦、菟丝子、黄顶菊、银胶菊和加拿大一枝黄花的分布进行了全省定点普查，进一步明确了其分布；对其中危害较大、分布较广的采取田间调查、人工模拟、小区试验等方法，研究了生物学特性、发生扩散规律、危害和影响、人工和化学等防治措施，组建了综合控制技术；对三裂叶豚草和新发现的黄顶菊、银胶菊制定了疫情监测与综合控制技术规程。

（5）进境粮携带的主要检疫性杂草风险管理措施与应用研究。

对山东口岸截获并发生的10种检疫性杂草，已截获无发生的14种检疫性杂草和无截获新发生的4种有害杂草进行了风险评估及管理措施与应用研究。

制定了进口粮加工企业考核标准和《进口粮谷检疫性杂草监督管理规范》。

（6）示范推广科研成果。

采用课题组研制的检疫性杂草检疫检测技术和进口粮谷运输储存加工监管规范，对进口粮口岸检疫、运输和监工进行检疫监管，同时进行田间检疫调查和防除。

15. 焦磷酸测序技术应用于禽流感病毒亚型鉴定及新城疫病毒毒力鉴定的研究
主要完成人：徐彪、孙涛、梁成珠、朱来华
获奖情况：山东检验检疫局2009年度科技进步一等奖
摘要：焦磷酸测序技术是一种全新的基于酶联反应的诊断技术，是目前唯一得到定量序列结果的通用型技术平台。

本项目利用焦磷酸测序技术在国际上首次研制了可同时区分禽流感H5、H7、H9血凝素亚型，N1、N2神经氨酸酶亚型的焦磷酸测序诊断方法，并应用该技术对表征AIV、NDV强毒株的氨基酸裂解位点片段进行测序分析，初步建立了针对两病强毒株的鉴定方法。

16. 新型变性高效液相色谱技术（DHPLC）快速检测植物病原的研究
主要完成人：吴兴海、陈长法、曹际娟、邵秀玲、张治宇、庞国兴。

获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步二等奖。

摘要：《中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录》规定豌豆细菌性疫病菌（Pseudomonas syringae pv. pisi）、番茄细菌性溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）、木薯细菌性萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis）、玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp. Stewartii）五种植物病原细菌和香石竹环斑病毒（Carnation ringspot Dianthovirus）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt Tospovirus）、草莓潜隐环斑病毒（Strawberry latent ringspot Nepovirus）等三种植物病毒为检疫性有害生物，是进出口植物源性产品必须实施检疫的项目。

课题对八种植物病原展开超前性、针对性、实用性极强的攻关，研究新技术、开发新方法，以图跨越技术障碍，打破贸易壁垒，防止外来有害生物传入，保障外向型经济保持可持续发展的繁荣态势。

课题组成员对八种检疫性植物病原的基因排列、结构特点进行全面的信息收集，寻找、筛查同一病原不同株系的严格保守区间，对其中目的片段序列进行比对分析，从中找出满足变性高效液相色谱（DHPLC）技术的特异性片段、特异性突变位点，分别利用计算机软件设计其专化性简并引物序列。

将感病及健康组织、对照病原体核酸模板以优化反应体系进行PCR和RT-PCR扩增反应及DHPLC检测实验，验证其特异性，同时建立定量分析体系，确证其最终限值及灵敏度。

结果表明，八种病原的DHPLC检测体系具有鉴定特异性，显著地提高了灵敏度，DHPLC方法是特异、敏感、快速的检测方法。

课题成功建立了八种植物病原的新型变性高效液相色谱（DHPLC）快速检测技术体系，研制了十一套植物病原DHPLC与荧光定量PCR快速检测试剂盒，填补了国内外相关领域的空白。

17.免疫荧光及实时荧光PCR技术在鉴定多种检疫性粮食、花卉病原细菌工作中
的应用
主要完成人：邵秀玲、陈长法、厉艳、吴兴海、甘琴华、尼秀媚。

获奖情况：山东检验检疫局2009年科技进步二等奖。

摘要：本研究主要针对风信子黄腐病菌（Xanthomonas hyacinthi）、香石竹细菌性萎蔫病菌（Burkholderia caryophylli (Burkholder 1942) Yabuuchi）、郁金香黄色庖斑病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii）、番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）、豌豆细菌性疫病菌（Pseudomonas syringae pv. pisi）等5种重要的检疫性植物病原细菌检疫鉴定方法进行深入研究：（1）首先用Biolog微生物鉴定仪及16s ITS序列比对方法对5种病原细菌进行鉴定确认；研究5种病原细菌的最适培养条件，并描述其菌落特征和生理生化特性；研究了5种病原细菌的致病性接种条件，对不同时期不同部位的发病情况进行图片记载，通过扫描电镜和透射电镜技术观察细菌个体，其中透射电镜观察番茄溃疡病菌，该菌细胞两端极生鞭毛，与报道的一端极生鞭毛不同，为创新性发现。

（2）利用5种植物病原菌菌体免疫新西兰大耳兔，实验证明间接免疫荧光染色方法与其它属的细菌无交叉反应，具有耗时短，检测灵敏度高的特点。

（3）利用5种植物病原细菌16S rDNA设计引物和TaqMan 荧光探针，实时荧光结果显示阳性菌株均获得很强的荧光信号，具有重复性好，灵敏度高的特点。

本研究共拍摄了上千张不同发病状态下植物病原细菌的图片，为5种病原细菌的实验室检测奠定了基础；制备了多份高效价的植物病原细菌抗血清，可以用于间接免疫荧光检测；设计引物和TaqMan荧光探针，不需进行病。