延胡索及其有效成分抗吗啡成瘾多巴胺系统作用机制研究和效果比较

延胡索及其有效成分抗吗啡成瘾多巴胺系统作用机制研究和效果比
较
为了观察延胡索和左旋延胡索乙素（Ltetrahydropalmatine，LTHP）对吗啡条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）大鼠学习记忆相关脑区海马（Hip）和纹状体（Str）内多巴胺递质含量，多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）和多巴胺D2受体（D2R）表达的影响。

对各组大鼠颈背部皮下注射生理盐水或吗啡后（吗啡起始剂量为10 mg·kg-1，逐日递增，至第10天为100 mg·kg-1），末次训练48 h进行CPP测试确认模型建立成功，立即处死生理盐水对照组和模型组大鼠，分别取海马、纹状体脑组织。

延胡索高、中、低剂量组大鼠则分别给予延胡索2，1，0.5 g·kg-1水提液（内含LTHP的量分别为0.274，0.137，0.069 mg），LTHP高、中、低剂量组分别给予LTHP 3.76，1.88，0.94 mg·kg-1灌胃治疗，生理盐水治疗组灌胃生理盐水，持续治疗6 d，再次CPP测试后处死，同前取材。

采用高效液相色谱法检测多巴胺递质含量；Western blot技术检测DAT 和D2R的表达。

结果显示，与生理盐水治疗组比较，延胡索和LTHP 高、中剂量组大鼠在白箱停留的时间显著减少（P＜0.01），同时海马和纹状体脑区内多巴胺递质含量明显降低（P＜0.01或P＜0.05），DAT表达上调（P＜0.01），D2R表达上调（P＜0.01）。

学习记忆相关脑区海马和纹状体是延胡索和LTHP治疗精神依赖的又一神经解剖学作用位点，其机制与下调其升高的DA递质含量以及上调DAT和D2R的表达有关；对吗啡CPP效应消退的药效作用，以及对学习记忆相关脑区海马、纹状体中DA递质含量、DAT和D2R的影响，含1倍量LTHP单体的延胡索中药相当于单独应用约14倍LTHP单体的效果。

标签：延胡索；左旋延胡索乙素；吗啡；多巴胺系统；纹状体；海马
阿片类毒品（鸦片、吗啡、海洛因等）吸食带来的重大经济损失，引发的诸多社会问题如犯罪、艾滋病传播等相当严重，已成为我国乃至世界范围内危害相当严重的社会问题和公共卫生问题。

从医学的角度看，药物成瘾是一种慢性复发性脑病，就目前对于阿片类成瘾的治疗，急性脱毒并无困难（可达100%），难点在于怎样有效遏制急性脱毒后的高复吸率。

阿片类成瘾者的强迫性用药症状和持续性药物渴求是导致复吸的最主要原因[1]。

阿片类物质通过激活脑内奖赏系统，产生的强烈欣快感效应是毒瘾形成、维持和复发以及强迫性觅药行为的基础[24]，本课题组前期研究发现延胡索及其单体可下调奖赏神经环路中多巴胺的含量及上调D2受体的表达。

成瘾药物导致的异常记忆亦是精神依赖复吸一个重要原因[5]，海马和纹状体是与学习记忆密切相关的脑结构，而多巴胺能系统既是启动阿片正性强化效应的关键系统[6]，又参与了纹状体等结构的学习记忆功能[7]。

因此，笔者推测延胡索及其单体可能通过调控海马和纹状体脑区的多巴胺能系统，加速大鼠吗啡条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）效应的消退。

本研究通过观察延胡索和LTHP对大鼠吗啡CPP效应消退作用，以及对海马和纹状体脑区多巴胺递质含量、DAT和D2R表达的影响，同时探讨二者抗吗啡精神依赖的药理作用机制，为中药戒毒提供新的实验依据。

1 材料
1.1 动物8周龄雄性SD大鼠（SpragueDawleyrats，SD），体重120～140 g，购于第三军医大学实验动物中心，许可证号SCXK（渝）20070005。

实验室室温24 ℃，通风良好，光照周期8：00—20：00。

1.2 试剂及药品盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂，批号TD20060028）；DAT一抗（美国Abcam公司）；D2受体一抗（美国MILLIPORE公司）；二抗（北京博奥森公司）；延胡索水提液的制备方法根据文献[8]，醋炙延胡索中药饮片（成都吉安康药业有限公司）制备后，分别稀释成含延胡索0.2，0.1，0.05 g·mL-1的溶液；LTHP（左旋延胡索乙素，又名罗通定）对照品（中国食品药品检定研究院，批号100452200301）；LTHP 实验品（广西中医药研究所），用蒸馏水及少量稀HCl分别配置成0.376，0.188，0.094 g·L-1 3种质量浓度的溶液。

1.3 仪器条件性位置偏爱箱根据文献[9]制作，箱体长×高×宽为600 mm×300 mm×300 mm，中间有可抽取的隔板间隔成为大小相同的2个箱，一箱为底部白色光滑，另一为底部黑色粗糙箱，抽取隔板时，实验大鼠可以自由穿梭其中；条件性位置偏爱视频跟踪计算机自动分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；高效液相色谱仪（美国Agilent 1100）；680型酶标仪（日本BIORad公司）。

2 方法
2.1 实验动物分组和吗啡CPP模型的建立将大鼠放置黑白箱中任其自由穿梭，15 min/次，1次/d，第3天分别记录大鼠在黑、白箱中停留的时间，剔除对黑或白箱有明显偏爱的大鼠，并确定黑箱为天然偏爱侧，选白箱为伴药箱。

将合格的198只大鼠按随机数字表法分为9组，每组22只，即生理盐水对照组（生理盐水组）、吗啡CPP组（模型组）、生理盐水治疗组（生理盐水治疗组）、延胡索2 g组、延胡索1 g组、延胡索0.5 g组、LTHP
3.76 mg组、LTHP 1.88 mg组、LTHP 0.94 mg组。

除生理盐水组外，其他各组大鼠吗啡剂量递增颈背部皮下注射，每天上午注射吗啡，起始剂量为10 mg·kg-1，逐日递增，至第10天为100 mg·kg-1，注射后20 min置白箱训练40 min，连续10 d；下午注射生理盐水，注射后20 min置黑箱同法训练。

生理盐水组除给予等量生理盐水代替吗啡外，其余方法皆同上。

各组大鼠在末次吗啡训练48 h后，进行CPP测试。

模型建立成功后，即刻处死生理盐水对照组和模型组大鼠，参照脑立体定位图谱[7]分别取其海马和纹状体脑组织，高效液相色谱法检测多巴胺递质含量；Western blot检测DAT和D2R的表达。

2.2 药物治疗吗啡CPP模型建立成功后，对模型各组大鼠给予药物灌胃治疗，延胡索高、中、低剂量组给予延胡索2，1，0.5 g·kg-1水提液，LTHP高、中、低剂量组给予LTHP 3.76，1.88，0.94 mg·kg-1溶液，灌胃体积均为10 mL·kg-1，生理盐水治疗组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续6 d。

并于第6天灌胃治疗后再次CPP测试各组大鼠在白箱的停留时间。

2.3 高效液相检测递质各组取10只大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，开颅取脑，取组织称重后置2 mL匀浆器中，加入300 μL含0.1 mol·L-1的HClO4和0.2 mmol·L-1的EDTA2Na的混合溶液，匀浆，4 ℃12 000 r·min-1离心10 min，
取50 μL上清液进样。

2.4 Western blot检测DAT和D2R 各组取12只大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，断头处死，开颅取脑，取组织称重，将收集的样品置 4 ℃预冷裂解缓冲液中匀浆，离心后取上清，取少量上清用BCA 蛋白试剂盒检测蛋白浓度后，上清与上样缓冲液混匀，然后用10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白质，每孔蛋白加样量为30 μg。

100 V电泳约2 h，100 mA转膜1.5 h，5%脱脂牛奶封闭1 h后一抗孵育4 ℃过夜（DAT，D2R和βactin一抗稀释比例分别为1∶1 000，1∶1 500，1∶1 500），次日，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h（二抗稀释比例为1∶2 000），再次TBST洗3次，每次5 min，显影、定影。

Genetools软件分析并测定光密度值。

2.5 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行实验数据分析。

实验数据用±s 表示。

组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t 检验。

以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果
3.1 吗啡训练前后及药物治疗后各组大鼠白箱停留时间训练后各组大鼠与训练前组内比较，以及与生理盐水对照组比较，模型、生理盐水治疗、延胡索2，1，0.5 g·kg-1与LTHP 3.76，1.88，0.94 mg·kg-1组大鼠在白箱中停留时间均明显延长（P＜0.01），表明CPP模型建立成功。

用不同浓度的延胡索与LTHP灌胃治疗后，与生理盐水治疗组比较，延胡素2，1 g·kg-1和LTHP 3.76，1.88 mg·kg-1组大鼠在白箱中停留时间减少（P＜0.01），结果见表1。

3.2 各组大鼠Hip和Str脑区内DA含量与生理盐水对照组比较，模型组、生理盐水治疗组、延胡索0.5 g·kg-1组、LTHP 0.94 mg·kg-1组Hip和Str内DA 含量明显增高（P＜0.01）；与生理盐水治疗组比较，延胡索2 g·kg-1组、1 g·kg-1组和LTHP 3.76 mg·kg-1组、1.88 mg·kg-1组的DA含量显著降低（P＜0.01），而模型与生理盐水治疗组相比较，差异无统计学意义，见表2。

3.3 各组大鼠Hip和Str中DAT的表达应用Quantity One软件分别对各组图片进行分析，与生理盐水对照组比较，模型组、生理盐水治疗组、延胡索0.5 g·kg-1组、LTHP 0.94 mg·kg-1组Hip和Str内DAT平均光密度值明显降低（P＜0.01）；与生理盐水治疗组比较，延胡索2，1 g·kg-1组和LTHP 3.76，1.88 mg·kg-1组的DAT的平均光密度值明显升高（P＜0.01）；而模型组与生理盐水治疗组比较，差异无统计学意义，见表3。

3.4 各组大鼠Hip和Str中D2R的表达应用Quantity One软件分别对各组图片进行分析，与生理盐水对照组比较，模型组、生理盐水治疗组、延胡索0.5 g·kg-1组、LTHP 0.94 mg·kg-1组Hip和Str内D2R平均光密度值明显降低（P＜0.01）；与生理盐水治疗组比较，延胡索2，1 g·kg-1组和LTHP 3.76，1.88 mg·kg-1组的D2R的平均光密度值明显升高（P＜0.01）；而模型组与生理盐水治疗组比较，差异无统计学意义，见表4。

4 讨论
本实验结果显示，在末次吗啡训练后48 h，模型组大鼠在白箱中的停留时间明显延长，说明其对吗啡已经产生了精神依赖，再经过不同浓度的延胡索和LTHP 治疗后，发现2 g·kg-1和1 g·kg-1延胡索组、3.76 mg·kg-1和1.88 mg·kg-1 LTHP 组大鼠在白箱中的停留时间明显减少，说明延胡索和LTHP均能加速吗啡CPP 效应的消退，其中LTHP与文献[30]报道结论一致。

同时，学习记忆相关脑区海马和纹状体内上调的DA递质含量，以及下调的DAT和D2R的表达均被逆转。

提示：第一，学习记忆相关脑区海马和纹状体是延胡索和LTHP治疗精神依赖的又一神经解剖学作用位点，其作用机制与下调其升高的DA递质含量、以及上调DAT和D2R的表达有关；第二，对吗啡CPP效应的消退作用、以及海马和纹状体内多巴胺系统的影响（包括DA递质、DAT和D2R），含1倍量LTHP单体的延胡索中药相当于单独应用约14倍LTHP单体的效果，而且，在对海马和纹状体多巴胺系统药理作用机制方面也具有很大的相似性。

大多数阿片类药物成瘾与多巴胺系统（包括多巴胺递质、多巴胺受体、多巴胺转运体）的改变关系密切。

既往研究发现阿片类等可抑制单胺类神经元对DA 递质的重吸收[10]，还可促进DA递质的释放，从而使突触间隙的DA递质增多，增强DA系统的功能，产生奖赏效应。

成瘾药物所引起的DA释放增高将导致D2R的敏感性降低或数量减少，这可提高成瘾者对药物的渴求程度[1112]。

在D2受体基因敲除小鼠中，吗啡、可卡因等的奖赏效应被抑制，但躯体戒断症状仍存在，表明D2受体是大多数成瘾药物产生奖赏效应所必需的[13]。

DAT位于中枢多巴胺能神经元末梢，其生理作用是将突触间隙内已发挥生理效应的DA重新摄回突触前膜及终止DA生理作用[14]。

长期使用成瘾药物则会使相关脑区DAT密度和功能降低[15]，阻碍DAT对突触间隙中DA重吸收，进而使得DA 浓度升高，促进DA在中脑边缘皮质奖赏通路中持续发挥作用。

海马是中枢神经系统中参与学习和记忆贮存的重要器官，是短期记忆保持以及转入长期记忆的关键部位；纹状体是皮层下的高级中枢，资料表明纹状体的功能除控制运动外，还与学习记忆功能有关[16]。

多巴胺系统不但与奖赏效应密切相关，也参与学习记忆过程[17]。

徐波等[18]在DA介导运动对学习记忆能力促进作用的研究中就发现，3月龄SD大鼠进行经8周游泳训练后能显著提高大鼠的学习记忆能力，同时其脑内纹状体、海马、前额叶皮层和伏隔核中DA的含量显著增加，提示游泳训练提高大鼠的学习和记忆能力可能与DA等神经递质的正相调控作用有关；而在慢性睡眠剥夺导致学习记忆能力下降的大鼠，海马的DA水平则降低[19]。

关于DA受体与学习记忆，国外已有报道[20]高剂量的多巴胺D2受体阻断剂舒必利可损害大鼠隐匿平台的空间航行能力，而对可视平台的学习和游泳速度没有影响。

目前，成瘾医学界普遍认为，阿片类精神依赖的实质是成瘾者对阿片类物质形成的一种顽固性的记忆（即成瘾记忆：该记忆指使用阿片类药物后患者对药物、用药环境、体验等产生的与成瘾有特殊联系的永久或半永久记忆，而对环境和药物刺激无关的记忆下降，从而导致成瘾者长期、甚至终生行为的异常[2122]），学习记忆在药物成瘾中居于重要的中间环节[23]。

因此，在阿片类成瘾时，除在脑的奖赏神经环路出现异常，记忆相关脑区也会呈现相应的改变，本实验显示海马和纹状体内DA递质增高、DAT和D2R蛋白表达下调，与文献[2425]报道的
结果相似。

研究已证实，延胡索中的多种成分对多巴胺系统具有调节作用，其中LTHP 具有DA受体阻滞剂[26]功能，当进入中枢后，可优先阻滞脑内DA受体最丰富的脑区，例如纹状体、伏隔核、前额叶大脑皮质的D2受体亚型[27]，逆转DA 神经元的损伤和对多巴胺受体的阻滞作用，可降低吗啡产生的欣快感，减轻吗啡的奖赏效应，从而导致CPP效应的消退。

而延胡索中的巴马汀成分具有降低酪氨酸羟化酶的合成[28]，从而抑制DA的合成以减轻吗啡奖赏效应的作用。

本实验发现，延胡索和LTHP在加速吗啡CPP效应消退的同时亦能逆转下调的DAT 的表达，因此，有理由认为DAT可能是其治疗吗啡成瘾的一个作用靶点，这是在延胡索及其有效成分戒毒研究中的首次发现。

本实验还发现延胡索与LTHP在治疗吗啡精神依赖的行为学和多巴胺能系统药理作用机制方面均有很大的相似性，但其量效关系差异较大，即含1倍量LTHP单体的延胡索中药相当于单独应用约14倍LTHP单体的效果，分析其因，可能是因为延胡索中药内存在LTHP 的同类物，可协同对抗吗啡的精神依赖，如延胡索乙素的右旋体DTHP虽然不是DA受体阻滞剂，但却具有协同LTHP阻滞D2R的作用[29]；脱氢紫堇碱和巴马汀亦具有阻断DA受体、对抗DA能神经系统功能增强的作用[30]。

所以，LTHP 和延胡索功效虽然类似，但由于LTHP缺乏成分间的协同效应，而延胡索的疗效较好可能是其有效成分相互影响共同作用的结果。

虽然已有研究发现某些中药或中药有效成分可以减轻阿片类物质的CPP效应，但迄今，针对学习记忆相关脑区通过多巴胺系统特别是DAT治疗阿片类精神依赖的中药或中药有效成分的研究却未见报道。

并且，现阶段在对延胡索化学成分的研究中，多追求单体化合物的作用，而中药防治疾病的物质基础是成分之间相互协调、相互影响、共同作用，以达到整体治疗功效[31]。

本实验发现学习记忆相关脑区海马和纹状体是延胡索和LTHP治疗吗啡精神依赖的又一神经解剖学作用位点，作用机制与对DA系统的调节有关，并首次揭示DAT可能是二者治疗吗啡成瘾的一个作用靶点，这更系统、更详实地研究了延胡索单味中药抗吗啡精神依赖的多巴胺系统药理作用机制，丰富了延胡索中药抗阿片类精神依赖的实验证据；同时，通过比较二者在记忆相关脑区对其多巴胺系统影响的相似性程度，又一次为延胡索中药的现代化研究补充了新的内容。

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