河豚毒素研究及其免疫研究PPT课件

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参考文献
[1] 于丽华,周力,谢克勤.河豚毒素对小鼠镇痛作用的实验研究[J].山东医科大学学报, 1999, 37(2): 120. [2] 李中华,李春英,汪晨净.TTX局部应用对家兔齿髓刺激所引起的疼痛的影响[J].中国药理学会通讯, 2000,
17(2): 47. [3] 潘心富,黄致强.河豚药用研究概况[J].药学通报,1984, 19(4): 40. [4] 靳艳卿,段世明,王钧,等.侧脑室注射TTX和藜芦定对大鼠异氟醚MAC的影响[J].中华麻醉, 2000, 20(5):
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适应性进化
通过克隆调控豹纹东方骨骼肌 Na v 1.4 通道表达的 cDNA，发现 Nav1.4通道区域Ⅰ401位点处存在一个不饱和氨基 酸，即天冬酰胺。通过基因工程把不饱和氨基酸移植到对河豚 毒素敏感的小鼠骨骼肌 Na v 1.4 通道处，移植的不饱和氨 基酸的折叠程度越高，小鼠抵抗河豚毒素的能力越强。当不饱 和氨基酸的折叠程度大于取代位点氨基酸折叠程度的2500倍时 IC50(50%Na+通道发生阻断时河豚毒素的浓度)提高至47µmol/L。 河豚对河豚毒素具有免疫力是基因变异的结果，更是适者生存、 长期自然选择的结果。河豚对河豚毒素的适应性进化为河豚提 供了更大的生存空间，也为人类研制河豚毒素中毒后的解毒药 品提供了依据。
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适应性进化
在对河豚毒素没有免疫力的生物体内，钠通道的 α-亚 基上存在河豚毒素的受体，河豚毒素与 α-亚基门孔附近的氨 基酸残基结合，阻止钠离子进入细胞内，引起河豚毒素中毒。 而河豚体内细胞的构造与其他生物不同，河豚体内还存在可以 和河豚毒素结合的蛋白质，从而使河豚对体内的河豚毒素具有 免疫力。比较红鳍东方鲀、黑青斑东方鲀 和斑马鱼的基因序 列图谱，发现红鳍东方鲀和黑青斑东方鲀骨骼肌的 Nav1.4通 道发生了变异，正是这种变异使河豚具有抵抗河豚毒素的能力。 红鳍东方鲀和豹纹东方鲀的变异类似，都是在 Na v 1.4 通 道的 401 位点上发生了取代，取代为一个折叠程度更高的不 饱和氨基酸，河豚的这些氨基酸是不与河豚毒素结合的，从而 也就不能对河豚的钠通道造成影响。
雌性>雄性 冬春>夏秋 卵巢>脾脏>肝脏>血液>眼睛>鳃耙>皮肤>精巢
一般肌肉中不含有河鲀毒素，但河鲀死后内脏中的毒素可渗入肌 肉，此时鱼肉也含有少量毒素。河鲀毒素化学性质和热性质均很稳定， 盐腌或日晒等一般烹调手段均不能将其破坏，只有在高温加热30min以 上或在碱性条件下才能被分解。
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国内分离河豚毒素的方法主要有 活性炭吸附法 苦味酸盐法的氨解 树脂吸附洗脱法和滤膜过滤法
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分离提纯及检测方法
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河豚毒素的免疫研究
河豚毒素活性部位胍基可与细胞膜上的特异性受体结合，阻止钠离子进入细胞内，降 低兴奋在神经纤维上的传导速度，导致神经中枢和神经末梢麻痹，血压下降，因此河豚毒素 可作为止痛剂、麻醉剂和降压药等。但是在临床上使用河豚毒素剂量过大，会导致远端神经 损害，神经损害可累及神经根、植物神经和中枢神经。因此，为了避免河豚毒素在临床应用 中产生全身毒性反应，目前已研制出河豚毒素微胶囊，把它分散的移植到坐骨神经的细胞膜 下，既能起到局部麻醉的作用，又能降低对神经系统的毒性。研发
河豚毒素研究及其免疫研究
目录页
概述
•河豚及河豚毒素
2 提纯检测技术 4 •洗脱、吸附、过滤
参考文献
1 作用机理 3 免疫应用 5
适应性进化
1
PART 01
概述
河豚
河豚毒素
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河豚
puffer fishes 河豚介绍 PROFILE
河鲀，为硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称，俗称河豚。自古以来中 国食用的河豚皆生息于河中，因捕获出水时发出类似猪叫声 的唧唧声而得名河“豚”。另有“气泡鱼”、“吹肚鱼”、 “河豚鱼””、“气鼓鱼”、“乖鱼，鸡泡” 等称呼。古 时称“肺鱼”。 河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层， 有少数种类进入淡水江河中，当遇到外来危险时使整个身体 呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。常见 的有红鳍东方鲀、暗纹东方鲀（T.fasciatus）、黑鳃兔鲀、 凹鼻鲀、黑斑叉鼻鲀等
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分离提纯及检测方法
对河豚毒素的分离提取研究首先是晶化问题。 1909 年日本学者田园良纯用醋酸酸化后用铅盐沉淀法分离，再用醋 酸-乙醚重结晶。 1950年日学者横尾晃采用氧化铝柱层析，以水为洗脱剂洗脱，得到 河豚毒素的结晶 。 目前大多采用离子交换法、活性炭柱层析及凝胶柱层析、吸附树脂
等方法分离。国际上分离河豚毒素多采用层析法。把富含毒素的样品绞 碎，用醋酸浸提，浸提液经离心，合并上清液，加热除蛋白质，再减压 浓缩，萃取脂肪。之后经过冷冻干燥或再减压浓缩，浓缩液经多次层析 洗脱，即可得到纯度非常高的样品 。
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生物活性
TTX 是一种电压敏感的 Na+通道外口特异性阻滞剂，其 麻醉作用是普鲁卡因的 4 000 倍，可代替吗啡、杜冷丁起镇 痛作用，且不成瘾，并有解痉、降压、抗心律失常等作用。在 医学方面，TTX 通过阻断快速钠离子通道来治疗某些心律失常 具有潜在可能性。最新研究表明 TTX 是神经生理学、肌肉生 理学和钠离子通道药理学研究的非常有用的工具。已经证明 TTX可有效治疗某些疾病如癌症晚期造成的疼痛等。虽然 TTX 是重要的选择性钠离子通道抑制剂，然而最近的研究表明， TTX 也表现出对犬类心脏细胞L 型钙离子通道的阻断作用。
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河豚毒素的免疫研究
河豚毒素具有镇痛作用，用醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生 疼痛，表现为扭体反应，微量河豚毒素或者微量河豚毒素联合小剂量 的戊巴比妥钠注射到小鼠体内后，小鼠扭体频率降低 。河豚毒素对器 官的缺血性损伤具有保护作用，可明显降低脑梗死体积及神经功能缺 失症状 。河豚毒素对常规心律失常具有较好的拮抗作用，特别在抗室 颤方面效果显著 。但是以上实验均是在小鼠或兔子身上做的实验，还 没有应用到临床医学上。河豚毒素还可以用于戒毒，加拿大科学家已 经应用于临床，效果比较显著。另外，河豚毒素在治疗癌症、延缓衰 老和提高免疫力等方面也取得了显著的效果 。
305. [5] 杨文西.莨菪类抢救河豚中毒17例[J].中华预防医学杂志, 1990, 24(6): 385. [6] 耿兴斌. 654-2抢救河豚中毒成功3例报道[J].中国农村药学杂志, 1993, 21(5): 17. [7] 王海涛,徐志.应用莨菪类药物抢救河豚鱼中毒12例临床体会[J].中级医刊, 1995, 30(7): 21. [8] 张永贵,刘树威,张宇辉,等.河豚毒素(TTX)解毒药的研究[J].脑与神经疾病杂志, 1996, 4(2): 105. [9] 陈西贵,张玉兰.河豚毒素中毒对中枢神经系统的影响[J].国外医学卫生学分册, 1995, 22(2): 126. [10] 胡谦,施玉良.国产河豚毒素(TTX)单克隆抗体8A5有效地拮抗TTX对钠内流的抑制[J].生理学报,1995,
中毒症状
肠胃症状
恶心、呕吐、腹痛或腹泻
神经麻痹症状
口唇。舌尖、指端麻木→全身麻木，眼睑下唇，四肢无力，肌肉软瘫
呼吸、循环衰竭症状
呼吸困难、血压下降、瞳孔异常、言语障碍、昏迷→呼吸衰竭
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作用机理
研究表明，TTX 属小分子非蛋白类成分神经毒素，服用后首先 迅速由胃肠道吸收，然后进入血液中，迅速抑制中枢神经和末梢神 经系统，引发神经传导阻滞，造成神经麻痹，严重的会引发脑干神 经麻痹导致呼吸循环衰竭而死亡，具有潜伏期短、死亡率高的特点。 深入药理研究表明，TTX 也是一种电压敏感的钠通道外口特异性阻 滞剂，在较低浓度下就能通过与细胞膜上受体结合，再通过关闭机 制使钠离子通道h闸门关闭，即选择性抑制钠离子通过神经细胞膜而 允许钾离子、氯离子通过，具有高度专一性，使细胞膜失去可极化 状态，从而抑制甚至阻断了神经-肌肉的兴奋与传导过程，导致神经 肌肉活动障碍，严重者可发生麻痹状态并可引起呼吸中枢麻痹、血 压下降、脉搏迟缓，最终可能因呼吸停止和循环衰竭而死亡。
成功的河豚毒素微胶囊，可以使河豚毒素在临床上得到的广泛应用。河豚毒素与神经 变性有关。用河豚毒素处理神经胶质细胞，导致692个细胞基因表达发生异常。因此，河豚 毒素作为一种神经毒素，为研究基因的表达规律及神经衰退机制提供了一条新途径 。另外， 河豚毒素还可治疗与睡眠相关的疾病。在网状脑桥嘴核和蓝斑下核内微量注射河豚毒素，它 们的活性受到抑制，导致快速眼动睡眠时间和非快速眼动睡眠时间减少，证明河豚毒素能降 低脑桥区的活性，影响生物的睡眠-觉醒状态 ，因此河豚毒素可以用来调整睡眠时间以及提 高睡眠质量，为治疗失眠等顽疾提供了新思路。
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河豚毒素
氨基全氢喹唑啉型化合物 分子式：C11H17O8N3 分子量：319
性质
白色结晶，无味 微溶于水，不溶于有机酸剂 对酸作用稳定，没有确定熔点
LOGO河豚毒素毒性是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其毒性比氰化物 还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。毒素对肠道有局部刺激作用， 吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢。