毛状根

发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究
陈佳20072502613
华南师范大学生命科学学院广州510630
摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。

并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。

结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。

但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。

关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素
Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by Agrobacterium
Rhizogenes
Chen Jia 20072502613
College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin
含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。

当发根农杆菌侵染受伤植物细胞后,Ri质粒的含rol基因的T-DNA部分被整合进入植物细胞核基因组中表达后, 可诱导受伤植物细胞形成毛状根(hairy roots)[1]。

而且，由于Ri质粒的T-DNA片段转化植物细胞后产生的毛状根能在无外源激素的培养基上快速自主生长，而且具有遗传稳定及单细胞起源等特点；因而，将农杆菌遗传转化植体细胞后所产生的不定根置于无外源激素但添加合适浓度抗生素的培养基进行单根离体除菌培养后，所获得的可在无外源激素培养基上自主生长的无菌不定根即可能是Ri质粒T-DNA转化毛状根。

为此，本文我们利用含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌对黄瓜子叶的遗传转化，获得能在无激素的培养基上自主生长的毛状根。

1 材料和方法
1.1材料“津研4号”黄瓜种子，农杆碱型发根农杆菌菌株R1601
1.2培养基
用于侵染的MS液体培养基（+3%蔗糖），用于共培养的无外源激素MS培养基（+3%蔗糖+0.7%卡拉胶）；
诱导培养基：MS+Cep500mg/L（+3%蔗糖+0.7%卡拉胶）；
筛选培养基：MS+Cep500+Kana200，MS+Cep500+Kana400，MS+Cep500+Kana500，MS +Kana400。

1.3 无菌苗的获得将黄瓜“津研4号”种子用0.1%HgCI，消毒20min，无菌水漂洗3次后，在盛载湿润无菌纸的果酱瓶中暗萌发48h后，转移至恒温光照培养箱中，在每天12 h光照、光强2 000 Ix、25℃下萌发成无菌苗。

1.4 侵染及共培养将萌发10d的黄瓜幼苗子叶每片切三刀成两小块，放入用MS液体培养基稀释2倍的发根农杆菌菌悬液中浸泡15~20min，取出、吸干多余菌液并放入共培养的培养基，其中3瓶实验组，1瓶对照组，每瓶放3~5块。

于28℃、黑暗条件下进行共培养。

1.5 毛状根的诱导共培养3d后，将受感染的外植体转接入诱导培养基中，在28℃、光照下进行除菌及毛状根的诱导。

及时观察，若有出现外植体污染，则将同培养基内其他未被污染的及时转到新诱导培养基中除菌。

1.6毛状根的筛选将上述彻底除菌的不定根切下，长度1cm左右，放入四个不同的筛选培养基中，每瓶接2~3根嫩根，1根老根或侧根作对比，检测卡那霉素抗性。

不定期地观察毛状根的生长情况。

2 结果
2.1共培养时的生根情况
被发根农杆菌感染的黄瓜子叶外植体共培养3~4 d后，可观察到从子叶形态学下端切口中脉附近产生颗粒状白色或浅绿色的愈伤组织，并逐渐分化产生出密被白色根毛的不定根（图1，表1），而在其形态学上端极少产生愈伤组织和生根，产生毛状根的子叶百分率达83％，平均每个外植体产生7条根。

而未被感染的黄瓜子叶外植体没有愈伤组织形成，也没有分化出不定根。

表1共培养时的生根情况
组别子叶数生根子叶数愈伤组织及不定根生长情况
实验1 3 3 都有形成愈伤组织和不定根，根密而长。

实验2 5 4 愈伤组织较少，大部分根稀疏而短。

实验3 4 3 愈伤组织较多，除一个根密而长，其他的根疏而短。

对照 6 0 几乎没有愈伤组织，也没长根。

图1黄瓜子叶共培养时的生根情况
2.2 毛状根的筛选效果
已转入外源基因的黄瓜子叶里有卡那霉素抗性基因，在含卡那霉素的培养基里，转化不成功的子叶不能生存，而转化成功的子叶能抗卡那霉素，所以能继续生长的不定根很可能是发根农杆菌遗传转化产生的毛状根。

表2的结果显示，MS+Cep500+Kana400的培养基筛选效果最好，嫩根毛状根平均长0.8cm。

这可能是因为400mg/L 的Kana刚好能够抑制非转化的不定根生长，又不会因为浓度太高而影响到转化成功的毛状根生长。

但是总的来说，以黄瓜子叶毛状根的诱导效果并不好，诱导率不高，毛状根不够浓密。

表2毛状根的筛选效果
培养基成分毛状根筛选效果
MS+Cep500+Kana2002个嫩根长0.1~0.2cm，插入培养基；老根长了0.5cm
MS+Cep500+Kana4003个嫩根的两头插入培养基，长0.8cm；老根没长；侧根长出0.6cm
MS+Cep500+Kana6003个嫩根长了一点毛状根，根两端插入培养基里；老根没长
MS+Kana200被农杆菌污染；有一嫩根长了0.9cm，插入培养基；一侧根长得很好，长0.7cm，
也插入了培养基
3.讨论与分析
发根农杆菌R1601具有质粒PriA4b的HinfIⅢ片端2l上整合有NpTⅡ基因。

NpTⅡ是一种报告基因，是植物遗传转化中运用最广泛的选择标记。

它是从细菌的转座子Tn5中分离得到的。

所编码的新霉素磷酸转移酶通过磷酸化得使氨基糖苷类抗生素失活，因此转化的毛状根应有抗卡那霉素的特性[2]。

该试验利用毛状根可以自主生长和抗卡那霉素的特点，通过设置对照组，利用无激素MS培养基和含卡那霉素的Ms培养基进行检测，也完全符合毛状根的特点[3]。

因为肉眼很难观察出毛状根生长之间的差异，而且各组成够转化的毛状根生长都比较缓慢，所以不能判断侵染后生长的不定根是植株是转化的还是非转化，且不能判断诱导率低是培养条件影响还是由于其他因素。

一般而言，Kana400 是抗生素抗性法检测中较适宜的筛选浓度，较低的浓度，如Kana200，可能对非转化根的致死率不高，而较高的浓度，对低效转化毛状根也会有一定的抑制作用。

对于更精准的检测，根据非转化根不能产生冠瘿碱，而转化根可以，可对其冠瘿碱的检测。

再者，可对毛状根进行PCR检测和甘露碱检测等。

如施和平[4]等通过PCR 检测证明，发根农杆菌的含rol基因的RiT-DNA部分已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。

在本实验中，无论卡那霉素浓度是多少，黄瓜子叶毛状根的诱导率普遍较低，转化低效。

可能是由于子叶主要是营养器官，其细胞特点不适宜诱导毛状根；在姚庆收[5]等发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究中，除子叶外的茎段、叶片、根3种外植体都诱导出毛状根，且发根多集中在维管束组织附近。

他人的研究中也有发根集中在维管束组织附近的现象[6-7]。

该试验对外植体做纵切划痕处理组诱导率明显高于未处理组，且做纵切划痕处理组划痕至维管束组织。

该试验表明维管束组织或其附近的细胞更易受发根农杆菌侵染而产生毛状根。

参考文献
[1] 潘瑞炽主编. 植物细胞工程[M]. 广州：广东高等教育出版社, 2008, 167.
[2] 李雅丽, 张凯．用农杆菌Ri诱导蒙古黄芪发根培养的研究[J]．云南植物研究，2005，27(2)：204—210．
[3] 姚庆收, 倪艳波, 潘效红, 等. 发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究. 安徽农业科学.2007，
35(34):11075.
[4] 施和平, 齐莹, 张悦, 等. 黄瓜毛状根的诱导及细胞分裂素6-BA对其生长和形态的影响.
生物工程学报.2006, 22(3):516.
[5] 姚庆收, 倪艳波, 潘效红, 等. 发根农杆菌诱导苦参毛状根的研究. 安徽农业科学.2007,
35(34):11075.
[6]王英娟, 步怀宇, 李多伟, 等．烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探[J]．植物学通报，2006，
23(4)：334—340．
[7]刘传飞, 李玲, 施和平, 等．野葛毛状根的诱导及离体培养[J]．中国中药杂志，2O00，25(9)：525—527。