超高效液相色谱法

• 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系 统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给 UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须 具有较高的采样速率，以在检测峰通过时 捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测 峰进行准确而可重现的识别（和积分）
• 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分 离效率不降低。检测器的光学部件也必须 具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。 从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC 检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3 倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于 UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪 的灵敏度至少提高3倍
• 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明 显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快 了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对 于任何给定的分离，都可通过调节这些变 量而达到速度和分辨率的最佳组合
该头发的直径约等于12个5 μm的颗粒，33个1.7 μm的颗粒。
• 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议 用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。 目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类 颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表 面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与 HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须 使用多孔型颗粒。
• 在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组” 的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在 短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离 度的高速度优点在里就能充分体现。多生化样品 及天然产物都十分复杂，
Waters UPLC 超高效液相色谱
超高效液相色谱仪 Nexera UHPLC LC-30A
• UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充 床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色 谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加 快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内 表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重 新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒 又能避免堵塞。
• 3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这 是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器 （使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限 制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒 大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗 粒是0.67 μm
• 使用小粒径的填料
• 通过这个方法将使快速分离成为可能。但 是，由于色谱柱里流动阻力的增加，仪器 各部件和色谱柱所承受的压力也将显著地 增加
• 高温分离
• 较高的温度可以加速物质的扩散，同时可 以减小色谱柱里的流动阻力，也使得快速 分离成为可能。
• 高温分析在降低柱压方面很有效，但是高 温引起色谱柱的劣化、导致样品分解等不 足在应用时需要引起注意。
PTC衍生氨基酸的UFLC分析
• 通量最大化：
•
1、 超高速/超高分离度分析
•
承受最大压力高达130MPa。
•
2、 超快速进样
• 。 通过重叠进行，使进样时间最短，每次进样仅需10秒
•
3、 样品容量最大化
•
Nexera换架器，可处理多达4600种样品；多路系统
• （MPX）。
•
• 性能最优化：
• •
1、 微量分析时，交叉污染最小化
• 测定发样中烟碱和可替宁的含量水平可以反映人 群较长期对烟草烟雾的暴露情况, 可以为流行病学 调查提供定量依据, 用于评价烟草烟雾对人体健康 的影响。
• 本文了UPLC法测定主动吸烟人群和被动吸烟人 群头发中的烟碱和可替宁试验
日本岛津超快速液相色谱仪 Prominenece UFLC
快速分析作为重要技术课题一直以来都在使 用，但伴随LCMS的迅速普及，提高性价比 成为迫在眉睫的问题，成为了加紧快速化的 重要因素。快速分析即缩短分析时间，通常 通过缩短色谱柱或提高流动相的流量来达到 目的
• 如果使用UPLCTM技术和2 μm以下的颗粒， 那么即使在较高的线速度下，效率也能得 以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使 用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏 度，从而使现在有可能充分利用色谱原理 进行分离。
• 峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能 分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能 指标得到提高后的色谱法被称为超高效液 相色谱法，或UPLC。图2说明了当颗粒大 小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量 对色谱分离性能的影响。
在进行高峰容量的色谱分析时， 降低分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度
• 除了化学、泵、进样器和检测器之外，还 需要对系统进行考虑。系统的体积至关重 要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分 离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大 大低于目前的HPLC系统.如：考虑连接管和 接头配件
UPLC技术能实现提高液 相色谱速度、分辨率 和灵敏度的承诺，为 每次分析提供更多的 信息；因此，该技术 将会得到实验室的广 泛认可。
•
以最小的接触面积通过进样针；可以使用多
种溶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ（最多4种）彻底清洗样品流路和进样针表
面。
•
• 2、 以最小的体积，精确并准确地进样
•
使用高分辨率计量泵直接进样；计量泵独立
于流路之外。
•
3、 在超快速条件下，保证良好的梯度重现
性
•
高分辨率梯度控制；MiRC混合器的有效混合
机制
•
4、 适用于UHPLC的均衡色谱柱加热
• 3.自动化 • 对于UPLC的进样系统，常规的手动进样阀和自
动进样阀都不能满足系统需求了。在UPLC中为 保护色谱柱不受极端高压力波动的影啊，进样过 程应当相对无压方波动，进样系统的死体积必须 足够小，以降低样品谱带的扩展。
• UPLC的自动化进样器的设计有了新突破：针内 针进样探头（XYZZ）为高速进样机械装里，可快 速进样。针内针的含义是使用液相色谱管路 （PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而“外 针”是一小段硬管，用来扎破样品瓶盖；压力辅 助进徉。为了降低进样时的交叉污染，采用一强、 一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两种洗针溶 剂需同时得到良好的脱气。
• 普通进样阀，不论是手动的还是自动的， 都不具有极端压力下的耐用功能。进样的 可重现性和线性的典型性能标准是分析应 用所需要的
• 为保护色谱柱免受极端压力波动的影响， 进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的 系统体积要小，以减小所检测样品可能的 区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以 最大速度、较大的样品通量进行工作
超高效液相色谱法（UPLC）相对于高效液相 色谱法（HPLC）的优势所在：
• 1.速度
• 超高效液相色谱法（UPLC）采用新型全多孔球 形1.7μm反相固定相，该固定相是应用“杂化颗 粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合 成的，并由此制备了高柱效的ACQUITY UPLC色 谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时 间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟， 并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超
• 为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果， 需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力 范围。在能达到最大效率的最佳流速下， 对于10 cm长装有1.7 μm颗粒的色谱柱，计 算得出的压力降是15,000 psi。因此，需要 一个能在该压力下传送溶剂的泵。
• 在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得 显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。 UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵 抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下 使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消 溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动， 以实现平稳而可重现的流体输送。
• JorgensenM. Lee博士最近都发表了关于色 谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们 的研究为分离科学描绘了一幅新图景。通 过使用比以前小得多颗粒，使分离过程达 到了一个新的终点。
• 范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高 度（柱效）关系的经验式。从图1可以看出， 一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术 就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而 且随着流速的提高不会使柱效降低。
• UFLC通过以下特性 支持快速分析：
• 小柱管和小体积的 流通池降低了柱外 峰展宽效应。
• 使用2.2μm颗粒大小 的色谱柱
自动进样器实现10秒钟10μl的超快速进样
支持高达85℃的高温分析。温度与快速分析：随着柱温升高， 理论塔板数增加，柱效增高，柱压降低。
• 温度对化合物的影响：高温分析在降低柱压方面很有效， 但是高温引起色谱柱的劣化、导致样品分解等不足在应用 时需要引起注意。高温分析只是作为快速分析的辅助手段 加以运用。
• 什么是高通量 快速液相色谱的目标就是高通量， 也就是说每天或每小时有更多的样品被分析。为 了实现高通量，不仅要缩短单个样品分析时间， 而且整个循环进样和分析时间也必须优化。追求 快速化的本意不仅是缩短分析时间，而且是缩短 分析周期。Prominence UFLC的样品注入速度为 10秒，使得分析周期得以大为缩短。
•
IHB控制的柱间温度分布最小化；通过微体积预热器
，有效预热。
扩展性最大化
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1、 可升级的UHPLC组件设计
•
通过组合常用的HPLC组件，可以自由地配置系统。
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2、 使用自动进样器，对样品进行自动前处理
•
可以进行柱前衍生、内标物添加以及样品稀释。
•
• 3、 高温分析
•
柱温最高达150℃；高温促使新技术的应用，比如绿
高柱效。
• 2.灵敏度
• 我们知道UPLC色谱柱中使用的是1.7μm固定相，分离获 得的色谱峰半蜂宽小于1s，这就对检测器的要求是极高的 。AQUITY UPLC使用采样速度达40点/s，池体积仅为 500nL（约为HPLC池体积的1/20）的新型光导纤维传导 得流通池，当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四 氟乙烯池壁的全析射特征，不损失光能最，而使检测灵敏 度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可变波长的紫外光或 二极管阵列系统。
色色谱法（Green LC）。
4、 高速LCMS分析
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与超快速LCMS、LCMS-2020相结合。
头发中烟碱和可替宁的超高效液相色谱测定
• 烟碱( nicotine)是烟草中的主要生物碱, 是导致吸 烟成瘾的物质动因, 也是评价人体摄入烟草烟雾的 常用指标。
• 可替宁是烟碱在体内的主要代谢产物, 是评价烟草 烟雾摄入量的生物标志物
• 此技术可保证可靠、重现的进样；在自动进样器 内，可安置96位或384位样品盘。每个位置可放 置2或4mL样品瓶。新型的样品组织器可接受21个 样品盘的编程。
• 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分 离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。
• 因此其在蛋白质、肽、代谢组学分析及其它一些 生化领域里将会得到广泛应用。另外，在天然产 物的分析方面，使用UPLC与质谱检测器连接， 会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展 是一个极的促进。
• 具备高采样频率的检测器，可以实现快速的数据获取而不 会丢失信息。
• 专门的色谱方法转换软件，使常规色谱条件转换为UFLC 条件简单易行，保证分析方法的通用性。
• 快速分析的重现性 在快速分离中要取得成分保留时间 的重现性要比常规分析中更加困难。保留时间的重现性 （RSD）和时间的平方根成反比增大，所以需要比常规分 析更为严格的送液性能。Prominence UFLC可以保证送液 分辨率 3nL/min的微冲程送液、梯度送液时控制响应为0.1 秒的卓越送液能力，可以发挥极为优越的保留时间重现性。