组织工程血管支架研究进展

第27卷第1期2006年1月武汉大学学报(医学版)
Medical Journal of Wuhan University Vol.27No.1J an ,2006
课题来源:国家自然科学基金(30471670)
作者简介:刘阳,男,19782,医学硕士生,主要从事组织工程血管方面的研究通讯作者:谭最,男,19612,医学博士,主任医师,主要从事血管外科方面的研究
组织工程血管支架研究进展
刘　阳　谭　最
武汉大学中南医院血管外科　武汉　430071
摘要　组织工程血管支架是血管组织工程学中的一个重要组成部分。

过去20多年时间里,组织工程血管支架材料由简单的天然材料发展到高分子可降解材料和生物材料的复合物;设计和加工的方式由单纯的手工发展到潜力巨大的快速成型技术,取得了令人瞩目的成绩。

目前组织工程血管支架材料的性能还有待完善,设计加工方法还不够成熟,该领域今后的发展方向为支架材料的复合化和支架设计加工的产业化。

关键词　组织工程;血管支架;可降解材料;快速成型
中图分类号　R318.11　文献标识码　A 文章编号　167128852(2006)0120124206
Study of Scaffold on Tissue E ngineered Blood V essel
L IU Yang ,TAN Zui
De pt.of V ascul ar S ur gery ,Zhongnan Hos pit al of W uhan U ni versit y ,W uhan 430071,Chi na
Abstract
The blood vessel scaffold is one of t he important part s of tissue engineered blood vessel.In t he past twenty years ,t he simple crude materials used in tissue engineered blood vessel had been substit uded by t he compounds of macro molecule synt hetic biodegradable polymers and biomateri 2als ;man 2made skill of t he design and manufact ure scaffolds had been substit uded by t he more po 2tential technique of rapid p rototyping (RP ).The performance of tissue engineered blood vessel scaffold is not satisfied and t he technique of t he design and manufact ure scaffolds is not perfect by now.The compo sition of t he materials and t he indust rialization of t he design and manufact ure is t he destination of developing tissue engineered blood vessel in t he f ut ure.
K ey Words Tissue Engineering ;Blood Vessel Scaffold ;Degradable Polymers ;Rapid Proto 2typing
1　介绍
组织工程学是20世纪80年代提出的一门新兴
交叉学科。

组织工程的先驱性工作可以追溯到Yannas 等的开创性研究,他们尝试用胶原和糖胺聚糖构建人工皮肤类似物。

最先用“组织工程”这一名词的学者是Wolter 和他的同事们,他们在眼科植入物研究中观察到聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA )表面形成了内皮样结构物。

1993年Vacanti J P 等[1]在
Science 上发表了一篇名为Tissue engineering 的文
章,首次定义了组织工程学,即一门运用工程学和生命科学的原理和方法,研究正常的和病理的哺乳类组织的结构和功能的相互作用,开发研究能修复损伤组织和器官形态和功能的生物替代品的科学。

组织工程学的原理是从机体获得少量的自体组织,将种子细胞从中分离出来并在体外进行扩增,然后将扩增的细胞粘附到支架上,形成细胞2材料复合物。

　第1期刘　阳,等.组织工程血管支架研究进展
将该复合物植入机体的组织或器官病损部位,随着生物材料在体内的降解和吸收,植入的细胞在体内不断增长和分泌外基质而最终形成相应的组织,达到修复创伤和重建功能的目的。

随着组织工程学技术的不断进步,能培育出各种各样的组织和器官替代品,包括皮肤、软骨、骨、肝脏、神经和血管等[2]。

而组织和器官的再生很大程度上取决于支架,一个理想的支架应具有以下的性质:①可控制的生物可降解性,与组织生长所匹配的降解速度;②良好的生物相容性;③良好的细胞亲和性,合适的表面化学以适合细胞附着,增殖和分化;④合适的多孔结构,三维多孔且内部贯通的网络结构以适应细胞的生长、养分的输送和代谢产物的排放[3];⑤良好的力学性能为细胞提供适宜的微应力环境;⑥易加工性,目前快速成型技术(Rapid p rototyping,RP)有广阔的应用前景[4];⑦可消毒性,性质稳定便于消毒以植入人体。

组织工程血管是一种用组织工程学的方法构建的具有良好的生物相容性和力学特性的血管替代物[5]。

基本构件是血管支架材料(非降解合成材料、可降解合成材料、天然降解材料等)和种子细胞(VSMC、EC、Fibroblast),也有不用支架材料,直接用3种细胞合成血管的。

组织工程血管应具备如下条件[6]:①具有或模拟体内血管壁3层结构,即:外膜、中膜和内膜;②具有生物相容性,不易产生血栓,不易发生免疫排斥反应;③具有生物学特性,如对药物刺激有舒缩反应;④具有血管的力学特性。

即有粘弹性并能承受一定的压力。

本文的主要目的是综述组织工程血管支架的材料以及设计和加工技术,最后总结并对组织工程学血管支架这一领域提出展望。

2　组织工程血管支架的材料
2.1　高分子可降解材料　聚羟基乙酸(Polyglycolic acid,P GA),聚乳酸(polylactic acid,PL A)和聚羟丁酸(poly242hydroxybutyrate,P242HB)是目前最常采用的构建组织工程血管的支架材料。

这类材料有很多优点,诸如可降解、可塑性强、抗原性低组织相容性好等,经材料处理工艺可加工成管状支架结构。

移植入体内后经一段时间可逐渐降解,而由体内新生组织替代。

1998年,Shinoka等[7]首先报道以聚羟基乙酸(P GA)制成管状支架。

从羊颈总动脉或颈外静脉取EC、SMC、Fibro blast,体外培养2周后种植于支架上,继续孵育7d后,细胞在支架融成片状,即移植于羊的肺动脉,11周后支架完全消失,管壁内胶原蛋白含量相当于自体肺动脉的7
3.13%±8.0%。

是一种具有生长、修复功能的活血管。

但由于支架材料本身的局限性使该组织工程血管存在以下缺点:①P GA的机械支撑力较弱,用于肺循环尚可,却难以耐受较高的体循环压力而形成动脉瘤;
②P GA过于僵硬,手术缝合性不佳。

1999年, Shum Tim等[8]用羟化烷烃的聚合物(Poly hydroxyalkanoate,P HA)的双层管状支架构建了组织工程血管。

内层以有孔的P GA网作为细胞载体,外层以无孔的P HA加强机械支撑作用,支架厚1.5mm。

P GA降解时间628周,P HA为52周。

未接种细胞的对照组管腔全部堵塞,而种植细胞者观察,该组织工程血管的血管壁中胶原蛋白到3个月时占相应自体腹主动脉的25.7%±3.4%,5个月时达99.6%±11.7%,内层有平整的内皮细胞,中层有大量的弹力纤维生成。

1999年,Niklason等[9]以P GA为支架制备了小口径(<6mm)组织工程血管。

在静态下将牛的SMCs悬液注入管形支架中贴壁,8周后在P GA降解同时,SMCs迁入支架并产生ECM替代P GA。

再接种ECs,8周后制成组织工程血管。

比较以往的方法他们作了两方面的改进:①采用了搏动性灌注培养系统(Pulsatile perf u2 sion system);②在培养液中加入了抗坏血酸、铜离子及一些必需氨基酸等以促进胶原蛋白的生成及铰链,增强管壁的机械强度,在此种物理环境和优化培养液中培养出来的血管优点为:①力学性能优于以往任何一种组织工程血管:抗张裂强度>2000mm Hg[人自体大隐静脉能耐受的压力为(1680±307)mm Hg],缝合固持度达90g,胶原含量超过50%;②细胞具有良好的分化状态,对药物作用有反应;③有较好的通畅率,用来替代猪大隐静脉后,4周后均保持通畅。

这一模式首创了动态培养,革新了体外培养条件,但所用设施复杂,一般实验室难以配置。

2000年,Ye Q等[10]用人血管脱细胞基质,多聚赖氨酸和人血清处理P GA表面,观察细胞贴附率,结果分别为48%,53%,24%,表明前两者能明显促进细胞粘附。

2001年,Hoer2 st rup SP等[11]采用了一种新型可吸收的P GA2 P4HB复合材料,即在P GA的有孔支架上修饰一层P4HB,P4HB具有一定的强度、弹性和热塑性。

通过热焊接技术,制成管形支架。

采用相似的动态培养,该组织工程血管也达到了一定的抗张裂强度和缝合固持度,基本符合外科手术的要求。

2002年,
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刘阳等[12]将犬平滑肌细胞接种于片状P GA上,形成细胞2材料复合物。

2003年,Opitz F等[13]采用长50mm,直径15mm,管壁厚2mm的筒型P4HB支架构建羊主动脉,肉眼观P4HB支架为有弹性粗糙多孔筒型支架,SEM(扫描电镜)观察P4HB支架为内部高度贯通的多孔结构,用β射线灭菌后仍然能保持宏观和微观的结构。

P4HB十分适合作为动脉血管支架,唯一的缺点是细胞亲和性不好。

总的来看,P4HB 除了在力学性能和热学性能上与PG A有明显的差距外,在降解过程上也存在的不同的机制。

P4HB的优势在于:①在人体降解过程中机械强度降低的速度慢,能够提供有效的力学支撑;②良好的生物相容性,降解过程中不产生强酸性产物;③在潮湿的环境下相对稳定,保存时间长;④在水解作用下保持良好的稳定性,有利于用于生物反应器(bioreactor)需要长时间培养的支架[14]。

以上各种聚合物的主要性状见表1[15],PGA和P4HB比较见表2。

表1　4种高分子可降解材料的主要性状
T able1　Comparison of properties of the four degrad able thermoplastic polyesters
Polyesters T m(℃)T g(℃)Tensile strengt h(MPa)Tensile modulus(MPa)Elongation at break(%)Absorption rate P GA22535706300 1.56weeks
PLLA175652825061922380 1.6228 1.525years
DL2PL A Amorphous502532923519002240063mont hs
P4HB60-51507010008252weeks
表2　PG A和P4HB性质的比较
T able2　Comparison of general properties betw een P4HB and PG A
Properties P GA P4HB
Thermal properties High melting temperature Low melting temperature
Tensile strengt h Very strong St rong
Tensile modulus Stiff Flexible
Ability to elongate Virtually none High
Absorption rate Very fast Moderate
Loss of strengt h in vivo Rapid Gradual loss
Degradation product s Highly acidic Less acidic
Inflammatory reaction Can be severe for large implant s Well tolerated
Thermoplastic melt processing Yes Yes
Solvent processing Virtually insoluble Soluble in some solvent s
Resistance to moisture Poor Fairly good
2.2　天然生物材料　天然生物材料来源生物机体,与细胞亲和力强,能为细胞生长、繁殖、分化提供近似体内组织发育的ECM支架条件,其生物相容性、顺应性以及免疫排斥性低等特点都优于合成材料。

天然生物材料分为大分子结构材料,如胶原、藻酸盐等;脱细胞组织基质材料,如脱细胞真皮基质、脱细胞血管基质、脱细胞膀胱基质等。

胶原是机体最丰富且普遍存在的结构蛋白,含有细胞粘附域序列(arginine glycine aspartic acid,R GD)和细胞特定识别信号。

1986年,Weinberg等[16]首先用动物胶原蛋白制备ECM,同时培养牛的EC、SMC、和FB,先将培养基、胶原和SMC混合铸成管状容器,形成胶原管状网格支架(相当于中膜),在支架外套上绦纶网,然后接种FB构成血管外膜,再向管内注入EC悬液旋转培养。

但是这样形成的血管,管壁弹性蛋白含量少,SMC和胶原排列杂乱,SMC和胶原密度仅为天然血管的1/421/8,所以管壁抗压性差。

目前多采用脱细胞血管基质,制备方法是低渗溶液处理、Triton X2100、RNase、DNase四步消化法。

经组织学和免疫生化分析表明,去垢剂2酶消化法所制成的ECM中无细胞成分;脱细胞的支架结构完整,力学性能和强度与脱细胞前相近;大隐静脉EC种植3d后,在支架表面形成单层融合的EC 层。

1990年,Wilson等[17]用犬颈动脉脱细胞血管基质为支架,作异体冠状动脉旁路移植,术后不使用抗凝药物,观察4年通畅率达93%,无血栓和动脉瘤发生,在生理血压范围内,柔顺性与正常动脉相同。

2002年,Harding SL[18]等用纯天然人体蛋白做组织工程学血管支架,作冠状动脉旁路移植,支架为human fibronectin(65%)和fibrinogen(35%)的混合物,其弹性、抗压强度、抗拉强度均比较令人满意,生物相容性明显好于一般人工合成材料。

国内的报道有2002年,刘咸罗等[19]将犬颈动脉脱细胞处理后,获得外观和结构均良好的血管基质,并用作异体移植实验。

韩子峰等[20]对猪胸主动脉作Tritonx2100单一处理,获得管腔塌陷的血管基质,
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可能是弹性膜受到破坏的结果。

2004年,熊猛[21]采用EDC交联胶原和粘多糖材料;采用戊二醛和热交联法得到明胶加壳聚糖材料;应用去垢剂、渗透压改变和核酸酶消化的方法,对猪主动脉进行去细胞处理,得到完整的去细胞纤维支架。

结论为明胶加壳聚糖三维结构好,主动脉脱细胞后基质仍显致密,采用模具直接成型、冷冻干燥技术相结合,可以得到多种管状的可降解基质支架。

2.3　可降解材料和生物材料的组合　可降解高分子材料和生物材料作为构建组织工程血管各有其特点,但都存在一定的不足。

将两者按照一定的方法组合可构建成一种复合基质,可以发挥两者的各自优势。

高分子材料可以提供一个稳定的力学环境且易成型,而生物材料中一些氨基酸残基序列如精氨酸甘氨酸天冬氨酸(R GD)、精氨酸谷氨酰氨天冬氨酸缬氨酸(REDV)等,可以被细胞膜的整合素受体识别,参与细胞分裂,加快细胞的分化,因此可以增加细胞亲和性。

1994年Hill West等人[22]就已经证实,聚氧化乙烯(PEO)具有抗凝功能,表现出较好的抗血小板粘附的能力。

经光聚合作用的含有细胞粘附多肽聚乙二醇(Polyet hylene glylene,PEG)水凝胶也可用作为支架材料,尽管PEG本身抗细胞粘附,但可以通过化学处理,使添加的粘附多肽和细胞表面的受体相结合,增加细胞的粘附,进而促进细胞增殖。

因此有选择地使用高分子材料及其添加成分可以影响细胞分裂增殖和分化。

将生长因子整合到支架中,可以促进细胞生长,在支架材料吸收以前,使细胞扩增到足够数量的新生ECM予以代替能避免形成动脉瘤。

2001年Mann B K等[23]将转化生长因子(T GF)连接到聚乙二醇(PEG)支架中,明显增加平滑肌细胞分泌基质。

将抗凝材料作为基质整合到可吸收高分子材料,可解决因移植血管血栓形成而失去功能的问题。

在国内,2002年潘勇等[24]将P GA和胶原纤维相混合,构建组织工程血管支架材料,有利于内皮细胞在其内腔面贴附生长,形成较完整的血管内膜层。

2003年,潘勇等[25]将P GA纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合,构建组织工程血管支架,证明胶原包埋处理的P GA纤维无纺网是良好的携带血管平滑肌细胞的多孔生物降解材料。

在纤维连接蛋白和其它细胞外基质糖蛋白粘附功能域(诸如R GD)被发现后,通过合成材料的修饰,可加强对细胞增殖、分化和分裂的调控。

上述过程还需要细胞的植入、营养的供应、内分泌的调节和其他生理活动的支持。

细胞如何与ECM粘附分子相结合,以及信息如何传递,还是需进一步深入研究的课题。

增加细胞和ECM的粘附可促进细胞的生长,如果粘附配基(如R GD)过少,细胞得不到足够的刺激,将影响其迁移、粘附、贴壁,但过量的粘附配基亦可能影响细胞迁移。

3　组织工程血管支架的设计和加工技术
由天然生物材料和合成高分子可降解材料如胶原、壳聚糖、明胶、海藻酸钠、P GA、PL A、PL GA和P242HB等制备的三维多孔支架广泛应用于软骨、骨、皮肤、血管等组织工程。

人们尝试用超临界流体技术、无纺布构造法、相分离法、乳液冷冻干燥法、颗粒滤沥法以及快速成型等多种技术,为了给种子细胞提供足够的营养供给,支架的结构需要考虑很多因素,包括孔率、孔径、孔的互通性、浸透性、管道扭曲度等[26]。

从支架的设计和支架功能方面考虑,每一种加工技术都有其优点和缺点。

对于血管组织工程学来说,由于血管形状变异较大,对支架的形状构造的要求不如骨、软骨支架那么严格,因此,血管支架的设计和加工比较简单,偏向手工化,甚至Heu2 reux L′等[27]报道不依赖支架,直接用SMC和皮肤成纤维细胞培养获得组织工程血管。

然而,产业化生产和进入临床应用是组织工程研究的最终目的,随着对带瓣膜的大静脉、冠状动脉、心脏瓣膜等具有复杂结构的组织工程血管支架研究的增加,设计和加工技术的提高就显得十分重要。

快速成型(rapid p rototyping)作为先进的快速复制成型技术已经在医学领域显示出其巨大应用前景,特别是对推动组织工程支架的产业化生产和组织工程技术应用于临床起着关键的作用。

下面就简略的介绍一下快速成型技术。

快速成型技术(Rapid p rototyping,RP)最早出现于1986年并首先应用于航天工业,1992年,考虑到利用RP技术可制备微观结构可调的物件,Cima 等首次尝试将快速成型技术应用于具有药物释放功能的聚丙交酯支架的制备,开创了利用RP技术制备组织工程支架的先河。

RP技术分为如下7种[28]:液态光敏树脂选择性固化(Stereolit hogra2 p hy,SLA);选择性激光烧结(Selective laser sinte2 ring,SL S);熔融沉积成型(Fused deposition mod2 eling,FDM);分层实体制造(Laminated object manufact uring,LOM);多喷头固化(Multip hase jet solidification MJ S);3D打印技术(Three2dimen2
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sional printing ,32DP )[29];3D 绘图(3D plotting )[30]
等。

其中以SL A 及FDM [31]两种技术在医学领域
的应用最普遍。

快速成型技术用于医学领域最早始于20世纪90年代初[32],很大程度上是借助了CT (Comp uted tomograp hy )及核磁共振(Magnetic resonance ,MR )等高分辨率检测技术的发展。

其基本步骤是通过计算机专用软件对C T 或MR 逐层扫描所获得的图像数据信息逐层进行转换,而转换得到的数控加工命令,可控制相应的机床依次逐层加工制作三维模型(见图1)。

早期的图像信息采集是将CT 扫描的图像胶片置于透射式扫描仪中读取后,传输至个人计算机进行数据处理转换,因此,加工精度很大程度上取决于所提供的C T 胶片的精度。

随着可下载原始数据的螺旋CT (Spiral C T ),DICOM 格式以及三维重建方法[33]的问世,已有的CT 图像数据可直接输入计算机,并按一定数学方法在各层之间进行差值细化,三维产品的加工精度也随之大大提高。

如2002年,苏亚辉等[34]根据快速成型和医学影像技术的发展与现状,提出了从医疗设备直接提取数字化信息,利用CAD 软件及二次开发工具进行三维重建直至原型输出的新思路。

Sodian R [35]等用RP 技术制作了组织工程心瓣膜支架。

国内也有许多关于用RP 技术制作软骨、骨[36]组织工程支架的报道,但是用于制作组织工程血管支架的报道鲜见。

图1　快速成型技术制备组织工程支架的流程
Fig.1　Process of rapid protoping
4　组织工程血管支架有待深入研究的课题
组织工程血管支架虽然已崭露头角,但是目前除了2001年Shino ka T 等[37]报道将体外制备的组织工程血管应用在临床获得成功外还都基本停留在
基础试验阶段。

为了加快其进入临床和产业化的进程,未来的研究方向如下。

4.1　支架材料的研究　高分子可降解材料的应用虽然得到广泛的认可,但是目前采用的材料价格极为昂贵,合成技术要求高,难以大规模应用。

而且由于材料本身的性质影响,其对种子细胞的亲和性不足,构建的组织工程血管顺应性尚不理想,对血液动力学方面可能会有较大影响。

因而,在寻找更为理想的材料的同时,应该考虑加强对高分子复合材料(如PG A 和P4HB 的组合)的研究,以及可吸收材料和生物材料的复合研究。

4.2　支架设计和加工技术的研究　组织工程血管大规模用于临床,必须找到一种快速,精确,廉价设计加工支架的方法。

目前快速成型技术的成熟无疑给我们带来了希望。

目前C T 、MRI 精度的限制,对小血管和瓣膜的三维重建比较困难;针对组织工程血管的RP 机床制造成本高;跨学科合作难以协调。

因此,应该在加强多学科联合的基础上,重点展开C T 、MRI 到计算机过程中提高设计精度的研究,设计专门用于加工组织工程血管的RP 机床的研究,以及被加工材料和RP 机床兼容问题的研究。

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(2005205230收稿)
编辑　沈建国
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