氨基酸的分析分离 为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋

加洗脱剂 氨基酸样品 支持剂 层析柱
光 1.0
吸
收 值
0.5ห้องสมุดไป่ตู้
0.1
分部收集
20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）
（3）滤纸层析
滤纸层析也是分配层析的一种。这里的滤纸纤维素吸附水作为固定相，展层用 的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸 的不同位置上。
分溶曲线
相
对 浓
n=600
度
n=100 n=10
溶剂系统体积
分溶曲线与转移次数（理论板数）的依赖关系
(2)分配柱层析
层析柱中的填充剂或支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、 淀粉、硅胶等。支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相，沿固定相 流过的与它互不相溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。由填充剂构成的 柱床可以设想为由无数的连续的板层组成，每一板层起着微观的“分溶管”作 用。当用洗脱剂洗脱时，在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系 数进行连续不断的进行分配移动。分部收集层析柱下端的洗脱液，然后分别用 茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰 相当于某一种氨基酸。
SO3— H+或Na+
—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—
有氢型和钠型
—CH —CH2—CH2—CH— 苯环—SO3—
H+或Na+
树脂分阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂含有的酸性基团如— SO3H（强酸型）或—COOH（弱酸型）可解离出H+离子，当溶液中含有其它阳 离子时，例如酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而结合在树脂 上。同样地阴离子交换树脂含有的碱性基团如—N（CH3）3OH（强碱型）或— NH3OH（弱碱型）可解离出OH-，它能和溶液中的阴离子如碱型环境中的氨基 酸阴离子发生交换而结合在树脂上。
蛋白质性质鉴定
1 蛋白质分子量测定 DSD-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶排阻层析 电喷质谱 核磁共振
2 蛋白质等电点的测定 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 PBE-Sepharose聚焦层析
1概述 1.1什么是蛋白质性质鉴定 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确 定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质 组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基 本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化， 最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质 尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究 技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。
气相色谱需要气相色谱仪进行。
气相色谱具有微量快速的优点。
（7）高效液相色谱（high performance liquid chromatography，简称HPLC）： 这是近十几年来发展起来的一种快速、灵敏、高效的分离技术。
HPLC的特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系 统采用高压，因此洗脱速度增大。因此多种类型的柱层析都可用HPLC来代替， 例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤等。
溶剂 前沿
丁醇-醋酸
氨基酸 显色点
滤纸 原点
Y X
酚-甲酚-水
滤纸层析中的Rf值， Rf =X/Y
氨基酸的双向滤纸层析图谱
（4）薄层层析（thin-layer chromatography)：该层析分辨率高，需量极少， 层析速度快，可使用的支持剂种类多，如纤维素粉、硅胶、氧化铝等。其步骤大 体如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成为一个均匀的薄层，把要分析的样品滴 加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成 分分开，最后进行鉴定和定量分析。
2蛋白质鉴定方法 蛋白质可鉴定的参数很多，这里主要介绍蛋白质的分子量和等电
点两个主要参数。 2.1蛋白质分子量测定
早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。 由于这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行 测定，所以目前采用的不多了。
自从葡聚糖凝胶层析介质(Sephadex G系列产品)及排阻层析技术 问世以来，就被广泛应用于蛋白质的分子量测定。它是目前实验室 测定白质分子量常用技术之一。但是这种层析介质刚性较差，在层 析过程流速较慢，分离时间长。
解：根据分配系数公式可知：
p+q=1/4+3/4=1，即在静相中的分 数含量为1/4，在动相中的分数含量 3/4，则可由上述公式计算如下：
4！·1/4 ·（3/4)3 T4,4=—————————=27/64
3！
假若该物质的总量为96，则该管中的 含量应为：（27/64） ·96=40.5
怎么办？
上相为动相（A），
为了使氨基酸从树脂上洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，有效的方法 是逐步提高洗脱剂的PH和盐浓度（离子强度），这样各种氨基酸将以不同的速 度被洗脱下来。
（6）气相色谱
当层析系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，此层 析技术称为气-液色谱（gas-liquid chromatography）或简称为气相色谱。它是 利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同而达到 分离组分的目的。
c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成
的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋 白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子， 称之为蛋白质-SDS复合物( protein-SDS micelles)。由于蛋白质SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就 消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液 中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小 成正比。在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，移动的速 度与蛋白质本身带是什麽样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒 状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质 可以测定蛋白质的分子量。
氨基酸的分析分离
为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，都需要对 氨基酸混合物进行分析和分离工作。其方法较多，而目前使用较多的是层析法。
（1）分配层析的一般原理：所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相 （stationary phase），一个为流动相或动相（mobile phase）。混合物在两相中的 分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数（ partition or distribution coefficient）来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配
时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数
（Kd）。用下式表示：
CA Kd=———
CB
← 表示某一物质在动相中的浓度 ←表示某一物质在静相中的浓度
物质分配不仅可以在互不相溶的两种溶剂即液相-液相系统中进行，也可在固相液相或气相-液相间发生。其系统中的静相可以是固相、液相或固-液混合相（半液体 相）；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。
近年来又研究出刚性的耐压的凝胶层析介质，被用于高效液相 色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。
随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，DSD-PAGE电泳成了常 用的方法。从90年代初期随着毛细管电泳的出现，应用毛细管电泳 无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好的选择。
蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展， 给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其是采用电噴质谱测 定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广， 是一种快速精确的好方法。
盖子
薄层板（侧面）
薄层层析装置
层析缸 溶剂
（5）离子交换层析（ion-exchange column chromatography)
这是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱 性基团的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯 二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具 有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引 入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。
蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致分三大类电泳技术，层 析技术，光谱分析技术。
2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠-聚
丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。 主要用于蛋白质亚基分子量的测定。它具有操作简单， 重复性好，对样品的纯度要求不高等特点，是目前使用 较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。
Kd=q(动相)/(静相)p=1
即: p+q=1/2+1/2=1
转移n次后,在第k号管中某一物质的含量可由下式计算:
n！·pn-k+1 ·qk-1 Tn,k=——（—n-—k+—1）——！—·（—k—-1—）！
例题：当某一物质在一个层析系统中的 分配系数为3时，物质被转移4次后在 第四管中的含量是多少？
(1)原理： a.蛋白质分子状态 在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子， 在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一 定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。
b. 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂—-巯基乙醇
(- mercaptoethanol) 或 二 硫 苏 糖 醇 (Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚 体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一 的单链亚基。
在实际层析时，其层析行为一般并不直接决定于它的分配系数，而是取决于有
效分配系数Keffo：
某一物质在A相中的总量
Keffo=
————————————— 某一物质在B相中的总量
对液相-液相层析系统来说：
Keffo
=
—CA—·V—A CB·VB
=
Kd·RV
这里，CA和CB的意义同前；VA和VB分别为A相B相的体积；RV为A、B两相的体积 比。由此可见， Keffo 是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而 加以改变。
层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容
器中，用一种溶剂系统进行展层，层析后烘干滤纸，再将其旋转90度采用第二种 溶剂系统进行第二相展层。由于各种氨基酸在两个不同的溶剂系统中具有不同的 迁移率（ Rf ），因此它们就会彼此分开，当用茚三酮显色时，就会在滤纸上面出 现各种氨基酸的斑点。当然，若氨基酸种类较少或一相就能分开，进行一相层析 即可。
1.2蛋白质鉴定的主要参数 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在 普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下 几种。 (1)蛋白质的质量鉴定(分子量) (2)蛋白质带电性鉴定（等电点） (3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体结构、肽谱、N和C-末端) (4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学) (5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）
氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂的亲和力，主要决定于：它 们之间的静电引力；氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。在 PH为3左右的氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电引力的大小次序是碱性氨基酸 （R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型氨基酸（R0）。因此，氨基酸 的洗脱顺序大体上是酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸。但有时并不是这样， 这是因为某些氨基酸和树脂之间还存在着疏水作用。
利用层析法分离混合氨基酸，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有 差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。
若是逆流分溶或逆流分配，当转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的 分数含量是（p+q)n=1展开式的相应项的值。这里p和q分别为某一物质在静相和动 相中的分数含量，即p+q=1。例如物质Y的
下相为静相（B） 64
64
分配系数为1
32
48
32
16
16
16
12
16
16
4
8
16
8
3
8
16
8
1
逆流分溶原理
分配系数为3
36 12
18
27
6
9
30
管 中 物 质 20 的 总 量
10
Kd=1
Kd=3
结论：分配
系数大的物
质沿一系列
分溶管的移
动速度快与
分配系数小
的物质
2 4 6 8 10 12 14 16 管号