畜禽基因定位方法及研究

畜禽基因定位方法及研究
基因定位是指准确的确定控制表型性状的基因在基因组上的位置，包括确定基因在连锁群上相对位置的遗传定位和确定基因在染色体上具体位置的物理定位。

对基因的识别与定位将使人们对单个基因的作用及其与其它基因的互作加深了解，从而建立更适合反映性状变异的统计模型，找到基因与各种性状间的相关关系，以更有效地估计育种值并在远期控制动物疾病。

早在1923年SAX就成功地利用了遗传标记进行数量性状基因位点定位试验，但长期以来由于缺乏合适的遗传标记．使这些研究没有重大的进展。

自从微卫星等各种遗传标记的出现及其测定方法的不断改进，特别是人类基因组计划的启动，使得基因定位研究发展十分迅速翻。

畜禽基因定位计划于20世纪90年代初开始实施，其主要目标是要找到重要经济性状座位或与之连锁的DNA标记，并将其用于标记辅助选择来改良畜禽品种，提高畜禽生产效率和经济效益。

1 遗传图谱的构建
基因的精确定位首先依赖于遗传图谱(genetic map)。

遗传图谱又称为遗传连锁图谱(genetic linkage map)，是利用多态性遗传标记，通过对参考家系进行遗传连锁分析得到的，反映了遗传标记之间的相对关系。

遗传图谱的质量取决于连锁群中的遗传标记的数量、杂合度和均匀分布的程度，遗传标记之间的距离用分摩尔根(eM)表示。

从理论上讲，任何一个可观察性状的基因座位都可以在连锁遗传图谱中找到一个与之相连锁的DNA标记。

因此。

分析畜禽经济性状座位(通
常是数量性状座位，QTL)在基因组的位置以及对表型性状的影响，主要都是依赖于遗传连锁图谱。

构建遗传图谱的程序大致包括：建立参考家系(reference famiIv)；对参考家系的每一成员组作遗传标记的基因型分析：进行标记间的连锁分析，得出连锁群；绘制遗传图谱。

畜禽遗传图谱的研究始于20世纪80年代末期，进入上世纪90年代以来，美、欧、日等发达国家先后启动了动物基因组研究计划。

纷纷投入巨资和庞大的科研力量进行研究。

短短10余年的时间，在猪、牛、绵羊、鸡等主要畜禽上取得了巨大的进展。

随着动物基因组研究计划的深入开展，各种畜禽更加完善的遗传图谱将陆续被构建出来。

2物理图谱的构建即基因的精确定位
物理图谱的研究旨在将被克隆基因或DNA标记精确的定位于染色体上．对于研究物种进化和位置克隆经济性状基因有着十分重要的作用。

基因的物理定位方法通常有体细胞杂交法、荧光原位杂交法、引物原位标记法、系列对比法等。

2．1 体细胞杂交法
在已定位的全部基因中，约有40％的基因是用这一方法定位的。

此法可进行基因同线性测定(synteny test）及区域定位。

其基本条件是要获得核型相对稳定一致的体细胞杂种克隆，即由若干杂种细胞构成的一套杂种细胞克隆(如猪／鼠)，每个细胞克隆都包含各自不同的染色体组合模式，构建克隆棋盘fclone panel)。

研究者把各杂种细胞克隆及所含染色体都列在一个表上。

若要对某特定表型对应的基因定位．就可取出这些细胞克隆材料，分析有无有关产物，再与克隆棋盘所列染色体对照，即可确定基因所在染色体。

如果要进行基因的区域定位，则必然有一套含有特定染色体结构变异或保留特定染色体片段的克隆棋
盘。

利用体细胞杂交法定位猪基因的典型例子是MPI （甘露糖磷酸异构酶)和NP(核苷磷酸化酶)基因的定位研究。

Christensen等f1985)利用猪脾细胞和鼠骨髓细胞融合．产生了19种猪，鼠杂种细胞系。

通过分析19种细胞的核型和猪的7种酶的存在状况．发现杂种细胞包含全部鼠染色体和极少数猪染色体．而MPI和NP总是与猪的7号染色体同时存在，因此肯定MPI和NP基因位于7号染色体上。

Ryttman等(1986)建立了包含24个猪，鼠杂种细胞克隆的克隆分布板(Clone panel)。

通过详细的分析研究，进一步证实MPI位于猪的7号染色体上。

Ryttman等(1988)利用一涉及到7号染色体相互易位的猪成纤维细胞，建立了包含18个猪／鼠杂种细胞系的克隆分布板。

对MPI和NP进行区域定位。

由酶与核型对应关系的分析。

确定NP位于7q12-qter，MPI位于7q12-pter。

2．2荧光原位杂交法
原位杂交(ISH）最早被用于染色体组型和核酸分布的分析，后来，随着技术的发展，它被用于基因染色体定位的研究．特别是非同位素标记技术的发展。

使得ISH的应用日益广泛。

目前它已被用于肿瘤的细胞遗传改变、人类的早期发育、核与基因组的分子结构、不同种同间的基因图诺比较、动物的细胞发生和无数的基因定位研究。

用于基因染色体定位的FISH~被称为C0-FISH或COD-FISH(chromosome orientation and direction FISH)。

CO-FISH技术是以生物素或地高辛等半抗原为标记物．采用随机引物法或缺口平移法标记DNA探针，将探针变性后即可用于细胞分裂中期或间期细胞核染色体的原位杂交并产生 DNA-DNA杂交体，这种杂交体可以被与半抗原有高度亲和力的荧光标记分子所检测到，而这种杂交信号又可以被与荧光分子偶联的单抗所放大。

此外，DNA探针也可以直接标以荧光分子，这些荧光分子有：FITC、德克
萨斯红(texas rod)及最近开发的花青染料(cyanine dyes)等，如果这样，就不需要进行信号检测和放大就可以直接观察DNA-DNA杂交体。

用于FISH的DNA底物已经由原先固定的染色体和间期细胞核发展到伸展的单链DNA分子、细胞核及染色体的自然形态等。

由于FISH技术已经可以在伸展的DNA分子上进行，这样它的分辨率就达到1～2 kb，并能在此区域内作图。

而传统的在细胞中期和间期进行的FISH只能分别分辨1~5 Mb和50 kb左右的区域，分辨率的提高使得更详细的基因结构和基因内重排研究成为可能。

FISH对自然状态下细胞和染色体的研究可以阐明核成分的分布并且不会出现象计算机三维重建分析时的干扰现象；同时．还能对二条同源染色体转录活性的核功能进行研究，并可直接观察基因表达过程中核成分的位置。

FISH不仅能对固定的标本进行研究，还能对新鲜的标本进行研究，更有报道认为它能分辨单一碱基的替换。

用于基因定位的FISH技术经历了从用洗涤剂或碱裂解液处理细胞核产生伸展状染色质，从机械拉展染色质到分子梳，再到最近的动态分子梳技术(dynamic molecular combing DMC)。

DMC技术是分子梳枝术和荧光杂交技术的结合，它分为4个步骤：(1)制备三氯硅烷包被的玻片；(2)从低熔点琼脂糖胶中制备DNA 溶液；(3)将玻片浸于溶液里5 min，使DNA结合到玻片上：(4)用300 I~m／s 的速度将玻片从溶液中抽出。

由于在玻片一溶液界面处．浸在溶液中的部分对已抽出部分有一种持续的回复力，加上它们的疏水性．硅烷的表面很快就干燥，使得被拉长的DNA纤维不可逆地被固定于玻片表面，这种DNA纤维呈平行状、单方向分布．似梳子状。

整个表面的伸展是均一的，它不受DNA片段大小的影响。

与其它方法相比，DMC技术有如下优点：(1)在整个平面的伸展可使杂交信号为单一信号，无需标化；(2)不同的表面和不同的溶液中DP4A的伸展无变化；(3)高
密度的基因组DNA和杂交信号可使统计分析在一张f22x22)mm2的载玻片上即可进行；(4)一定的DNA断裂可产生持续的可分析的数百kb的DNA片段；(5)可从同一种DNA溶液中制备出许多伸展平面。

2．3引物原位标记法
染色体上引物原位标记(primer in sire labelling，PRINS)技术是Koch等建立的DNA分析新方法。

其基本原理是：在退火温度下，使已变性的染色体与标记的寡聚核苷酸引物特异结合．在DNA聚合酶(Klenow或Taq等)催化下，以标记脱氧核苷酸为底物，在合适的温度下，进行延伸反应，合成含有标记的DNA 链。

标记DNA链通过相应的检测系统被检测。

检测方法同原位杂交。

刘榜等采用酶联检测PRINS对SW60进行了定位。

靳更林等采用荧光检测PRINS对SW605进行了定位。

随着分子生物学技术的不断发展，又产生了一些基于PRINS技术的新方法．如Terkelsen等提出的重复引物原位标记(repeat-PRINS)技术和Volpi
等提出的多色引物原位标记(multicolor— PRINs)技术业已应用于DNA的染色体定位中。

2．4 Contig拚接和染色体步移
正如象多态微卫星的出现使基因作图产生革命性变化一样．YACs之类大基因片段(>100 kb)的成功分离，使得众多哺乳动物基因组物理标签和长距离图谱的构建成为可能。

目前构建YAC文库的载体多为标准的pYAC4载体，它含有着丝粒和端粒以保证染色体在酵母细胞中呈稳定的线性分子。

极高分子量的基因组DNA就插入在选择载体的臂之间，连接的人工染色体导入酵母的原生质体中复制并保持稳定。

YACs中插入片段的长度在500· kb—l Mb之间，它足以被用于物理作图。

目前用于YAC文库筛选的方法基于二种基本技术：PCR技术和杂交技术。

尽管杂交技术有其特点，但其信号低、重复元件产生的高背景及技术要求高等缺点，使得它已渐渐被PCR方法所淘汰。

尤其是IRS-PCR（interspersed repetitive sequence，PCR)的出现，更使PCR在其中的优势得到充分体现。

一旦YAC的末端被分离，接下来的关键是确定二个末端是否与预期的标签相匹配，由于被分离的YAC末端极少适合于FISH，故只能用Southern杂交；如果这个末端测序后可作为STS(sequence tag site)的话，也可以用PCR的方法进行鉴定。

而最简单的方法是通过contig标签与已知YAC比较来确定新YAC的位置；如果这个方法不行的话，可将末端与体细胞杂交体或放射杂交体板、基因组PFGE图谱等一起分析。

由于YAC克隆存在的一些缺点．如嵌合和重组等，现在又发展了细菌人工染色体（hacterial artificial chro— mosome，BAC)、噬菌体P1克隆系统和P1衍生的人工染色体（Pl-derived arti— ficial chromosome，PACs)等，这些质粒均是在细菌中进行繁殖，易于转导．可对插入末端进行直接测序。

目前BACs 和PACs已成为基因组计划的“序列准备”模板fsequence-ready template)。

利用文库构建整条染色体或基因组的物理图谱主要采用二种方法：一是使用含有STS的图谱，根据有序的、重叠的STS构建，它的首要前提是高密度、具有良好顺序的STS图谱；二是通过建立大的标签进行指纹分折。

利用PCR和杂交，再结合限制酶消化，即可进行染色体步移。

2．5比较基因作图或比较物理图谱
基因非编码区的进化明显比编码区快很多，通过对不同种已知基因的比较可以发现，不同种属的基因编码区有相当高的同源性，因此可以利用这个特性进行基因作图和基因定位。

也就是说，一旦某一性状被定位于人染色体的某特定区域，
这些信息f附近的ESTs和候选基因等)也可以移植到动物的相应区域。

目前，人类和小鼠的基因组计划已经完成，我们可以借助于它们的基因序列，依据其同源保守区域设计引物在动物基因组上扩增出相应基因，然后根据基因的控制序列，上下游元件确定基因的全部序列以及定位在染色体的具体位置。

在这方面比较新的方法是Lvons等人的比较锚定标签序列fcomparative anchor— tagged sequence，CATS)和Marklund等人的异种二聚体分析fxenoduplex analysis)。

CATS可同时扩增不同脊椎动物的相同编码序列，比较适合于对单一外显子的扩增，由于进行连锁分析的遗传多态性在较短的编码区内比较难发现，IEICATS扩增出来的序列长度一致。

限制了体细胞杂交体图谱的构建，要克服这些困难又要花费大量的人力物力。

异种二聚体分析是在CAT$基础上改进而成，它是将不同物种的PCR产物混在一起进行变性、复性．这样同源的二条链就可杂交在一起。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出异种杂交体进行分析，采用体细胞杂交体(sCH)作图法作图。

关于基因的染色体定位尚有不少其它的方法。

不过这些方法几乎均与上述介绍的方法相关，或者是与以下的一些方法结合，如：显微分割法（micro dissection)、荧光活化细胞分选法(fluorescence activated cellsonin8，FACsl、变性寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide primer PCR．DOP-PER)、体细胞杂交体(somatic cell hybridsl、散在重复序列PER(interspersed repetitive sequence PER，mS-PCR)、基因定位与克隆等。