液相色谱质谱LCMS联用的原理及应用

进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器
┗━━━━━╋━━━━━━┛
真空系统
真空系统
质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在 高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免 发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属 于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液 质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子 离子，从而得到分子量。
ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离 方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋 白质分子多肽等)
APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压 化学电离—同上，更适宜做弱极性小分子。
APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气 压光喷雾电离—同上，更适宜做非极性分子。
碎片离子：
准分子离子经过一级或多级裂解生成的产 物离子.
碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关, 数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎 片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容 易断裂生成该离子。
OH H N C3H
C3H
Ephedrine, MW = 165
多电荷离子：
指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等
丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化 合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用 稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合 物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌 上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物 结构,反应历程等
如何看质谱图：
(1)确定分子离子,即确定分子量
氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是 偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇 数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质 量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则 说明是碎片或杂质。
离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些
不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会
形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采用
电喷雾的离子化技术, 可产生带很多电荷
+TOF MS: 1.84 min (57 scans) f rom go 10
1.26e1
Int act Ant ibody Spect r um
液相色谱质谱LCMS联用的原理 及应用
简介
色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱 的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准 确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前 处理过程，使样品分析更简便。
色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS) 和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气 质联用互为补充，分析不同性质的化合物。
电喷雾（ESI）的特点
通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷 离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测 定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱 仪可测定质量数十几万的生物大分子。
电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离 子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定 的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析 蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压 控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。
由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵 (高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器 部分的真空。
只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到 达接收器，真空度不够则灵敏度低。
进样系统
把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进 样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样 等。
离子源
使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离 子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器 ，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的 有如下几种，其中EI，ESI最常用。
峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度. 基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的
离子峰称作基峰. 总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子
；多电荷离子；同位素离子
总离子流图:
在选定的质量范围内，所有离子强度的 总和对时间或扫描次数所作的图,也称 TIC图.
(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片
化学式
高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的 元素组成从而推出分子式
低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:
(3)峰强度与结构的关系
丰度大反映离子结构稳定 在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子
外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力 越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本 一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。
(3) 尽可能判断出分子离子。
(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子 所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1 ，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H ，CH3，H2O，HF，OCH3......
(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照 ，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对 比。
随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂， 分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法 （ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（ MALDI-MS）应运而生。
目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和 CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气 压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压 光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采 用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者
多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子
有机质谱的特点
优点:
(1)定分子量准确，其它技术无法比。 (2)灵敏度高，常规10-7—10-8g,单离子检测可
达10-12g。 (3)快速，几分甚至几秒。 (4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难
分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。 (5)多功能，广泛适用于各类化合物。
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1.0
2.0
3.0
4.0
质量色谱图
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
总离子流图
准分子离子:
[M+H]+ 或[M-H]- . 在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子
如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离 子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等
147096.00
147575.00
50
147224.00
147532.00
146892.00
147729.00
146500
147000
147500
148000
Mass, amu
148500
149000
同位素离子
由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子. 各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的
Ionic
IonSpray
APCI
Analyte Polarity
GC/MS
Neutral
101
102
103
104
105
Molecular Weight
现代有机和生物质谱进展
在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。 在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以 下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解 吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达 1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。 20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS ），能够分析分子量达数千的多肽。
大气压化学电离（APCI）特点
大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电 荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性 的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低 水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控 制离子的碎裂。
电喷雾与大气压化学电离的比较
电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是 高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]离子。
质量色谱图
指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所 作的图.
利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合 物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的 方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看 不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入 M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱 图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上 都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进 行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。
样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷 雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1 ml／min.
断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定 的化合物就足以使其分解.
灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小 分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而 APCI更适合于分析极性较小的化合物。
液质联用与气质联用的区别:
气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器 ，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化 的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图 ，可与标准谱库对比。
液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问 题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的 分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分 子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的 分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只 能自己建库或自己解析谱图。
质谱原理简介：
质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比 分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分 析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离 子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所 作的条状图就是我们常见的质谱图。
常见术语:
质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电 荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.
MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光 解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋 白质，多肽等大分子．
其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)
实验室现有的离子源:
ESI电喷雾电离源 APCI大气压化学电离源
EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。
CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。
FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。
FAB(Fast Atom ห้องสมุดไป่ตู้ombardment):快原子轰击—或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。
常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDITOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛
细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括
药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、 组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的
特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快 ，操作简单。
的离子,最后经计
5
算机自动换算成单 质/荷比离子。
2500
3000
3500
4000
m/z, amu
BioSpec Reconstruct f or +TOF MS: 1.84 min (57 scans) f rom go, smoothed
1.15e2
147255.00
100
147415.00 Reconst r uct of Int act Ant ibody
不同类型有机物有不同的裂解方式 相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量
数的差异
需要经验记忆。
质谱解析的一般步骤
(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱 图得到元素组成更好)
(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失 真,考虑操作条件是否适当
(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解 性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等 .
局限性:
(1)异构体，立体化学方面区分能力差。 (2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所
以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专 人操作。 (3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题 。 (4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。
质谱仪器：
质谱仪由以下几部分组成
数据及供电系统
┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓