低剂量脂多糖诱导的PC12细胞中Nrf2的表达及对和ROS影响

低剂量脂多糖诱导的PC12细胞中Nrf2和ROS表达的实验研究
朱凤臣蒋电明李维朝祁小桐
（重庆医科大学第一附属医院骨科，重庆400016）
摘要：目的研究低剂量脂多糖（LPS）诱导的PC12细胞中核因子E2相关因子2（Nrf2）和活性氧（ROS）的表达。

方法分别以浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1μg/μl 的LPS刺激PC12细胞24h，MTT法检测细胞活性确立对细胞没有毒性作用的最大安全剂量；采用此剂量刺激PC12细胞，RT-PCR、Western-blot检测细胞内Nrf2 mRNA、总蛋白及胞浆、胞核内Nrf2蛋白的表达；流式细胞仪检测LPS处理8h细胞内ROS的平均荧光强度。

结果LPS浓度小于0.1μg/μl对细胞没有明显毒性作用；采用0.1μg/μl LPS刺激PC12细胞，24h内细胞内Nrf2 mRNA及总蛋白表达升高，在12h内胞浆Nrf2蛋白表达减少，胞核蛋白表达升高；在0.1μg/μl LPS刺激的8h，PC12细胞内ROS的平均荧光强度明显减弱。

结论低剂量LPS具有时间依赖性方式促进PC12细胞内Nrf2转录、翻译和胞浆到胞核转位的作用，并可能调控抗氧化机制下调细胞内ROS表达水平。

关键词：脂多糖 PC12细胞 NF-E2相关因子2 保护机制活性氧
分类号：R 741.02；R338．2；R392．32 文献标识码：A
Low-dose lipopolysaccharide-induced Nrf2 expressions in PC12 cells
and its effect on ROS
ZHU Feng-Chen, JIANG Dian-Ming , LI Wei-Chao, QI Xiao-Tong
Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing, China, 400016
Abstract:Objective To study the low-dose lipopolysaccharide (LPS)-induced Nrf2 and ROS expressions in PC12 cells. Methods Stimulating PC12 cells with various
concentrations of LPS (0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 μg / μl) for 24h, MTT assay was conducted to establish maximum safe dose for cell viability. Stimulating PC12 cells with this dose, Nrf2 mRNA and protein in the whole cells, Nrf2 protein in cytoplasm and nucleus were detected by RT-PCR, Western-blot. Flow cytometry evaluated the mean fluorescence intensity of ROS in PC12 cells stimulated by LPS at 8h. Results Less than 0.1μg/μl LPS concentration had no toxicity for cell activity. Nrf2 mRNA and protein expressions in the whole cells increased in PC12 cells stimulated with 0.1μg/μl LPS in 24h. In 12h, Nrf2 protein within cytoplasm decreased, however the protein expressions in nucleus increased. PC12 cells stimulated by 0.1μg/μl LPS significantly decreased the mean fluorescence intensity of ROS in cells at 8h. Conclusion Low-dose LPS promotes Nrf2 transcription, translation and translocation from cytoplasm to nuclear in PC12 cells in a time-dependent manner, and may regulate antioxidant mechanisms to decline the intracellular ROS expressions.
Key words:lipopolysaccharide; PC12 cell; NF-E2-related factor 2; protection mechanism; reactive oxygen species
ROS（Reactive oxygen species）的产生和它对双分子（如DNA、脂质、蛋白）的氧化修饰被证明和很多疾病有关，例如缺血再灌注、神经退行性变、动脉粥样硬化等。

中枢神经系统因其耗氧量高、所含的多不饱和脂肪酸丰富易于产生ROS，因此越来越受到人们的重视。

Nrf2（nuclear factor-erythroid 2-related facor-2）是CNC(cap“n”collar)转录因子家族的转录调节因子，可与抗氧化元件（antioxidant response element，ARE）结合，调控一系列抗氧化、抗炎、解毒相关基因，对维持细胞的氧化还原活性具有重要的作用。

内毒素耐受于上世纪六七十年代发现，后来人们认识到LPS和很多刺激之间存在着交叉耐受，并发现低剂量的LPS对很多疾病有保护作用。

Thimmulappa等[1]发现TLR4的下游激酶受细胞内部氧化还原因子的调控，Nrf2/ARE通路在其中发挥了重要的作用。

对LPS 激活的神经系统内源性抗氧化保护机制进行研究，将有助于我们进一步认识炎症在神经系统中的作用，并寻找治疗内毒素血症类复杂疾病的一种基于抗氧化的方法[2]。

本实验采用低剂量的LPS处理PC12细胞，观察细胞内Nrf2表达及ROS变化，
初步探讨神经系统疾病炎症过程中的抗氧化机制。

1材料和方法
1.1材料
1.1.1主要试剂及来源
RPMI1640培养液、新生牛血清、马血清（Hyclone），LPS(E.coli055：B5)，二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶、2′-7′-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA) (Sigma)，青霉素、链霉素粉剂(华北制药有限公司)，乙二酸四乙酸（EDTA）(Amresco)，PrimeScript TM RT reagent Kit、Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)，Trizol试剂、DNA Marker、羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），Nrf2 抗体（Bioworld）,β-actin抗体 (北京博奥森生物技术有限公司)，细胞总蛋白抽提试剂盒、细胞核与细胞浆蛋白抽提试剂盒、ECL发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.1.2引物设计合成
用Primer 5.0引物设计软件设计引物,并由上海生工合成。

Nrf2上游引物：5′-CAGTCTTCGCCACCCCTGAT-3′,下游引物：5′-CAGTGAGGGGATCGATGAGT-3′，扩增片段长约244bp。

GAPDH上游引物：5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3′，扩增片段长度约595bp。

1.2方法
1.2.1细胞培养
PC12细胞株由重庆医科大学附属第一医院中心实验室惠赠。

将PC12细胞株复苏后接种于含有10%新生牛血清、5%马血清、青霉素和链霉素各100IU／ml的RPMI1640培养液中， 37℃、5％CO
条件下培养。

待细胞铺满瓶底70%～80%
2
时,0.25％的胰蛋白酶和0.02％ EDTA的消化液消化1min左右，按1:3传代，隔天换液，培养三代后用于以下实验。

1.2.2 细胞活力的测定（MTT法）
取PC12细胞调整浓度至2.0x105/ml，按每孔200μl接种于96孔板中，37℃、条件下培养16～18h至细胞贴壁，弃上清，加入用完全培养基配制的LPS，5％CO
2
使各组的药物浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1μg/μl，每组6孔，继续培养24小时，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续孵育4小时，弃上清，加入150μl DMSO振荡均匀，酶标仪上检测波长490nm处吸光度值。

1.2.3 RT-PCR
0.1μg/μl LPS分别刺激PC12细胞6、12、18、24h，trizol法提取总RNA，按照试剂盒要求逆转录合成cDNA,再以cDNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增。

Nrf2的扩增条件：95℃预变性3分钟，95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，30次循环，72℃延伸10分钟。

GAPDH的扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃ 20秒，22次循环，72℃延伸3分钟。

2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，Gel Doc XR凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)成像。

1.2.4 Westen-blot
0.1μg/μl LPS分别刺激PC12细胞不同时间，预冷的PBS洗涤细胞2次，分别提取细胞总蛋白、胞浆与胞核蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。

经10%SDS-PAGE电泳，Bio-Rad Western印迹分析仪将蛋白转移至PVDF膜上。

室温下5%脱脂奶粉封闭2小时，4℃孵育Nrf2抗体、β-actin抗体过夜，相应的二抗孵育1小时，加入ECL发光试剂，Gel Doc XR凝胶成像系统对PVDF膜条带行灰度值测定。

1.2.5 流式细胞仪检测ROS
2′-7′-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)是一种能自由通过细胞膜但不发光
的化合物，在细胞内经酯酶水解生成DCFH，在经过活性氧氧化生成有荧光的DCF。

将LPS加入培养至融合度80%左右的PC12细胞， 8小时后收集PC12细胞，用无血清培养基重悬，终浓度10μM的DCFH-DA 37℃孵育1h，用PBS清洗二遍，流式细胞仪(B D，美国, 激发光波长488 nm ) 检测, 每个样品收集1×104个细胞,用CellQuest
软件分析结果。

1.2.6 统计分析
每项试验至少重复3次，数据以用x±s表示。

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结果
2.1不同浓度的LPS对PC12细胞活力的影响
为研究PC12内源性保护机制，首先要排除药物对细胞毒性作用的干扰，我们分别用不同浓度的LPS处理PC12细胞24h，MTT法检测LPS对细胞活性的影响（见图1）。

结果发现当LPS浓度小于0.1μg/μl时对细胞没有明显毒性作用（P＞0.05），而随浓度的增大（＞0.1μg/μl），细胞的活性明显下降（P＜0.01）。

以下实验采用0.1μg/μl LPS处理PC12细胞，检测Nrf2 mRNA和蛋白表达。

图1 不同浓度LPS作用24小时对PC12细胞活性的影响
2.2 LPS处理的PC12细胞Nrf2 mRNA的表达
结果显示，Nrf2 mRNA水平在LPS处理的PC12细胞后，随时间增加呈上升趋势，其中18h组与空白组、24h组与空白组及6h组比较差异具有统计学意义。

（见
图2）
A
B
A:RT-PCR检测结果；B：半定量分析结果；a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.05，与6h组比较
图2 LPS处理的PC12细胞Nrf2 mRNA表达
2.3 LPS处理的PC12细胞中总的Nrf2蛋白与胞浆、胞核Nrf2蛋白表达
结果显示，LPS分别处理PC12细胞6、12、18、24h，Nrf2总蛋白的相对含量随时间增加呈上升趋势;LPS处理1、3、6、12h后，胞浆Nrf2蛋白表达与空白对照组比较随时间呈下降趋势，6h降至最低，后似有恢复趋势；胞核Nrf2蛋白表达均升高，3h达峰值（见图3）。

上述实验说明低剂量LPS刺激下，PC12细胞通过转录和翻译使Nrf2蛋白合成增多，在刺激的早期就出现了Nrf2蛋白从胞浆到胞核的转移。

A:细胞内总Nrf2 表达；B ：总Nrf2定量分析结果；C ：胞浆和胞核Nrf2表达；D ：胞浆和胞核Nrf2定量分析结果；总Nrf2：a ：P ＜0.01，与对照、6h 组比较；b ：P ＜0.05，与12、18h 组比较；胞浆Nrf2: c ：P ＜0.05，与对照组比较; 胞核Nrf2：d P ＜0.01，与对照组比较；e
P ＜0.05，与3h 组比较
图3 LPS 处理的PC12细胞总Nrf2蛋白和胞浆、胞核Nrf2蛋白表达
2.4 细胞内ROS 的变化
为研究LPS 对细胞内ROS 的影响，分别采用0.1μg/μl LPS 与空白对照组及低剂量组（0.05 μg/μl ）刺激PC12细胞8h ，收集、检测细胞内ROS 平均荧光强度。

结果发现，0.05 μg/μl 组（平均荧光强度：142.74±5.42）、0.1μg/μl 组（平均荧光强度：130.00±4.24）的平均荧光强度值均较空白对照组（平均荧光强度：155.99±5.78）降低（P ＜0.01），两组间比较后者较前者亦降低（P ＜0.01）。

A
B
C
D
3 讨论
中枢神经系统是高耗氧量器官，就大脑而言，它占全身重量的2%，而耗氧量占20%[3]。

除此之外，中枢神经系统的多不饱和脂肪酸含量丰富，氧化还原的过渡金属离子含量高，抗氧化能力较其他器官差[4]，所以易于遭受氧化应激的损伤。

生物活性小分子ROS是需氧器官氧化代谢的产物，在细胞的信号传导方面发挥着重要的生理作用[5]。

正常情况下，细胞内ROS的产生和抗氧化能力之间存在一个平衡，如果ROS产生过多，超出细胞的对抗能力就会导致氧化应激。

目前研究发现，ROS 引发的脂质氧化和过氧化在中枢系统疾病的病理过程中具有重要的意义。

人体的天然免疫系统是机体感应和清除入侵微生物的第一道防线[6]。

但炎症反应失控会导致持续的组织损伤。

组织分布广泛的TLR受体是细胞感受病原体的重要受体，这些受体和其下游有限的调控因子形成如“沙漏”样模式[2]。

TLR的下游因子受到氧化还原依赖性的翻译后修饰，调控着TLR的信号通路。

研究氧化还原调控的TLR信号通路，将有助于找到基于抗氧化原理治疗复杂疾病（如内毒素血症）的疗法。

LPS与细胞表面的TLR4受体结合，介导下游基因的表达，在调控细胞的炎症反应和天然免疫方面具有重要的作用。

研究发现，很多刺激，甚至手术应激和缺血，都可以出现与内毒素的交叉耐受[7]，提示机体对内毒素的耐受可能可能与其他刺激因素的抵抗存在共同的作用机制。

Nrf2调控细胞解毒、抗炎、抗氧化因子，在细胞保护方面发挥着重要作用[8]。

内毒素血症或LPS处理会引起细胞中某些Nrf2调控的基因表达（如HO-1、NAD(P)H、GST、Prx）[9,10,11]。

患有内毒素血症的Nrf2基因敲除小鼠，炎症因子表达升高，死亡率明显增加[1]，说明Nrf2在炎症调控和细胞保护方面发挥了重要作用。

深入研究Nrf2的抗氧化应激调控机制有助于我们进一步了解疾病的形成过程，并找到有效的治疗方法。

PC12细胞是一种常用于体外实验的神经细胞株，Hillion等[12]认为PC12可以作为神经元细胞耐受的细胞模型进行大通量的实验研究。

本实验采用低剂量的LPS 刺激PC12细胞，发现PC12细胞有较强的内毒素耐受性，大于0.1μg/μl的LPS 才对其产生明显毒性作用，与Omata等[10]研究结果（0.5μg/μl）存在出入，其
原因主要考虑是培养条件的不同引起。

在低剂量LPS（0.3 mg/kg、1mg/kg）处理新生鼠脑缺血再灌注模型中发现，过早或过晚（4h、6h、72h）应用LPS都不能减轻新生鼠的缺血再灌注损伤[13]。

在心肌保护的研究中发现TLR4激动剂（LTA/LPS）预处理8～24h才会出现明显的缺血再灌注耐受[14]。

本研究发现以0.1μg/μl处理PC12细胞24h内细胞Nrf2 mRNA 和总的Nrf2蛋白水平明显上调。

在胞浆、胞核的蛋白水平研究显示，胞浆Nrf2蛋白在早期明显呈下降趋势，而胞核蛋白呈上升趋势，这提示Nrf2可能通过合成和核转位发挥细胞的保护作用。

目前研究认为ROS可以活化Nrf2/ARE通路,而激活的Nrf2又可以减少ROS的产生，进而发挥对细胞的抗氧化保护作用。

Lin等[15]研究发现LPS预处理可以明显提高新生鼠的低氧缺血的预后，并明显减少低氧缺血所致的ROS产生。

本实验采用LPS 0.1μg/μl处理PC12细胞8h，与空白组及另一低剂量组（0.05μg/μl）比较，明显降低细胞内ROS的产生，提示低剂量的LPS预处理细胞一定时间可能激活Nrf2介导的抗氧化机制，增强细胞的抗氧化能力。

炎症反应存在于中枢神经系统创伤或感染性等疾病。

本研究显示Nrf2/ARE通路可能在中枢神经系统抗氧化方面发挥重要作用，对该通路进行研究将有助于揭示中枢神经系统创伤或感染等疾病炎症反应的病理机制及干预损伤-修复的途径。

参考文献
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作者简介：朱凤臣，男，山东泰安人，在读博士，主要从事脊髓损伤和骨科炎症方面的研究。

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