OA对酒精性氧化损伤的保护作用及机制研究硕士学位论文（可编辑）

OA对酒精性氧化损伤的保护作用及机制研究硕士学位
论文
分类号密级公开国际十进分类号(UDC) 第四军医大学
硕士学位论文OA对酒精性氧化损伤的保护作用及机制研究刘江正培养类别学历研究生
申请学位类型学术学位
学科领域专业卫生毒理学
指导教师海春旭教授
指导教师单位军事预防医学院毒理教研室
二 O 一二年五月独独创创性性声声明明
秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我个
人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。

论文作者签名: 日期:保护知识产权声明
保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的
规定,即:研究生在校
攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。

本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。

学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采用影印, 缩印或其他复制手段保存论文。

学校有权允许论文被查阅和借阅,并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。

同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》,同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。

论文作者签名:导师签名: 日期:
OA对酒精性氧化损伤的保护作用及机制研究
研究生:刘江正
学科专业:卫生毒理学
所在单位:第四军医大学军事预防医学院
军事毒理学教研室
导师:海春旭教授资助基金项目:国家自然科学基金资助项目(№30872135)
关键词:酒精;齐墩果酸;氧化应激;抗氧化;Nrf-2;
中国人民解放军第四军医大学
二 O 一二年五月第四军医大学硕士学位论文
目录
缩略语表1?
中文摘要3?
ABSTRACT8?
前言 15?
文献回顾 17?
1 酒精滥用的危害及流行病学概述 17?
1.1 酒精滥用的公众危害. 17?
1.2 酒精滥用的流行病学概述17?
2 活性氧与氧化应激 18?
2.1 活性氧和氧化应激概述 18?
2.2 活性氧的生物学效应. 19?
2.3 抗氧化剂与体内抗氧化防御体系21?
2.3.1 抗氧化剂与自由基清除剂 21?
2.3.2 体内主要抗氧化酶和氧化损伤指标 22?
2.3.3 Nrf2是防御氧化应激的关键调控因子24?
2.3.4抗氧化剂网络和复合链式抗氧化剂. 26?
3 酒精诱导氧化应激过程及机制研究进展 27?
3.1 酒精在体内的代谢过程及诱导活性氧产生途径 27?
3.2 酒精诱导活性氧产生的氧化应激损伤 28?
3.3 酒精滥用对糖脂代谢的影响. 29?
4 线粒体损伤与酒精性氧化损伤. 30?
5 酒精滥用的药物治疗32?
6 齐墩果酸研究进展 32?
正文 35?
第一部分 OA 对酒精诱导肝细胞氧化损伤的保护作用及机制 35?
1 实验材料. 35?
1.1 主要化学及生物试剂. 35?
1.2 实验主要仪器. 36?
1.3 实验细胞 36
-1-第四军医大学硕士学位论文
2 实验方法. 37?
2.1 细胞系选择及细胞培养 37?
2.2 不同浓度 EtOH对 QZG细胞活力的影响. 37?
2.3 OA的体外抗氧化性研究. 37?
2.3.1 OA对 DPPH自由基的清除作用 37?
2.3.2 化学发光法测定 OA清除?OH的能力38?
2.3.3 化学发光法测定 OA清除 O2 ??的能力. 38?
2.4 OA对 EtOH所致细胞的氧化损伤的干预. 38?
2.5 氧化应激相关指标的测定方法 39?
2.5.1 MDA的测定39?
2.5.2 还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定 40?
2.5.3 氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测定 41?
2.5.4 总巯基(T-SH)含量测定 41?
2.5.5 SOD活力测定41?
2.6 免疫印迹法(Western-blot)测定蛋白的表达. 42?
2.6.1细胞蛋白的提取42?
2.6.2 蛋白质变性凝胶电泳42?
2.6.3 印记杂交. 42?
2.7 统计学处理43?
3 结果43?
3.1 酒精对 QZG细胞活力影响的量效和时效关系. 43?
3.2 不同浓度 OA对体外自由基发生模型的抑制作用44?
3.3 不同浓度 OA作用 24h对 QZG细胞活力的影响. 45?
3.4 OA对 QZG 细胞抗氧化相关蛋白表达的影响 46?
3.4.1 不同浓度 OA作用 24h 对 QZG细胞 Nrf-2蛋白的影响 46?
3.4.2 10 μM OA 作用不同时间对 QZG细胞抗氧化蛋白的影响. 46?
3.5 OA对 EtOH诱导的 QZG 细胞活力损伤的作用 46?
3.6 OA对 EtOH诱导的 QZG 细胞氧化损伤相关指标的影响47?
3.6.1 OA对 EtOH诱导 QZG细胞氧化损伤 SOD活力的影响 47?
3.6.2 OA对 EtOH诱导 QZG细胞氧化损伤谷胱甘肽系统的影响 48?
3.6.3 OA对 EtOH诱导 QZG细胞氧化损伤脂质过氧化物(MDA)的影响. 49?
3.6.4 OA对 EtOH诱导 QZG细胞氧化损伤总巯基的影响 50?
3.7 OA对 EtOH诱导的 QZG 细胞氧化损伤相关抗氧化蛋白表达的影响. 50?
4 讨论51?
4.1酒精干预对 QZG细胞增殖活性的影响51?
4.2 不同浓度 OA对体外自由基发生模型中的影响 52?
4.3 不同浓度 OA作用 24h对 QZG细胞活力的影响. 53?
4.4 OA对 QZG 细胞抗氧化酶等相关蛋白的影响 53?
4.5 OA对 EtOH诱导的 QZG 细胞氧化损伤的保护作用. 54
-2-第四军医大学硕士学位论文
第二部分 OA 对酒精诱导大鼠氧化损伤的保护作用及机制研究57?
1 实验材料. 57?
1.1 主要化学及生物试剂. 57?
1.2 实验主要仪器. 57?
1.3 实验细胞 57?
2 实验方法. 58?
2.1 实验分组及 OA处理方案58?
2.2 大鼠体重饮食测定58?
2.3 血糖测定 58?
2.4 腹主动脉取血并分离出血清. 58?
2.5 组织匀浆的制备 58?
2.6 H-E染色病理切片制作. 59?
2.7 胃粘膜组织损伤观察. 59?
2.8 蛋白含量测定. 60?
2.9 糖基化终末产物(AGEs)含量测定60?
2.10 血脂指标测定60?
2.10.1 血清胆固醇TCH测定. 60?
2.10.2高密度脂蛋白(H-LDL)测定. 60?
2.10.3低密度脂蛋白(L-LDL)测定. 61?
2.10.4 甘油三酯TG测定. 61?
2.11 氧化应激相关指标的测定 61?
2.11.1 CAT活性测定. 61?
2.11.2 SOD活力测定 61?
2.10.3谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)活性测定. 61?
2.11.4总抗氧化能力测定61?
2.11.5 MDA的测定 61?
2.11.6 还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定. 61?
2.11.7 氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测定61?
2.11.8 总巯基(T-SH)含量测定. 62?
2.12 肝线粒体相关指标测定. 62?
2.12.1 分离肝脏线粒体62?
2.12.2 线粒体活力的测定. 62?
2.12.3 线粒体肿胀度测定. 62?
2.12.4 线粒体氧化损伤指标测定. 62?
2.13免疫印迹法(Western-blot)测定蛋白的表达63?
2.14 RT-PCR检测肝组织 mRNA水平的表达. 63?
2.14.1 肝组织总 RNA 的提取 63?
2.14.2 其余步骤63?
2.15 免疫印迹法(Western-blot)测定蛋白的表达. 63?
2.15.1 蛋白提取及处理63
-3-第四军医大学硕士学位论文
2.16 统计学处理 64?
3 结果64?
3.1 体重变化 64?
3.2 空腹血糖变化. 65?
3.3 肝体比. 65?
3.4 血清转氨酶变化 66?
3.5 血清乳酸脱氢酶活力变化67?
3.6 血脂指标 67?
3.6.1 血清总胆固醇变化 67?
3.6.2 血清甘油三酯变化 68?
3.6.3 血清高密度脂蛋白变化. 68?
3.6.4 血清低密度脂蛋白变化. 69?
3.7 糖基化终末产物(AGEs)含量变化69?
3.8 肝脏线粒体指标测定. 70?
3.8.1 肝脏线粒体活力变化70?
3.8.2 肝脏细胞线粒体肿胀度变化 71?
3.8.3 肝脏细胞线粒体氧化损伤指标71?
3.9 血清氧化损伤指标变化 73?
3.9.1 血清超氧化物歧化酶活性变化73?
3.9.2 血清过氧化氢酶活性变化 73?
3.9.3 血清谷胱甘肽过氧化物酶活力变化 74?
3.9.4 血清总抗氧化力变化74?
3.9.5 血清脂质过氧化物产物 MDA变化 75?
3.9.6 血清谷胱甘肽变化 75?
3.9.7 血清总巯基含量变化77?
3.10 肝组织氧化损伤指标变化 77?
3.10.1 肝组织超氧化物歧化酶活性变化77?
3.10.2 肝组织过氧化氢酶活性变化. 78?
3.10.3 肝组织谷胱甘肽过氧化物酶活力变化 79? 3.10.4 肝组织总抗氧化力变化79?
3.10.5 肝组织脂质过氧化物产物 MDA含量变化80?
3.10.6 肝组织谷胱甘肽变化 80?
3.10.7 肝组织总巯基含量变化82?
3.11肝脏和肌肉组织抗氧化蛋白表达的变化82? 3.11.1肝脏组织抗氧化酶相关蛋白表达的变化 82?
3.11.2肌肉组织Nrf-2蛋白表达的变化 84?
3.12 肝脏Nrf-2基因表达的变化84?
3.13组织病理学改变84?
3.13.1胃形态学改变及组织病理学H-E染色. 84?
3.13.2 肝脏组织病理学 H-E 染色. 86
-4-第四军医大学硕士学位论文
4 讨论86?
4.1 体重、血糖和肝体比变化结果 87?
4.2 血清转氨酶和乳酸脱氢酶活力变化结果87?
4.3 血脂和 AGEs含量指标变化. 88?
4.4 肝脏线粒体指标测定. 89?
4.5 血清和肝脏氧化应激损伤指标测定. 89?
4.6 相关组织的抗氧化相关蛋白和基因的表达. 91?
4.7 组织病理学改变 92?
小结 93?
参考文献 95?
个人简历和研究成果102?
致谢. 103
-5-第四军医大学硕士学位论文缩略语表
缩略词英文全称中文全称
AGEs Advanced glycation end products 晚期糖基化终末产物
BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白
CAT Catalase 过氧化氢酶
DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜
DPPH 2,2 ′-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2 ′-二苯基-1-苦肼基ETOH Alcohol 乙醇
G-6-P Glucose-6-phosphate 葡萄糖-6-磷酸
G-6-PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GAPDH 磷酸甘油醛脱氢酶
Lyceraldehydes phosphate
Dehydrogenase
Gpx Glutathione peroxidase 谷胱甘肽过氧化物酶
GR Glutathione reductase 谷胱甘肽还原酶
GSH Glutathionereduced 还原型谷胱苷肽
GSSG Glutathioneoxidized 氧化型谷胱苷肽
H O Hydrogen peroxide 过氧化氢
2 2
HE Hematoxylin-eosin 苏木精-伊红
HO-1 Heme oxygenases 血红素加氧酶-1
-1-第四军医大学硕士学位论文
缩略词英文全称中文全称
LPO Lipid peroxidation 脂质过氧化
MDA Malondialdehyde 丙二醛
MTT Tetraozolium blue 噻唑蓝
NC Nitrocellulose 硝酸纤维素
Nrf2 Nuclear factor erythroid 2-related factor2 调控制造红血球核因子 2 相关因子 2
-
O Superoxide anion radical 超氧阴离子自由基
2
OA Oleanolic acid 齐墩果酸OH Hydroxyl radical 羟自由基
OPT o-phena ldehyde 邻苯二甲醛
PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液
ROS Reactive oxygen species 活性氧
SOD Superoxide dismutase 超氧化物歧化酶
TBA Thiobarbituric acid 硫代巴比妥酸
-2-第四军医大学硕士学位论文
OA对酒精性氧化损伤的保护作用及机制研究硕士研究生:刘江正
导师:海春旭教授
第四军医大学军事预防医学院军事毒理学教研室,西安 710032
中文摘要
【背景】
酒精性相关疾病是一类由酒精代谢诱导机体发生代谢紊乱性疾病。

酒
精滥用日益成为现代社会严重的公共卫生问题。

酒精对机体造成的损伤作用涉及多种病理机制。

随着研究的日益深入,酒精滥用引起氧化损伤作用得到广泛认同和重视,认为 ROS 介导的氧化应激损伤是酒精性相关疾病的昀主要致病因素。

研究进展表明,酒精性相关疾病的预防和治疗还缺乏相应的药物和手段,抗氧化剂被认为是预防和治疗酒精性相关疾病具有良好应用前景的药物。

齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)是一种来源于植物的天然三萜系化合
物,具有很多重要的生物药理活性。

富含 OA 中药如龙胆科植物青叶胆、木樨科植物女贞子、五加科植物?木等在中医应用上历史悠久,现已经作
为处方药主要用来肝炎类疾病的辅助治疗。

研究发现 OA 具有一定程度的抗氧化功能,但是 OA 由于化学结构原因,其生物利用度低,限制了在临
床上的应用。

由于在酒精中溶解度较好,因此,将 OA 溶解于酒精后可能-3-
第四军医大学硕士学位论文
减轻酒精大量摄入导致的氧化应激损伤。

阐明齐墩果酸的抗氧化保护作用相关机制,研发酒精类保健产品,对减轻酒精类相关疾病的发病过程以及
减少酒精滥用导致的卫生经济负担等都具有重要意义。

【目的】
1 研究 OA对酒精性氧化损伤的保护作用。

2 探讨 OA在酒精性氧化损伤中发挥保护作用的相关机制。

【方法】1细胞模型:通过建立酒精性肝细胞氧化损伤模型,评价 OA 在酒精性损伤模型中的抗氧化活性作用和保护效应。

观察了不同浓度不同时间 OA 作用 QZG 细胞对 Nrf-2 等相关抗氧化酶蛋白表达的影响。

还观察了 5、10、
15μM 的 OA干预对酒精诱导肝细胞增殖活性的影响,同时检测了细胞匀浆液内氧化应激相关指标,如 SOD 活性、MDA、GSH、GSSG 和 T-SH含量。

测定了 OA 干预后对 Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx 的蛋白表达的改变。

此外?
我们还观察了 OA 在体外 DPPH、O ?和 OH 三种自由基化学发光模型中的2
抑制作用。

2动物模型:通过 4g/kg/day 酒精灌胃大鼠 30 天诱导酒精性大鼠氧化
损伤模型,同时给以 10 mg/kg/day和 20 mg/kg/day 两种剂量的 OA 干预, 取血清、肝、肌肉、脂肪匀浆,提取肝脏线粒体,测定实验动物体重变化
和血糖改变,观察了肝体比的改变,转氨酶 ALT和 AST 活性和乳酸脱氢酶学指标,血脂指标和线粒体活性和肿胀度改变,血清等组织器官内糖基化
终末产物(AGEs)含量变化,同时还观察了血清、肝、脂肪和肌肉组织的
氧化应激相关指标,如 MDA、GSH、GSSG 和 T-SH 含量,CAT、SOD、
Gpx、T-AOC 活性。

提取肝脏总蛋白,测定了 Nrf-2、SOD-1、GR、HO-1
蛋白表达水平。

提取肌肉总蛋白,测定了 Nrf-2 蛋白表达水平。

同时提取肝-4-第四军医大学硕士学位论文
脏组织的总 RNA,测定了 Nrf-2 基因表达水平。

做肝脏和胃脏病理切片, H&E 染色。

系统观察了酒精性肝损伤模型中的氧化应激损伤反应性,以及
抗氧化酶链的变化,重点研究了 OA的抗氧化损伤的保护作用机制。

【结果】
成功构建了酒精干预 QZG 细胞的氧化损伤模型,同时结合文献报道,
确定了 200mM的 EtOH作用 6h作为创建 QZG细胞酒精性氧化损伤模型的?
处理方法。

同时验证了 OA 在体外 DPPH、O ?和 OH 三种化学发光模型中2
的抑制作用,结果表明 OA 直接清除自由基的能力不强。

OA 作用 QZG 细
胞 24h 浓度在 15.625 μM 以下时对细胞活力无显著影响,表明对细胞未产
生明显毒作用。

我们还发现 5、10、15μM OA 作用 24h 能显著提高 Nrf-2 蛋白表达,10μM OA 作用不同时间能显著诱导 Nrf-2、HO-1、CAT、PRX-1 蛋白表达,在 24h 内表达量随时间延长而增加。

15μMOA 作用能显著抑制EtOH 诱导的 QZG 细胞增殖活力损伤,统计学上有差异(P0.05)。

OA 对
EtOH诱导的 QZG细胞氧化损伤相关指标的影响结果表明结果表明 200mM EtOH 作用 6h 能诱发显著的活性氧介导的氧化应激损伤反应,表现为 SOD
活性明显降低、MDA 含量升高,GSH 含量降低、GSH/GSSH 比值降低。

给予不同剂量 OA保护性干预后,细胞氧化应激水平明显降低,表现为 MDA 水平降低,抗氧化酶活性增强,GSH 含量增高,同时 GSH/GSSG 比值也显
著升高。

蛋白表达水平实验结果表明,5、10、15μMOA 干预后,能明显升高 Nrf-2、SOD1、HO-1、Gpx 的蛋白表达水平,与阳性对照组相比均有统计学意义。

在酒精诱导氧化损伤的动物模型中,酒精灌胃后导致动物体重减轻明
显,OA给药对酒精导致的大鼠体重降低无明显的改善作用,各组动物血糖无明显变化,但 OA 干预后显著改善了阳性对照组肝体比的增加,减轻了
肝脏的脂肪变病理改变。

给予 10mg/kg/day和 20mg/kg/day的 OA后,血清-5-第四军医大学硕士学位论文
ALT和 AST活力值显著降低,表明 OA给药后能显著保护酒精导致的肝功能受损。

两种剂量的 OA 后明显地改善了总胆固醇和低密度脂蛋白水平的增高趋势,低剂量 OA 显著降低了甘油三酯的水平, OA 显著降低了高密
度脂蛋白的水平,机制待阐明。

OA给药后除对脂肪组织 AGEs 有一定程度的抑制作用外,其余如血清、肝脏和肌肉组织未发现明显地改变。

OA有助于维持线粒体谷胱甘肽氧化还原平衡,明显改善了酒精诱导的线粒体的活力值减少,并减轻了线粒体的肿胀程度。

在血清和肝脏匀浆测定氧化应激损伤指标结果表明,酒精作用可以导致血清和肝脏 SOD和 CAT活性下降, OA 可提高以上两种抗氧化酶活性。

阳性对照组的血清 Gpx 活性与阴性对照组相比无显著变化,OA 后也未能改变其活性,阳性对照组肝匀浆 Gpx
活性无显著变化,但给予 OA 后,Gpx 活性反而明显降低。

阳性对照组血
清 T-AOC 值上升,给药后该趋势减轻,肝脏内 T-AOC 的变化趋势同血清
结果相反,OA干预后肝脏总抗氧化力水平明显增高。

阳性对照组的血清和肝匀浆 GSH 含量降低、GSSG 含量增加,在 OA 干预下,GSH 显著增高,
GSH/GSSG比值显著增高,这表明 OA能通过恢复 GSH系统发挥保护作用。

T-SH 结果表明酒 OA 后能显著保护酒精对巯基的耗竭作用。

血清中 MDA 含量阳性对照组与阴性对照组相比无显著改变, OA干预后 MDA含量降低。

肝匀浆 MDA含量阳性对照组明显增高,OA 干预后明显降低。

阳性对照组肝脏 Nrf-2、HO-1、GR、SOD-1 等抗氧化蛋白表达显著下调,肌肉 Nrf-2 也显著下调,OA 干预后显著上调了上述蛋白的表达,同时还上调了肝脏
Nrf-2 的基因表达。

组织病理学结果表明,OA 给药都显著减轻了酒精诱导的胃脏和肝脏组织病理损伤。

【结论】
成功构建了酒精损伤性 QZG 细胞模型和动物模型,系统研究了酒精
性氧化损伤机制,发现氧化应激在酒精性氧化损伤的细胞和动物模型中占-6-第四军医大学硕士学位论文
有突出重要的地位,主要表现为自由基诱导的氧化损伤代谢产物增加,以
Nrf2 为核心的抗氧化酶链表达、活性异常,抗氧化防御系统功能降低;肝脏慢性氧化损伤与脂代谢异常具有密切相关性;利用体外抗氧化剂筛选技术模型,测定了具有保肝作用的单体化学药物 OA 的抗氧化反应能力,显
示 OA 体外直接抗氧化作用相对较弱,可能与其明显的脂溶解性有关;但
是,给酒精性肝损伤细胞和动物模型施加不同剂量的 OA,则表现为明显的抗氧化作用;进一步研究表明,OA 具有活化 Nrf2 为核心的抗氧化酶链作
用,进而启动机体整体的抗氧化防御系统功能,有效抑制酒精引起的肝脏
氧化应激损伤,可能是保护肝脏防止损伤的重要机制之一。

本研究结果提示:OA 直接清除自由基的作用较弱,但在酒精诱导的
氧化损伤的体外细胞模型和体内动物模型中都发挥了良好的抗氧化保护作用。

OA可能通过诱导 Nrf-2 相关抗氧化酶表达,保护谷胱甘肽氧化还原平衡,提高机体抗氧化酶活性,保护线粒体功能,减轻脂代谢紊乱发挥其抗
氧化作用。

本研究结果充分说明 OA 在酒精性肝损伤相关疾病中具有显著的研究、开发、应用前景。

本研究为更深一步研究 OA 在酒精性相关疾病中的预防和治疗作用提供了一定的研究基础,为其进一步开发利用提供了
有效的实验依据。

【关键词】酒精;齐墩果酸;氧化应激;抗氧化;Nrf-2;
-7-第四军医大学硕士学位论文
The protective effect of OA on oxidative injury
induced by alcohol and the study of mechanism
Candidate for master: Liu Jiangzheng
Supervisor: Hai Chunxu
Department of Toxicology, the Faculty of Preventive Medicine,
The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, ChinaAbstract Background:
Alcohol-related disease is metabolic disorders induced by alcohol metabolism. Alcohol abuse is increasingly becoming a serious public health
problem in modern society. The role of alcohol on the health involves a variety
of pathological mechanisms. With the deepening research, the role of oxidative
damage caused by alcohol abuse is widely recognized and valued, that the
ROS-mediated oxidative stress injury is the most important risk factors for
alcohol-related diseases. Research progress indicates that the preventment and
treatment for alcohol-related diseases is lack of appropriate drugs and meansAntioxidant is considered to be have a good prospect in prevention of
alcohol-related diseasesOleanolic acid OA is natural triterpenoids derived from the plants, which
has important biological and pharmacological activity. Many traditional Chinese
medicine plants are rich in OA, such as the Gentianaceae plants mileensis,
-8-第四军医大学硕士学位论文
Melilot plants, Ligustrum, Araliaceae Aralia. Chinese medicine applications
have a long history, now OA as a prescription drug is used to treat hepatitis-like
illness of adjuvant therapy. Recent study found that OA has a degree of
antioxidant function, but due to its chemical structure, its bioavailability is low,
so limit its clinical application. Because OA has good solubility in alcohol, OA
dissolved in alcohol may reduce oxidative stress injury induced by the alcohol
abuse. It’s important to understand its anti-oxidation mechanism in the
protective effect. It will help to develop alcoholic health products to reduce the
incidence of alcohol related disease process and to reduce the health economic
burden of alcohol abuseObjective:
1 Research about the protective effect of OA on alcoholic oxidative injury
2 Research about the mechanism of the protective effect of OA on alcoholic
oxidative injuryMethods:
1 Cell model: through the establishment of alcoholic liver cells from
oxidative injury model to evaluate the role of antioxidant activity and protective
effect of OA in alcohol injury model. We observe the effects of different
concentrations OA at different times on QZG cells about Nrf-2, antioxidant
enzyme protein expression. Also observed a 5, 10, 15 μM of OA intervention for
alcohol-induced liver cell proliferative activity of simultaneous detection of cell
homogenate oxidative stress indicators, such as the activity of SOD, MDA, and
GSH, GSSG ,also T-SH content. Protein expression of Nrf-2, the SOD-1 HO-1,
Gpx changes measured after OA intervention. In addition, we also observed the
2
inhibition of OA in vitro in the DPPH, O -, and ?OH radical chemistry -9-第四军医大学硕士学位论文
luminescence model2 Animal models: through 4g/kg/day ethanol feeding rats 30 days induced
oxidative damage in rats to induce the model of alcoholic, at the same
time to
give two doses of OA intervention , 10 mg/kg/day and 10 mg/kg/day, then take
the serum, liver, muscle, fat homogenate extract of liver mitochondria,
determination of the experimental animal body weight and blood glucose
change, observed changes in liver body weight ratio, transaminases ALT and
AST and lactate dehydrogenase, markers, serum lipids and mitochondria the
content of the activity and the swelling degree of change in serum, and other
organizations within the organ homogenates of advanced glycation end products
AGEs. We also observed oxidative stress related indicators in serum, liver, fat
and muscle tissue, such as MDA and GSH, GSSG using and the T-SH content of
CAT, the activities of SOD, Gpx, the T-AOC activity. Extraction of liver total
protein, determined by Nrf-2, SOD-1, GR, HO-1 protein expression
levelsNrf-2 protein expression levels were determined in total muscle protein. Nrf-2
gene expression levels were determined in liver tissue. We also make slices of
the liver and stomach for H-E staining. The systematic observation of the
reaction of oxidative stress injury, as well as antioxidant enzyme chain changes
in alcoholic liver injury model are done, focusing on the protective mechanism
of oxidative damage of OAResults:Successfully constructed and the model of the alcohol intervention in QZG
cell oxidative damage, combined with the literature, the 200mM EtOH role 6h
as to create QZG cells alcoholic oxidative damage model approach. To verify
the inhibitory effect of OA in vitro three chemical luminescence model such as
DPPH, Oand OH , the results show that OA has low ability in directly 2-10-第四军医大学硕士学位论文
scavenging free radical. OA affects QZG cells activity for 24h, the results
indicate that below 15.625 μM OA has no significant effect on cell viability,
indicating that OA under the concentration did not produce significant
cytotoxicity. We also found that 5, 10, 15 μM OA intervention for 24h
significantly improve the Nrf-2 protein express, the 10 μM OA intervention for
different time can be significantly induced Nrf-2, HO-1, CAT,, PRX-1 protein
expression levels up regulation within 24h. 15 μM OA can significant inhibit
EtOH-induced QZG proliferative activity injury. Oxidative damage-related
indicators of the EtOH-induced QZG cells results show that 200mM of EtOH
for 6h can induce significant oxidative stress, manifested as significantly lower
SOD activity, MDA content increased content of GSH reduce GSH / GSSH in
ratio decreased. Giveing different doses of OA protective intervention, the
cellular oxidative stress level was significantly lower performance levels of
MDA, and decrease antioxidant enzyme activity, GSH content increased, while
the GSH/GSSG ratio was also significantly elevated. Protein expression level of
experimental results show that after 5、10、15μMOA intervention significantly
increased Nrf-2, the SOD-1 HO-1, Gpx protein expression levelsAnimal weight loss significantly after the administration of alcohol in alcohol-induced oxidative damage in animal models, no significant improvement OA administration of alcohol led to weight loss in rats, the animals
in each group glucose no significant change, but the OA after the intervention
significantly improve the positive control group liver ratio increased, reducing
the pathological changes of liver steatosis. Giving 10mg/kg/day and 20mg/kg/day of OA, the value of serum ALT and AST activities were significantly reduced, show that OA administration significantly impaired liver
function caused by protection of alcohol. After two doses of OA
significantly
-11-第四军医大学硕士学位论文
improved total cholesterol and LDL levels increased trend of low doses of OA
also significantly reduced triglyceride levels, OA also significantly reduced the
level of high density lipoprotein, the mechanisms to be elucidatedOA administration in addition to adipose tissue AGEs have a certain degree of
inhibition outside, the rest such as serum, liver and muscle tissue found no
significant change. OA helps to maintain mitochondrial glutathione redox
balance, and significant improvements in alcohol-induced mitochondrial activity
decreases, and reduce the degree of swelling of mitochondria. Determination of
oxidative stress injury indicators show that the influence of alcohol can lead to
decreased serum and liver SOD and CAT activities, OA can improve the above
two kinds of antioxidant enzyme activity in serum and liver homogenate.
activity and the negative of the positive control group serum control group
showed no significant changes of OA also failed to change its activity, liver
homogenates Gpx activity of the positive control group no significant change,
but to give OA, Gpx activity but significantly reduced. The positive control
group, serum T-AOC value increased after administration of the trend to reduce
the trend of T-AOC in the liver and serum results contrary, OA after the
intervention of liver total antioxidant levels were significantly increased. Reduce
the positive control group, serum and liver homogenate GSH content, GSSG
using content increased in OA intervention, GSH significantly higher ratio of
GSH/GSSG Ratio in significantly higher, suggesting that OA by restoring the
GSH system play a protective role. The results indicate that the OA
significantly protect the alcohol thiol depletion. The positive
control group and
negative for the content of MDA in the serum control group sh。