环孢素A对糖尿病肾病大鼠肾脏转化生长因子-β_1及E-钙黏素表达的影响

个循 环。Ｅ ． 钙黏素反应条件为 ： ９ ４℃变性 ５ ０ Ｓ ， ６ ０℃退火 ５ ０
Ｓ ， ７ ２ ｏ Ｃ 延伸 １ ｍ ｉ ｎ ， ３ ５ 个循环 。扩增产物测序 ， 采集琼脂糖电 泳凝胶 图像 ， 计算 ｍ Ｒ Ｎ Ａ相对表达水平 ， 扫描灰度记 录。 １ ． ６ 统 计 学 分 析 ：计 量 数 据 用 ＋ ｊ 表示 ，所 有 数 据 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ １ ７ ． ０统计 软件分析 ，多组均数 间比较用单 因素方差 分 析。 Ｐ ＜ ０ ． ０ ５为差异有统计学意义 。
２ ． １ 实验大 鼠的生化指标 ： 实验 干预 ４ 、 ８ 、 １ ２ 、 １ ６周 后 ， 测 大
鼠血糖 、 体质量 、 血肌酐及尿蛋 白定量 （ ２ ４ ｈ ） 。Ｄ Ｎ组与 Ｃ Ｏ Ｎ 组相 比， 大鼠２ ４ ｈ尿蛋白明显增加 ， 大鼠体质量减少 ， 血肌酐 明显升高 ，差异有统计学意义 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ； Ｃ ｓ Ａ组与 Ｄ Ｎ组相
型建立成功 的标准 。模型建成后 ４周 ， Ｃ ｓ Ａ组按 ３ ｍ ｇ ・ ｋ ｇ ＿ １ ． ｄ
化， 肾小管排列整齐 ； Ｄ Ｎ组肾小管排列 紊乱 、 萎缩 ， 。 肾小管 细
组（ Ｃ Ｏ Ｎ组 ） 、 糖 尿病 肾病模 型组 （ Ｄ Ｎ组 ） 、 环孢 素 Ａ治疗 组
（ Ｃ ｓ Ａ组 ） 。Ｄ Ｎ组与 Ｃ ｓ Ａ组 大鼠禁食 １ ２ ｈ后一次性腹腔 内注 射 Ｓ Ｔ Ｚ （ ５ ５ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ， 溶于 ０ ． １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｉ 的柠檬酸 缓冲液 中 ， ｐ Ｈ ４ ． ５ 。 浓度 １ ％） ， Ｃ Ｏ Ｎ组仅注射等体 积的柠檬酸缓 冲液 。７ ２ ｈ后 ，
１ 材 料 与 方 法
射液冲洗后用 中性 甲醛水溶液固定 ， 常规脱水 、 包埋 ， 其余 肾 脏组 织液氮冻存 ， 分别进行苏木素一 伊红（ Ｈ Ｅ） 染色 ， Ｍ ａ ｓ ｓ ｏ ｎ 染
色 ：免疫组织化学检测 ：采用 Ａ Ｂ Ｃ法检测 肾脏 Ｔ Ｇ Ｆ ． ３ １ 以及
Ｅ 一 钙黏素表达变化 。采用 Ｉ ｍａ ｇ ｅ — Ｐ ｒ ｏ Ｐ ｌ ｕ ｓ ５ ． ０对图像中的阳性
反应 部位进行积分吸光度分析。 １ ． ５ 实 时荧 光定量 聚合 酶链反应 （ Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ） ： 留取大 鼠各标 本总 Ｒ Ｎ Ａ ｌ ｇ ， 合成 ｃ Ｄ Ｎ Ａ第一链 ， 行Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ。 Ｔ Ｇ Ｆ ． ｐ ． 反应 条件 为 ： ９ ５℃变性 ５ ０ ｓ ， ５ ７ ｏ Ｃ 退火 ５ ０ Ｓ ， ７ ２℃延伸 １ ｍ ｉ ｎ ， ３ ０
１ ． １ 实验材料 ： 健康雄性 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ 大鼠 ３ ０只 ， 购于山西医科 大
学动物实 验中心 ，平均体质量 ２ ０ ０ ｇ ，鼠龄 ８周 ；环孢 素 Ａ （ Ｃ ｓ Ａ ）购于华北制药 集团有 限公 司 ； Ｓ Ｔ Ｚ购于美 国 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公 司： 兔抗大 鼠 Ｓ ｍ ａ ｄ ２ ／ ３蛋 白一抗和兔抗 大 鼠Ⅳ型胶原 蛋 白一 抗（ 武汉博士德生物工程有 限公 司） ； Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 试剂 （ 上海 生工生
２ Ｂ Ｃ试剂盒 （ 北京博奥森 生物技术有限 公 司） ； ｃ Ｄ Ｎ Ａ逆转 录试剂 盒 （ Ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｓ 公司 ） ； Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ Ｉ 荧 光
定量 聚合酶链反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ ） 试剂盒 （ 美国 Ｒ ｏ ｃ ｈ ｅ 公司） ； 实 时荧 光定量 Ｐ Ｃ Ｒ所需引物 由上海生 合 成。 １ ． ２ 模 型建立 ：将 ３ ０只 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ 雄性大 鼠随机分为正常对照
比， 大 鼠体质量 增加 ， 尿蛋 白定量 （ ２ ４ ｈ ） 减少， 血肌酐 明显 降
低， 差异有统计学意义 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 见表 １ 。
２ ． ２ 肾脏 病 理 变 化 ： Ｃ Ｏ Ｎ组 肾 脏 结 构 正 常 ． 肾 小 球 未 见 硬
尾静脉取血 ， 检测 随机血糖 ≥１ ６ ． ７ ｍ ｍｏ ］ ／ Ｌ作为糖尿病 动物模
中国药物 与ｌ ｌ 笳 床２ ０ １ ４ 年６ 月第 １ ４ 卷第 ６ 期Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｒ ｅ ｍ ｅ ｄ ｉ ｅ ｓ ＆Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｓ ， 』 ｎ ｅ
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・７ ３ ９・
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基 础 研 究 ・
环孢 素 Ａ对 糖尿病 肾病大 鼠肾脏转化 生长因子一 Ｉ ３ 及Ｅ 一 钙黏 素表达的影响
张 巍 赵银娥 周 瑞君 弓晓 丽 任 小 军
糖尿病 是一种 常见 的由内分泌 系统代谢 障碍 引起 的慢
保存 肾脏组织 以备指标检测。
性终身疾病 。而糖 尿病 。 肾病是其最严重 的微血 管病 变之一 。
肾脏 纤 维 化 的 基 本 病 理 改 变 是 细 胞 外 基 质 （ Ｅ Ｃ Ｍ） 的 过 度 沉
１ ． ４ 肾脏组织病理学检查 ： ４ ｏ Ｃ ０ ． ９ ％氯化钠 注射液原位灌洗
后迅速摘除双侧肾脏 ， 去包膜 ， 切取部分肾脏 ， ０ ． ９ ％氯化钠 注
积， 进而取代 了肾脏 固有细胞 ， 破坏肾脏正 常结 构。转化生长 因子 （ Ｔ Ｇ Ｆ ） 一 Ｂ 是上皮细胞 一 问充质转分 化（ Ｅ Ｍ Ｔ ） 过程 主要 的 促进 因子和启动因子 …， Ｅ ． 钙黏素是 。 肾小管上皮 细胞 特有 的 标志物 ， 参 与了 Ｅ ＭＴ的主要过程 。本研究利用环孢素治疗 链 脲佐 菌素 （ Ｓ Ｔ Ｚ ） 诱 导 的糖 尿病 肾病 大 鼠， 观察环孢 素对糖 尿 病 肾病大 鼠肾组织 Ｔ Ｇ Ｆ — Ｂ 以及 Ｅ 一 钙黏素表 达 ，为免疫抑制 剂治疗糖尿病 肾病提供新的理论依据。