血浆游离 DNA 提取试剂盒（小量）说明书

宁波市重鼎生物技术有限公司
中国 宁波
血浆游离DNA 提取试剂盒（小量）使用说明书
使用前请仔细阅读！
临床意义：
人血浆存在游离的基因组DNA。

这些DNA 分子是在细胞凋亡或死亡后释放到外周血中的。

检测分析游离gDNA 有很重要的临床意义：许多疾病状态下，比如中风，心肌梗塞，糖尿病及许多恶性肿瘤患者血浆游离gDNA 会显著升高。

因此血浆游离gDNA 浓度可以作为疾病进展的一个临床指标。

对于恶性肿瘤患者血浆中游离gDNA 的检测分析更具有重要意义，因为这些gDNA 分子直接来自肿瘤细胞，对其进行基因分析可以获得肿瘤恶性程度的全部信息。

可以为肿瘤的诊断和治疗提供重要的依据。

由于在孕妇外周血中存在胎儿的游离gDNA，因此，血浆游离gDNA 分析还可以作为产前诊断的重要方法。

技术方法：
人血浆存在游离的基因组DNA 的检测要解决两个技术问题：gDNA 的提取纯化和定量测定。

由于血浆游离gDNA 浓度非常低，因此，需要很高的提取效率和稳定的得率才能应用于定量和相关检测。

在本试剂盒中血浆游离gDNA 提取采用硅胶吸附吸附柱法。

其原理是利用DNA 分子可以在离液盐的存在下与硅胶膜可逆吸附来提取纯化DNA。

由于血浆游离DNA 浓度很低，在ng/ml 水平，无法用紫外分光光度法检测。

血浆游离gDNA 测定已报道的方法有两种：荧光定量PCR 法和直接荧光定量法。

由于血浆游离gDNA 浓度的范围在0~几百纳克/毫升范围。

荧光定量PCR 对于大范围变化的基因检测如病毒等是一个很好的方法，但是对于如血浆游离gDNA 浓度这样在一到两个数量级变化的DNA 测定则精度不够。

已报道的数值互相矛盾，差距很大。

荧光定量法是通过测量DNA 与荧光染料结合后在紫外光激发下发射荧光来检测DNA。

本试剂盒采用目前最灵敏的荧光染料Picogreen。

在1-数千纳克范围线性良好，具有灵敏度高、线性范围大的优点。

一、 试剂盒组成
1、Buffer GL 2ml 3、吸附柱
50个 2、Buffer GK
15ml 4、说明书 1份
二、血浆游离DNA 提取
1、取新鲜抗凝血（EDTA 抗凝）800g 离心10分钟，分离血浆后将分离得到的血浆再1600g 离心10分钟小心吸取上层血浆备用。

取上述分离的血浆300μl 加入Buffer GL 30μl (可加入15μl 20mg/ml 蛋白酶K，裂解效果更佳)。

充分混匀，56℃加热10分钟。

2、 加 Buffer GK 300μl 。

充分混匀。

95℃加热10分钟。

然后置13000～15000rpm 离心10分钟，小心吸取上清液至另一洁净1.5ml 离心管（勿吸入沉淀）。

加入1/3体积的95%～100%乙醇。

（乙醇终浓度为25%）充分混匀。

3、 将溶液移入带有收集管的吸附柱。

13000~15000rpm 离心60秒。

小心拿出吸附柱（勿让吸附柱碰到溶液）。

弃去离心管中溶液。

再将吸附柱放回收集管。

4、 加500μl 70%乙醇（自备）于吸附柱，15000 rpm 离心60秒（DNA 吸附在吸附柱上）。

小心拿出吸附柱（切勿让吸附柱碰到溶液）。

弃去离心管中溶液。

再将吸附柱放回收集管。

5、 再加650μl 70%乙醇（自备）于吸附柱，15000 rpm 离心10秒（DNA 吸附在吸附柱上）。

小心拿出吸附柱（切勿让吸附柱碰到溶液。

）。

弃去离心管中溶液。

再将吸附柱放回收集管。

6、 再将吸附柱放回收集管。

13000～15000 rpm 离心2分钟。

7、 将吸附柱放入洁净1.5ml 离心管中。

加入50μl 纯水于吸附柱底部。

放置2～3分钟。

13000～15000rpm 离心60秒。

DNA 既被洗脱。

注意：血浆量可以增加，同时GL 和GK 用量按比例增加。