荧光定量PCR

C(t) value
Threshold line
18.12 +/- 0.04
C(t) value
Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
Ct值极具重现性
CT
• 基线代表背景信号，一般前3～15循环所产生的信号 被背景掩盖，这些循环的荧光信号可用基线信号表示。 • 一般选定基线信号标准偏差的10倍作为荧光信号的阈 值，荧光信号到达阈值时的循环数为CT值，该值和初 始DNA模板数目的对数成反比。
Cycle number
Ck
104
Log模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
Lg of DNA concentration
★
荧光标记原理
非特异性荧光标记：SYBR Green
只与双链DNA结合后发光
信号强度与双链DNA分子数 目成正比 便宜、灵敏、使用便捷 对DNA模板没有选择性，容 易产生假阳性结果，对模板 纯度、PCR引物的特异性要 求很高
解链后不能结合发光
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： 此如 也将 SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因
果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，
同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
SYBR Green I染料法——融解曲线
PCR扩增实际过程
PCR扩增的理论模式
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Xn=Xn-1· (1+E) = Xn-2· (1+E)2=…= X0· (1+E)n 其中E表示扩增效率，指一条单链变成一条双链DNA分子的几率，通常0≤E≤1。 如果将1+E看成整体作为扩增效率，则其值为1-2。Xn表示在n个周期后PCR 产物的分子数量，Xn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数， 扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.
Rn（荧光强度）
平台期
Lg－liner phase Threshold
PCR的数学知识
• PCR反应：
Xn=X0(1+E)n
• 方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+E)n)
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 E：扩增效率
整理方程式得:
log X0= (- log(1+E) )×n+ log Xn
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂 峰其他产物出现非特异 性荧光，因此定量不准 确
SYBR Green I染料法——优缺点
优 点
使用方便，不必设计复 杂 探针
缺
方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测
荧光定量PCR原理－－荧光阈值
前15个循环信号作为荧 光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是 3～15个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背 景值和阴性对照的荧光最 高值；进入指数期的最初 阶段 真正的信号:荧光信号 超过阈值
Baselin e Cycle（循环 数）
Final conc. 12.5 ul 2x SYBR Master Mix 1x 12.5 u NA F Primer optimized NA NA R Primer optimized NA NA Water NA NA cDNA 10-100 ng NA NA
25 ul
25 ul
PCR condition: 50℃, 2min 95 ℃, 10 min 95 ℃, 15 sec 40 cycles 60 ℃, 1min
lens
Threshold Baseline region No Template control
cap PCR vessel
thermal block sample
PCR cycle number
CT
Geometric Phase PCR Efficiency~1
CT: Threshold cycle The calculated fractional cycle number at which the fluorescence passes the fixed threshold
影响PCR扩增效率的因素: PCR定 量的困难?



引物/靶的杂交 反应试剂的相对量 样本在扩增仪中的位臵的不同 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在 PCR扩增模板的量 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低
PCR 和定量问题

log-phase analysis end-point analysis
将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0 = (- log(1+E) )*C(t)+ log Xc(t)
XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数
初始浓度的对数与循环数呈线性关系 C(t)=-1/log(1+E) * log X0 + log Xc(t)/ log(1+E) Slope= - log(1+E) ); E = 10-1/斜率 －1
Amplification plot features
Normalised reporter fluorescence (Rn)
0.90
0.80
0.70 0.60 0.50 0.40 0.30
Sample
Lower expression level
Threshold No Template control Baseline region
实时荧光定量PCR的实验设计 和数据处理
绝对定量与相对定量
定量分析

绝对定量通过标准品定量
绝对定量的标准样品种类： 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA PCR的产物

相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control）通常是β-actin（β-肌动 蛋白）、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境 因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量
0.20 0.10
0.00 0
5
10
15
CT
20
25
30
35
40
PCR cycle number
Geometric Phase
Y= N0 2n , CT 與起始濃度之對數值成反比
阈值与C(t)值
• 阈值(Xn)：荧光扩增曲线指数增长期设定一 个荧光强度标准（PCR扩增产物量的标准） • C(t)值(n)：荧光信号（扩增产物）到达阈 值时所经过的扩增循环次数
针法不需要）。
质粒标准品的制备
目的基因
基因组 DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因 目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品 使用
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
如何製備Real Time PCR的反應
TaqMan Chemistry
Final conc. 2x TaqMan Master Mix 1x F Primer 300 nM R Primer 300 nM Probe 200 nM Water cDNA 10-100 ng
SYBR Chem物特异性要求较高
具有价格优势
不能进行多重定量
灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
Taqman探针法——工作机理
探 针 热变性
引物
报告基团 R
淬灭基 团
引物和探针与模板退火 DNA聚合 酶 延伸反应
R
探针
R
R
Taqman探针法——优缺点
优 点
高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
= quantitative reverse transcription PCR
= real time RT-PCR
• 在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量
技术。
• 实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体
系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时 监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定 量分析的方法。
C(t)与初始模板含量
• 初始模板量越多，C(t)值越小
– C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
106
105
104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系
Sample
Ck 102
模板DNA量越多，荧光 达到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。
常规PCR理论过程
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
实时荧光定量PCR
(Quantitative Real-time PCR)
Quantitative real-time PCR = Real-time quantitative PCR = Real-time PCR = qPCR
RT-PCR
=
Reverse transcription PCR
qRT-PCR
实时荧光PCR绝对定量方法
• 标准品，标准曲线
– 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 – 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线
• 样品
– 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值
unknown 104 103
绝对定量分析几要素
一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的 基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反 应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探
高浓度/高效率 高浓度/低效率 低浓度/高效率

N
N n
:扩增分子的数 目 :扩增循环的次 数
n
定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别
定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定 性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。
Traditional PCR detection
Linear
y=x 2n
Log [DNA]
Plateau
Geometric
Cycle #
PCR Phases
y = x(1+e)n
常规vs实时
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定 量及定性分析 • 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时 检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化， 最终精确的对起始模板的定量分析
1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
拷贝数的计算：
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量 ×6.02×1014
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
MJ Research
“Real-Time PCR”
is “sequence detection” in a closed-tube
Normalised reporter fluorescence (Rn)
0.90 0.80 0.70
Sample
0.60
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0 5 10 15 20 25 30 35 40