花臭蛙线粒体DNA 12S及16S rRNA序列的测定
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Ｄ ＮＡ提 取 试 剂 盒 提 取 花 臭蛙 肌 肉组 织基 因 组 Ｄ ＮＡ， 并利 用聚合 酶链 式反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ ） 技 术进行 扩 增得到 线粒体 上 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ
ｒ Ｒ ＮＡ 的保 守片段 ， 采 用琼脂糖凝胶 电泳技 术对扩增 产物进 行检 测， 最后 对 两段 基 因序 列进行 测定 并进一 步分析 ， 分 别得到
两栖动 物是从ห้องสมุดไป่ตู้水生 到 陆生 进化 上 的一个 关 键 环
类是脊椎动物进化从水生到陆生重大转变过程 中的 个过渡类群， 在 地 球 生命 进 化 研 究 中 占有 重要 地 位 。花 臭蛙 （ Ｒａ ｎ ａ ｓ ｃ ｈ ｍ ａ ｃ ｋ ｅ ｒ ｉ ） 隶属两 栖 纲 （ Ａｍｐ ｈ ｉ ｂ ｉ － ａ ） 、 无尾 目（ Ａ ｎ ｕ ｒ ａ ） 、 蛙科（ Ｒ ａ ｎ ｉ ｄ ａ ｅ ） ， 鼓膜大 ， 约为第三 指吸盘 的 ２倍＿ １ 叩； 上 眼睑 、 体 后背部 及后 肢背 面 均无 小白刺 ， 体侧无背侧褶 ； 指、 趾具吸盘， 纵径大于横径 ， 均有腹侧沟； 体背面为绿色 ， 间以棕褐色或褐黑色大 斑点 ， 多近 圆形并镶 以浅色边［ ９ － １ ０ ］ ； 分布于江 苏、 浙 江、 安徽 、 福建、 江 西 、河南 、 湖北、 湖南、 广东、 广西、 四川 、 贵州、 陕西 、 甘肃等地 ， 多见于较开阔的山溪及 附近潮 湿处 以及 常蹲 在有苔藓 的岩石上 ， 其生存 的海 拔范 围为 ２ ０ ０至 １ ５ ０ ０ 米， 是 中 国的特有 物种 Ｌ １ 。
王晶晶 ， 纪会 会 ， 焦 山
（ 合肥师范学 院 生命科学 系 ， 安徽 合肥 ２ ３ ０ ６ ０ １ ）
［ 摘
要］线粒体基 因是动物起 源进化 及群体遗传分析的理想研 究对 象， 其 中的 １ ２ Ｓ 和１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 这两个保 守序 列研 究
比较广泛 。本文 以花 臭蛙 （ Ｏ ｄ ｏ ｒ ｒ ａ ／ ￣ ２ ｓ ｃ ｈ ｍ ａ ｃ ｋ ｅ ｒ ｉ ） 为 实验材 料 ， 采 用 ＴＩ Ａ Ｎａ ｍｐ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ Ｄ ＮＡ Ｋｉ ｔ 血 液／ 细 胞／ 组 织 基 因组
一
在 具 有独 特 进 化 地位 的两栖 类 动 物 中 ， 对 系统 进化 上 的保 守性状 进 行 深 入 研 究 ， 将 有 助 于 花臭 蛙 的系统分 化 与 分 类 问题 提 供 依 据［ 】 卜¨ ］ 。本 实 验 是
通过测定花臭蛙线粒体 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基 因序 列， 再利用 Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ａ ｌ Ｘ软件分析与其他相关物种 （ 例 如： 黑斑 蚊 、 花臭蛙 、 天台蛙） 的同 源关 系 ， 为将 来 花 臭 蛙 的分 类 提供分 子 生物学 方 面 的证 据 。
节， 在系统进 化上具有 承前启后 的重要 作用 ｌ ＿ ｇ ］ 。两栖
动物线粒体 Ｄ Ｎ Ａ呈共价闭环双链结构， 在一级结 构上， 其进化速率为核 Ｄ Ｎ Ａ的５ ～１ ０ 倍， 绝大多数都 表现为母系遗传。其基因组结构相对稳定、 简单、 无组 织特异性 、 便于分析 ， 而且容易纯化得到， 使其成为研 究动物起源进化及 群体遗传分 析的理想 的研 究对 象［ 卜 。碱基序列分析虽然技术要求高 ， 花费 大 ， 但通 过测定线粒体 Ｄ Ｎ Ａ全序列或部分基因片段序列可以 了解碱 基的置换 、 缺失、 插入 等实 际情 况 ， 并 可 比较 不 同物种 或个体 碱基相关 序列 的差异 ， 从 而探讨进 化关 系， 因此 比其他分析方法具有很 大 的优点 ， 目前 已被应 用到分类进化领域研究 中［ ３ ］ 。 Ｍ． 和Ｓ ．Ｎａ ｓ ｓ 发 现 线 粒体 Ｄ ＮＡ（ ｍｔ Ｄ ＮＡ） 后， 又发 现线 粒体 Ｄ ＮＡ还 能合 成 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ 及 ２ ２种 ｔ Ｒ ＮＡ， 随着 分 子 系统 学 以及 Ｄ ＮＡ 分 子技 术 的发 展 ， 从 ＤＮＡ 水 平研 究 物 种 间亲 缘 关 系 以 及进 行 物 种 辅 助 鉴定 已经 逐 渐 成 为 一种 新 的手 段 ［ ３ ］ 。 已知 动物 线粒 体 Ｄ ＮＡ（ ｍｔ ＤＮＡ）具 有 分 子量 小 、 母 性遗 传 以及 比核基 因 ＤＮＡ 进 化 速度 快 等 特 点 ， 其 中的 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 片段 更是保 守 ， 所 以 Ｈｅ ｄ ｇ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｘ ｓ ｏ ｍ（ １ ９ ９ ３ ）和 Ｈａ ｙ ｅ ｔ ａ １ ．（ １ ９ ９ ５ ）便 提 出 了线粒体 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 基 因可 以用 于研究 两栖 动物 系统 发 育 ＿ ７ ］ ， 不 少 学 者 做 了 大量 的工 作 。现 已 被广 泛应 用 于种 内 和种 间系 统 发 育 研究 中 ， 尤其 在 蛙科 的 系统发 育方 面Ｉ ７ － ８ ３ 。
２ ０ １ ３ 年 ５ 月
合肥师范学院学报
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｈｅ ｆ ｅ ｉ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ｍａ ｖ ．２ ０ １ ３
第３ １ 卷第３ 期
Ｖｏ １ ． ３ １ Ｎｏ ． ３
花 臭蛙 线 粒 体 ＤＮＡ １ ２ Ｓ及 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 序 列 的测 定
３ ４ ７ ｂ ｐ和 ３ ８ Ｏ ｂ ｐ的 碱 基 序 列 。
［ 关键词］Ｐ ｃ Ｒ ； 花 臭蛙 ； １ ２ Ｓ 和１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ； 序列测定 ［ 中图分类 号］ Ｑ７ ５ １ ［ 文 献标 识码］Ａ ［ 文章编号］１ ６ ７ ４ — ２ ２ ７ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ３ ７ — ０ ４ １ 引 言
ｒ Ｒ ＮＡ 的保 守片段 ， 采 用琼脂糖凝胶 电泳技 术对扩增 产物进 行检 测， 最后 对 两段 基 因序 列进行 测定 并进一 步分析 ， 分 别得到
两栖动 物是从ห้องสมุดไป่ตู้水生 到 陆生 进化 上 的一个 关 键 环
类是脊椎动物进化从水生到陆生重大转变过程 中的 个过渡类群， 在 地 球 生命 进 化 研 究 中 占有 重要 地 位 。花 臭蛙 （ Ｒａ ｎ ａ ｓ ｃ ｈ ｍ ａ ｃ ｋ ｅ ｒ ｉ ） 隶属两 栖 纲 （ Ａｍｐ ｈ ｉ ｂ ｉ － ａ ） 、 无尾 目（ Ａ ｎ ｕ ｒ ａ ） 、 蛙科（ Ｒ ａ ｎ ｉ ｄ ａ ｅ ） ， 鼓膜大 ， 约为第三 指吸盘 的 ２倍＿ １ 叩； 上 眼睑 、 体 后背部 及后 肢背 面 均无 小白刺 ， 体侧无背侧褶 ； 指、 趾具吸盘， 纵径大于横径 ， 均有腹侧沟； 体背面为绿色 ， 间以棕褐色或褐黑色大 斑点 ， 多近 圆形并镶 以浅色边［ ９ － １ ０ ］ ； 分布于江 苏、 浙 江、 安徽 、 福建、 江 西 、河南 、 湖北、 湖南、 广东、 广西、 四川 、 贵州、 陕西 、 甘肃等地 ， 多见于较开阔的山溪及 附近潮 湿处 以及 常蹲 在有苔藓 的岩石上 ， 其生存 的海 拔范 围为 ２ ０ ０至 １ ５ ０ ０ 米， 是 中 国的特有 物种 Ｌ １ 。
王晶晶 ， 纪会 会 ， 焦 山
（ 合肥师范学 院 生命科学 系 ， 安徽 合肥 ２ ３ ０ ６ ０ １ ）
［ 摘
要］线粒体基 因是动物起 源进化 及群体遗传分析的理想研 究对 象， 其 中的 １ ２ Ｓ 和１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 这两个保 守序 列研 究
比较广泛 。本文 以花 臭蛙 （ Ｏ ｄ ｏ ｒ ｒ ａ ／ ￣ ２ ｓ ｃ ｈ ｍ ａ ｃ ｋ ｅ ｒ ｉ ） 为 实验材 料 ， 采 用 ＴＩ Ａ Ｎａ ｍｐ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ Ｄ ＮＡ Ｋｉ ｔ 血 液／ 细 胞／ 组 织 基 因组
一
在 具 有独 特 进 化 地位 的两栖 类 动 物 中 ， 对 系统 进化 上 的保 守性状 进 行 深 入 研 究 ， 将 有 助 于 花臭 蛙 的系统分 化 与 分 类 问题 提 供 依 据［ 】 卜¨ ］ 。本 实 验 是
通过测定花臭蛙线粒体 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基 因序 列， 再利用 Ｃ ｌ ｕ ｓ ｔ ａ ｌ Ｘ软件分析与其他相关物种 （ 例 如： 黑斑 蚊 、 花臭蛙 、 天台蛙） 的同 源关 系 ， 为将 来 花 臭 蛙 的分 类 提供分 子 生物学 方 面 的证 据 。
节， 在系统进 化上具有 承前启后 的重要 作用 ｌ ＿ ｇ ］ 。两栖
动物线粒体 Ｄ Ｎ Ａ呈共价闭环双链结构， 在一级结 构上， 其进化速率为核 Ｄ Ｎ Ａ的５ ～１ ０ 倍， 绝大多数都 表现为母系遗传。其基因组结构相对稳定、 简单、 无组 织特异性 、 便于分析 ， 而且容易纯化得到， 使其成为研 究动物起源进化及 群体遗传分 析的理想 的研 究对 象［ 卜 。碱基序列分析虽然技术要求高 ， 花费 大 ， 但通 过测定线粒体 Ｄ Ｎ Ａ全序列或部分基因片段序列可以 了解碱 基的置换 、 缺失、 插入 等实 际情 况 ， 并 可 比较 不 同物种 或个体 碱基相关 序列 的差异 ， 从 而探讨进 化关 系， 因此 比其他分析方法具有很 大 的优点 ， 目前 已被应 用到分类进化领域研究 中［ ３ ］ 。 Ｍ． 和Ｓ ．Ｎａ ｓ ｓ 发 现 线 粒体 Ｄ ＮＡ（ ｍｔ Ｄ ＮＡ） 后， 又发 现线 粒体 Ｄ ＮＡ还 能合 成 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ 及 ２ ２种 ｔ Ｒ ＮＡ， 随着 分 子 系统 学 以及 Ｄ ＮＡ 分 子技 术 的发 展 ， 从 ＤＮＡ 水 平研 究 物 种 间亲 缘 关 系 以 及进 行 物 种 辅 助 鉴定 已经 逐 渐 成 为 一种 新 的手 段 ［ ３ ］ 。 已知 动物 线粒 体 Ｄ ＮＡ（ ｍｔ ＤＮＡ）具 有 分 子量 小 、 母 性遗 传 以及 比核基 因 ＤＮＡ 进 化 速度 快 等 特 点 ， 其 中的 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 片段 更是保 守 ， 所 以 Ｈｅ ｄ ｇ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｘ ｓ ｏ ｍ（ １ ９ ９ ３ ）和 Ｈａ ｙ ｅ ｔ ａ １ ．（ １ ９ ９ ５ ）便 提 出 了线粒体 １ ２ Ｓ和 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 基 因可 以用 于研究 两栖 动物 系统 发 育 ＿ ７ ］ ， 不 少 学 者 做 了 大量 的工 作 。现 已 被广 泛应 用 于种 内 和种 间系 统 发 育 研究 中 ， 尤其 在 蛙科 的 系统发 育方 面Ｉ ７ － ８ ３ 。
２ ０ １ ３ 年 ５ 月
合肥师范学院学报
Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｈｅ ｆ ｅ ｉ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ｍａ ｖ ．２ ０ １ ３
第３ １ 卷第３ 期
Ｖｏ １ ． ３ １ Ｎｏ ． ３
花 臭蛙 线 粒 体 ＤＮＡ １ ２ Ｓ及 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮＡ 序 列 的测 定
３ ４ ７ ｂ ｐ和 ３ ８ Ｏ ｂ ｐ的 碱 基 序 列 。
［ 关键词］Ｐ ｃ Ｒ ； 花 臭蛙 ； １ ２ Ｓ 和１ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ； 序列测定 ［ 中图分类 号］ Ｑ７ ５ １ ［ 文 献标 识码］Ａ ［ 文章编号］１ ６ ７ ４ — ２ ２ ７ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ３ ７ — ０ ４ １ 引 言