module相对定量ddct法和相对标准曲线法
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4.3
2(-ddCt)
1 3 20
需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差
通过Ct值相减: Ct目的基因 – Ct内对照.
26
为什么Ct值要相减而不是相除?
• Ct 值是指数值, 而不是线性值. • 因此, 我们不能直接用 Ct值相除. • 用相减来比较Ct值. (例如: 225 ÷ 220 = 25)
2 倍数变化 = -ΔΔCt
31
公式含义?
4-13
2
CT
2 = 循环间扩增产物量的倍数变化. (i.e. PCR扩增
产物量倍增)
ΔΔ CT = 样品和校正器之间校正过的循环数变化
所以，这个等式告诉我们校正器和处理样本循环 间扩增产物量的倍数变化
32
• 还记得开始时的 dCt 实验吗? • 拿出计算器!! 我们来算一下 dCT
Module 5 相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法
实时定量 PCR: 相对基因表达量
2
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量有 什么变化呢?
3
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量 有什么变化呢?
33
Sample
Time 0
c-myc Averag
e Ct
30.49
GAPDH Average
Ct
ΔCt c-myc GAPDH
23.63
6.86
ΔΔCt ΔCt treated ΔCt untreated
0.00
Fold difference in c-myc relative to untreated
公式: E = 10(-1/斜率) -1
17
ΔCt 验证试验
A
F
B
G
Ct
[Template]
18
A-F = ΔCt1
对应点相减
C
H
D
目的基因
I
E
J 内对照
Ct
19
对应点相减
A
F
B
G
C
A-F = ΔCt1 B-G = ΔCt2 C-H = ΔCt3 D-I = ΔCt4 E-J = ΔCt5
H
[Template]
ddCt
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差
25
ddCt 计算示例
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
-3.34
Normalizer
Ct
-4.21
Target
Qty (Log)
38
应该稀释什么样品来制作标准曲线?
• 任何数量充足，并表达目的基因和对照基因的 浓缩cDNA
• 只需知道稀释倍数, 不需要知道浓度 • 养成好的制作标准曲线的习惯
39
每个基因得到一条标准曲线
18s
Insulin
10,000 Untreated Ct Treated Ct
1 2-倍增长 3-倍增长
选择一个对照样本
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
ddCt
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
首先, 均一化对照样本本身 (对照样本 –对照样本 ).
6420.6 4171.4
1000
100
10
Ct
1
10,000
Treated Ct
1000
Untreated Ct
Ct
202.3 74.6
100 10 1
Relative Quantity
40
Relative Quantity
计算举例
Insulin
18s
Untreated Qavg. 74.6 Treated Qavg. 202.3
1.0
Time= 12 hr
Time = 24 hr
Time = 48 hr
27.03 26.25 32.83
22.66
4.37
-2.50
24.60 23.01
1.65 9.82
-5.21 2.96
5.6
37.01 0.1285 ???
计算出一个小数点! 用 1/x key 得到正确结果: 减少7.78 倍!!
27
接下来, 选择一个对照样本
• 所有其他样本都要和对照样本进行比较. • 对照样本要便于样本间的比较.
你不需要 . . .
Untreated: Treated 1: Treated 2:
.074 /.074 .148 /.074 .222 /.074
28
你需要 . . .
Untreated: Treated 1: Treated 2:
34
相对定量结果
x-fold Expression
50
t=0
40
37.01
t = 12 h
30
t = 24 h
20
5.6
10
1
0
-7.8
t = 48 h
Calibrator t=0
35
7500 软件的优势?
为你完成所有的计算!
36
相对标准曲线法的计算
37
6
当目的基因和对照的扩增效率不一致时使用
比较 Ct (ΔΔCt) 法
• 没有标准曲线 • 简单, 便宜, 较高通量 • 额外的验证步骤
相对标准曲线法
• 每个实验里的每个样品都 要跑一条标准曲线
• 工作量大, 费用大, 较低 通量
11
ddCt法的必要条件
两个基因 (目的基因和内对照) 必须有
相似的扩增效率!
12
ddCt法的步骤
可以通过 并列的跑两条扩增曲线， 看它们 是否平行来确定扩增效率.
斜率 ≥ 0.1
21
相对标准曲线法
ddCt 反应板设置
对未知样本的目的基因和内对照进行real-time 反应 (每个样本三个重复).
无模板对照 (NTCs) – 污染监测
22
ddCt法的计算方法
23
ddCt 计算示例
Untreated Treated 1 Treated 2
Cttarg. 26.1 23.8 22.8
D
I
目的基因
E
内对照
J
在Excel中制作图表
A-F = ΔCt1 B-G = ΔCt2 C-H = ΔCt3 D-I = ΔCt4 E-J = ΔCt5
20
ΔCt
ΔCt1 ΔCt2 ΔCt3 ΔCt4 ΔCt5
12345 稀释点
根据斜率选择一种定量方法
斜率 ≤ 0.1
比较 Ct (ΔΔCt )法
ΔRn
t=12 h
Ct=23 Ct=30 Cycles
ΔRn t=24 h
Ct=22 Ct=27 Cycles
ΔRn
t=48 h
Ct=24
Ct=26 Cycles
Ct=23 Ct=33 Cycles
内对照
9
目的基因
两种相对定量的方法
比较 Ct (ΔΔCt) 法
相对标准曲线法
样本间的倍数关系
10
两种方法的区别?
4
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量 有什么变化呢?
5
工作流程
4-14
校正器
time
t=0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
6
目的基因与内对照的比较
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
最终转化为倍数关系: 2-ddCt.
30
4-11
步骤 1:C内o对m照pa均ra一ti化ve样C本t差M异ethod
Ct 目的基因 – Ct 内对照 = ΔCt
步骤 2: 其他和样本校正器 比较
ΔCt 样本 – ΔCt 校正器 = ΔΔCt
步骤 3: 使用公式计算
45
6
Question?
46
接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 – 对 照样本).
29
ddCt 最终倍数计算
相对定量 (RQ)值
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
ddCt
Ctnorm. dCt
ddCt
16.7 9.4
0
16显.0示出两倍7的.8表达差-异1..6 17.7 5.1 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
重复样本Ct 平均值
24
ddCt 计算示例
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
再一次,软件的优势. . .
为你计算好所有的倍数关系.
42
不想每次试验都跑标准曲线？
• 另一个选择: 你可以非常精确的一次检测每个 基因的扩增效率…
43
不想每次试验都跑标准曲线？
• 在后续试验里执行一个 ddCt run.
44
6
不想每次试验都跑标准曲线？
• 分析时手动输入每个基因的扩增效率
●最终的相对定量计算就会把每个基因的扩增效率 考虑进去
13
检查指数增长期的曲线之间是否平行
内对照 目的基因
14
更多数学的方法 . . .
15
做两条标准曲线比较斜率
Ct 斜率 = -3.32
[cDNA]
16
斜率 = -3.38
目的基因 内对照
标准曲线可以帮我们判断扩增效率
• 例如, 斜率 -3.3 说明扩增效率接近 100%. • 更小的负值 (例如 -3.5)说明扩增效率小于100%.
÷ 6420.6 ÷ 4171.4
Normalized Q 0.0116 0.0484
选择一个对照: 例如, 未处理样本
Reference ÷ Reference: Treated ÷ Reference:
41
0.0116 ÷ 0.0116 = 1 0.0484 ÷ 0.0116 = 0.42
表达倍数差异
4-15
ΔRn
ΔCt = 24 – 14 = 10
Ct =14 Ct = 24
Cycles
内对照 目的基因
7
如果加入双倍的cDNA会怎样呢?
ΔRn
ΔCt = 23 – 13 = 10
Ct C=t 1=314
Ct = 24 Ct = 23
Cycles
内对照 目的基因
8
ΔRn t=0
比较 Ct 法
4-15
2(-ddCt)
1 3 20
需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差
通过Ct值相减: Ct目的基因 – Ct内对照.
26
为什么Ct值要相减而不是相除?
• Ct 值是指数值, 而不是线性值. • 因此, 我们不能直接用 Ct值相除. • 用相减来比较Ct值. (例如: 225 ÷ 220 = 25)
2 倍数变化 = -ΔΔCt
31
公式含义?
4-13
2
CT
2 = 循环间扩增产物量的倍数变化. (i.e. PCR扩增
产物量倍增)
ΔΔ CT = 样品和校正器之间校正过的循环数变化
所以，这个等式告诉我们校正器和处理样本循环 间扩增产物量的倍数变化
32
• 还记得开始时的 dCt 实验吗? • 拿出计算器!! 我们来算一下 dCT
Module 5 相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法
实时定量 PCR: 相对基因表达量
2
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量有 什么变化呢?
3
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量 有什么变化呢?
33
Sample
Time 0
c-myc Averag
e Ct
30.49
GAPDH Average
Ct
ΔCt c-myc GAPDH
23.63
6.86
ΔΔCt ΔCt treated ΔCt untreated
0.00
Fold difference in c-myc relative to untreated
公式: E = 10(-1/斜率) -1
17
ΔCt 验证试验
A
F
B
G
Ct
[Template]
18
A-F = ΔCt1
对应点相减
C
H
D
目的基因
I
E
J 内对照
Ct
19
对应点相减
A
F
B
G
C
A-F = ΔCt1 B-G = ΔCt2 C-H = ΔCt3 D-I = ΔCt4 E-J = ΔCt5
H
[Template]
ddCt
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
需要均一化数据从而去除样本间加样量不同带来的误差
25
ddCt 计算示例
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
-3.34
Normalizer
Ct
-4.21
Target
Qty (Log)
38
应该稀释什么样品来制作标准曲线?
• 任何数量充足，并表达目的基因和对照基因的 浓缩cDNA
• 只需知道稀释倍数, 不需要知道浓度 • 养成好的制作标准曲线的习惯
39
每个基因得到一条标准曲线
18s
Insulin
10,000 Untreated Ct Treated Ct
1 2-倍增长 3-倍增长
选择一个对照样本
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
ddCt
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
首先, 均一化对照样本本身 (对照样本 –对照样本 ).
6420.6 4171.4
1000
100
10
Ct
1
10,000
Treated Ct
1000
Untreated Ct
Ct
202.3 74.6
100 10 1
Relative Quantity
40
Relative Quantity
计算举例
Insulin
18s
Untreated Qavg. 74.6 Treated Qavg. 202.3
1.0
Time= 12 hr
Time = 24 hr
Time = 48 hr
27.03 26.25 32.83
22.66
4.37
-2.50
24.60 23.01
1.65 9.82
-5.21 2.96
5.6
37.01 0.1285 ???
计算出一个小数点! 用 1/x key 得到正确结果: 减少7.78 倍!!
27
接下来, 选择一个对照样本
• 所有其他样本都要和对照样本进行比较. • 对照样本要便于样本间的比较.
你不需要 . . .
Untreated: Treated 1: Treated 2:
.074 /.074 .148 /.074 .222 /.074
28
你需要 . . .
Untreated: Treated 1: Treated 2:
34
相对定量结果
x-fold Expression
50
t=0
40
37.01
t = 12 h
30
t = 24 h
20
5.6
10
1
0
-7.8
t = 48 h
Calibrator t=0
35
7500 软件的优势?
为你完成所有的计算!
36
相对标准曲线法的计算
37
6
当目的基因和对照的扩增效率不一致时使用
比较 Ct (ΔΔCt) 法
• 没有标准曲线 • 简单, 便宜, 较高通量 • 额外的验证步骤
相对标准曲线法
• 每个实验里的每个样品都 要跑一条标准曲线
• 工作量大, 费用大, 较低 通量
11
ddCt法的必要条件
两个基因 (目的基因和内对照) 必须有
相似的扩增效率!
12
ddCt法的步骤
可以通过 并列的跑两条扩增曲线， 看它们 是否平行来确定扩增效率.
斜率 ≥ 0.1
21
相对标准曲线法
ddCt 反应板设置
对未知样本的目的基因和内对照进行real-time 反应 (每个样本三个重复).
无模板对照 (NTCs) – 污染监测
22
ddCt法的计算方法
23
ddCt 计算示例
Untreated Treated 1 Treated 2
Cttarg. 26.1 23.8 22.8
D
I
目的基因
E
内对照
J
在Excel中制作图表
A-F = ΔCt1 B-G = ΔCt2 C-H = ΔCt3 D-I = ΔCt4 E-J = ΔCt5
20
ΔCt
ΔCt1 ΔCt2 ΔCt3 ΔCt4 ΔCt5
12345 稀释点
根据斜率选择一种定量方法
斜率 ≤ 0.1
比较 Ct (ΔΔCt )法
ΔRn
t=12 h
Ct=23 Ct=30 Cycles
ΔRn t=24 h
Ct=22 Ct=27 Cycles
ΔRn
t=48 h
Ct=24
Ct=26 Cycles
Ct=23 Ct=33 Cycles
内对照
9
目的基因
两种相对定量的方法
比较 Ct (ΔΔCt) 法
相对标准曲线法
样本间的倍数关系
10
两种方法的区别?
4
示例实验
未处理 样本
处理后 样本
目的基因: Plat1
问题: 处理我的样本后， Plat1基因的表达量 有什么变化呢?
5
工作流程
4-14
校正器
time
t=0
t=12
t=24
t=48
total RNA total RNA total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
6
目的基因与内对照的比较
0 -1.6 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
最终转化为倍数关系: 2-ddCt.
30
4-11
步骤 1:C内o对m照pa均ra一ti化ve样C本t差M异ethod
Ct 目的基因 – Ct 内对照 = ΔCt
步骤 2: 其他和样本校正器 比较
ΔCt 样本 – ΔCt 校正器 = ΔΔCt
步骤 3: 使用公式计算
45
6
Question?
46
接着, 所有样本和对照样本进行比较(未知样本 – 对 照样本).
29
ddCt 最终倍数计算
相对定量 (RQ)值
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
ddCt
Ctnorm. dCt
ddCt
16.7 9.4
0
16显.0示出两倍7的.8表达差-异1..6 17.7 5.1 -4.3
2(-ddCt)
1 3 20
重复样本Ct 平均值
24
ddCt 计算示例
Cttarg. Ctnorm. dCt Untreated 26.1 16.7 9.4 Treated 1 23.8 16.0 7.8 Treated 2 22.8 17.7 5.1
再一次,软件的优势. . .
为你计算好所有的倍数关系.
42
不想每次试验都跑标准曲线？
• 另一个选择: 你可以非常精确的一次检测每个 基因的扩增效率…
43
不想每次试验都跑标准曲线？
• 在后续试验里执行一个 ddCt run.
44
6
不想每次试验都跑标准曲线？
• 分析时手动输入每个基因的扩增效率
●最终的相对定量计算就会把每个基因的扩增效率 考虑进去
13
检查指数增长期的曲线之间是否平行
内对照 目的基因
14
更多数学的方法 . . .
15
做两条标准曲线比较斜率
Ct 斜率 = -3.32
[cDNA]
16
斜率 = -3.38
目的基因 内对照
标准曲线可以帮我们判断扩增效率
• 例如, 斜率 -3.3 说明扩增效率接近 100%. • 更小的负值 (例如 -3.5)说明扩增效率小于100%.
÷ 6420.6 ÷ 4171.4
Normalized Q 0.0116 0.0484
选择一个对照: 例如, 未处理样本
Reference ÷ Reference: Treated ÷ Reference:
41
0.0116 ÷ 0.0116 = 1 0.0484 ÷ 0.0116 = 0.42
表达倍数差异
4-15
ΔRn
ΔCt = 24 – 14 = 10
Ct =14 Ct = 24
Cycles
内对照 目的基因
7
如果加入双倍的cDNA会怎样呢?
ΔRn
ΔCt = 23 – 13 = 10
Ct C=t 1=314
Ct = 24 Ct = 23
Cycles
内对照 目的基因
8
ΔRn t=0
比较 Ct 法
4-15