《工业微生物》课件 第四章

第一节 微生物生长的测定
3. ATP的含量测定法 ATP是细胞中储存能量的化学形式，它在各种微生物 细胞中含量也较为稳定，一般是在10-6mol/L数量级。细菌 细胞的 ATP 含量为每克细胞干重含有 1mg ATP 。 ATP 只存在 于活细胞中，因细胞死亡后ATP会分解，因此ATP可以快速、 灵敏地反映出活菌数量。

第一节 微生物生长的测定
（五）平板菌落计数 平板菌落计数法可以反映出样品中活菌的数量，又叫活 菌计数法。将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，把最 后三个稀释浓度的稀释液各取一定的量接种到琼脂平板培养 基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，据 此计算出供测样品中的活细胞数。也可以将经过灭菌后冷却 至45~50℃的固体培养基与一定稀释度和体积的菌悬液在培 养皿中混匀再倒入培养皿，凝固后培养适当时间，测定菌落 形成单位的数目，以此推算出待测样品中的活细胞数。此法 要求菌体成分散状态，否则无法确定单个菌落是否由单个细 胞形成。因此比较适合于细菌和酵母菌等单细胞微生物计数， 不适合于霉菌等多细胞微生物计数。
第一节 微生物生长的测定
（四）菌丝长度测定法 这是针对丝状真菌生长而确定的测定方法，一般在固 定培养基上进行。最直接的方法就是将真菌接种到平皿的 中央，定时测定菌落的直径或面积。对生长快的真菌，每 间隔 24h 测一次，对生长慢的真菌可以数天测定一次，直 到菌落覆盖了整个平皿，据此可以测出菌丝的生长速度。 不过这种方法不能反映菌丝的纵向生长，即菌落的厚度和 深入培养基的菌丝。另外，接种量也会影响测定结果。

第二节 微生物的生长规律
一、微生物个体细胞的生长 工业上常接触到的细菌、酵母、霉菌的生长模式如图 4-2～图4-4所示。

第二节 微生物的生长规律

第二节 微生物的生长规律
（一）细菌细胞的生长 由图 4-2 中可看出， 就大多数原核生物而言，其单个细胞 持续生长直至分裂成两个新的细胞，这个过程称为二等分裂。 杆状细菌如大肠杆菌在培养过程中，能观察到细胞延长至大约 为细胞最小长度的2倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁 从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至2个子细 胞被分割开，最终分裂形成2个子细胞。细菌完成一个完整生长 周期所需的时间随种的不同而变化很大。这种变化除了主要由 遗传特性决定外，还受诸多因子的影响，包括营养和环境条件 等。在适宜的营养条件下，大肠杆菌完成一个周期仅需大约 20min，一些细菌甚至比这更快，但更多的比其要慢。

第二节 微生物的生长规律

第一节 微生物生长的测定
（三）称重法 这是一种常用的方法，直接称量样品的干重或湿重。 一般细菌干重约为湿重的 20 ％～25 ％。此法直接而又可 靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含杂质，对单 细胞及多细胞均适用，尤其是测定菌长的测定
（四）从发酵液的粘度来估算 随着菌体量的增加以及粘性的发酵产物的形成，发酵罐的 粘度会显著地增大。发酵工厂常采用简单的粘度测定作为发酵 生产量的监测指标之一。当然，发酵菌体的裂解或者染菌等不 正常情况也会造成发酵粘度的增大或降低，从而产生估算的误 差。 （五）从发酵罐的酸碱度来估算 在某些特定的情况下，培养基的 pH 的变化能较好地反映底 物的消耗量和微生物的生长。例如氨的利用结果是释放出 H+， 导致pH下降；类似地，硝酸盐作为氮源，氢离子被从培养基中 移去，导致pH上升。

第二节 微生物的生长规律
2.指数生长期 又称对数生长期。细菌经过延滞期进入指数生长期， 并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈指数增加， 而且细菌内各成分按比例有规律地增加，此时期内的细菌 生长是平衡生长。指数生长期的特点：a.生长速率常数最 大，细胞每分裂一次所需的代时 ( G ) 或原生质增加一倍 所需的倍增时间较短；b.菌体的大小、形态、生理特征比 较一致；c.酶系活跃，代谢旺盛；d.活菌数和总菌数接近。

第二节 微生物的生长规律
延滞期所维持时间的长短，因微生物种或菌株和培养 条件的不同而异，实践表明延滞期可从几分钟到几小时、 几天，甚至几个月不等；如大肠杆菌的延滞期就比分枝杆 菌短得多。同一菌种或菌株，接种用的纯培养物所处的生 长发育时期不同，延滞期的长短也不一样。如接种用的菌 种都处于生理活跃时期，接种量适当加大，营养和环境条 件适宜，延滞期将显著缩短，甚至直接进入指数生长期。

第二节 微生物的生长规律
（一）细菌的生长曲线 如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基中， 在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的 菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加 快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培 养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为 逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段， 最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间 为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到 一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线， 该曲线则称为生长曲线（图4-5 ）。

第一节 微生物生长的测定
2. DNA 测定法 这种方法是基于 DNA 与 DABA — 2HCl( 即新配制的 20 ％ W／ W ， 3,5 - 二氨基苯甲酸 —盐酸溶液 ) 结合能 显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬液的荧 光反应强度，求得 DNA 的含量，可以直接反映所含细胞 物质的量。同时还可根据 DNA 含量计算出细菌的数量。 每个细菌平均含 8.4 × 10 -14 g DNA 。

第一节 微生物生长的测定
图 4-1 血球计数板方格示意图

第一节 微生物生长的测定
（二） 比浊法 这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌 悬液中的单细胞微生物的细胞浓度与混浊度成正比，与透 光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此， 测定菌悬液的光密度 ( 或透光度 ) 或浊度可以反映细胞 的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比， 求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度计是测 定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有 局限性。适用于菌悬液浓度在10-7个/mL以上、颜色浅，没 有混杂其他物质的样品。

第二节 微生物的生长规律
（三）霉菌的生长 由图4-4可以看出，霉菌的生长特性是菌丝伸长与分支， 从菌丝体的顶端通过细胞间的隔膜进行生长。菌丝体既可 是长的和分散的，也可以是短的和高度分支的，或者是两 者的混合形式。当霉菌生长在培养基表面时，菌丝体可以 形成菌落；在深层培养时，菌丝体多数情况下形成菌丝团， 也有分散的菌丝形式存在。

第一节 微生物生长的测定
(二)从培养基成分的消耗量来估算 选择一种不用于合成代谢产物的培养基成分为检测对 象，如磷酸盐、硫酸盐和镁离子，从这些成分的消耗量可 以间接的估算出菌体的生长速度。若发酵的主要产品是菌 体本身，也可以从碳源或氧的消耗来估算。 (三）从细胞的代谢产物来估算 在有氧发酵中， CO2 是细胞代谢的产物，它与微生物 生长密切相关。在全自动发酵罐中大多采用红外线气体分 析仪来测定发酵产生的 CO2 量，进而估算出微生物的生长 量。

第一节 微生物生长的测定
一、直接计数法 （一） 计数器直接计数法 又称全菌计数法，将待测样品适当稀释后，染色，加 到血球计数板 ( 适用于细胞个体形态较大的单细胞微生 物，如酵母菌等 ) 或细菌计数板 ( 适用于细胞个体形态 较小的细菌 ) 上的计数室内，在显微镜下计数一定体积 中的平均细胞数，换算出待测样品的细胞数。 这是一种 常用的方法，快速、简便，所得结果是死菌和活菌的总数 （图 4-1）。

第二节 微生物的生长规律
二、微生物群体的生长规律 对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规 律因其种类不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群 体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物 而言，在特定的环境中，不同种的微生物表现出趋势相近 的生长动力学规律。

工业微生物
第四章 微生物的生长

第一节 微生物生长的测定
微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量 或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观 地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评 价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效 果，或客观反应微生物的生长规律。因此微生物生长的测 量在理论上和实践上有着重要的意义。 根据考察的角度、测定的条件和要求不同，可将微生 物生长的测量方法分为直接计数法和间接计数法。

第二节 微生物的生长规律
图 4 -5 细菌生长曲线

第二节 微生物的生长规律
从图4-5 可见，生长曲线表现了细菌细胞及其群体在 新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学 变化过程，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延滞期、 指数生长期、稳定期、衰亡期。深入研究各种单细胞微生 物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论 与应用实践上都有着十分重要的意义。

第二节 微生物的生长规律
（二）真菌的生长 酵母菌主要是通过出芽方式繁殖，少数酵母也可以通 过分裂或菌丝伸长来繁殖。观察图 4-3，芽殖是子细胞在 与母细胞大致相同时就从母细胞上分离。酵母的母细胞与 子细胞实际上可以识别，因为母细胞产生每个子细胞都会 留下一个芽痕，因此酵母细胞的群体有一个连续变化的菌 龄分布。

第一节 微生物生长的测定
二、间接计数法 （一）测定细胞组分的含量进行估算 1. 含氮量测定法 细胞的蛋白质含量是比较稳定的，可以从蛋白质含量 的测定求出细胞物质量。一般细菌的含氮量约为原生质干 重14％。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计 算： 蛋白质总量 = 含氮量百分比× 6.25

第一节 微生物生长的测定
（六） 薄膜过滤计数法 测定水与空气中的活菌数量时，由于含菌浓度低，则 可先将待测样品 ( 一定体积的水或空气 ) 通过微孔薄膜 ( 如硝化纤维薄膜 ) 过滤浓缩，然后把滤膜放在适当的 固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。此法适用于测 定量大、含菌浓度很低的流体样品，如水、空气等。

第二节 微生物的生长规律
1．延滞期
又称迟缓期、适应期。细菌接种到新鲜培养基而处于 一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上分裂，细 菌的数量维持恒定，或增加很少。此时细胞内的 RNA 、蛋 白质等物质含量有所增加，细胞体最大，说明细菌并不是 处于完全静止的状态。延滞期具有以下特点：a.生长速率 常数等于零；b.细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成长 丝状； c. 细胞内 RNA 尤其是 rRNA 含量增高，原生质呈嗜碱 性； d. 合成代谢活跃，核糖体、酶类和 ATP 合成加快，易 产生诱导酶；e.对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度 和抗生素等化学药物的反应敏感； f.分裂迟缓、代谢活跃。