肾小管上皮细胞坏死性凋亡和炎症因子表达及相关机制研究

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研究论文肾小管上皮细胞坏死性凋亡和炎症因子表达及相关机制研究
前言 (9)
材料与方法 (10)
结果 (21)
讨论 (29)
结论 (31)
参考文献 (32)
综述坏死性凋亡及其在疾病中作用的研究进展 (37)
致谢 (51)
个人简历 (52)
肾小管上皮细胞坏死性凋亡和炎症因子表达及相关机制研究
摘要
目的：慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一种破坏性的疾病，近年来逐渐被视为主要公共卫生问题，其病程进展缓慢，但最终导致不可逆的肾单元丢失、终末期肾病。

CKD发生发展过程中肾间质炎症的发生与肾小管上皮细胞的变化密切相关。

坏死性凋亡是除凋亡外重要的程序性细胞死亡类型，2005年Degterev等人首次提出，并将其命名为“necroptosis”。

它是一种非caspase依赖性细胞死亡模式，可由肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的受体相互作用蛋白（receptor integrated protein，RIP）来调控。

坏死性凋亡在多种疾病的炎症反应过程中起重要作用，但坏死性凋亡与人肾小管上皮细胞炎症因子表达的关系目前尚不清楚。

我们前期研究发现坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）可以减轻单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠的肾脏炎症反应，但具体的调控机制还未明确。

在前期实验的基础上，本实验以人肾小管上皮细胞HK2为研究对象，以TNF-α、泛caspase抑制剂Z-V AD-FMK 为刺激物，构建坏死性凋亡的细胞模型，进一步给予细胞Nec-1干预，转染RIP1过表达质粒，深入探讨人肾小管上皮细胞发生坏死性凋亡及相关炎症的机制，从而为阐明肾小管损伤在CKD进展中的作用提供新思路。

方法：
体外培养人肾小管上皮细胞HK2，应用TNF-α联合Z-V AD-FMK （T/Z）刺激24 h。

乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验检测细胞死亡百分比，Western blot检测观察坏死性凋亡相关指标RIP1以及IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达，Western blot和ELISA测定白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的水平，RT- PCR检测NF-κB p65的mRNA表达水平。

进一步分别及联合应用Nec-1、PDTC进行干预,RIP1过表达质粒转染，检测上述指标。

免疫共沉淀法检测RIP1泛素化相关指标泛素（Ubiquitin, Ub）蛋白的表达。

结果：
1.TNF-α/Z-V AD-FMK诱导了HK2细胞RIP1表达
Western blot结果显示，与对照组相比，TNF-α单独刺激HK2细胞RIP1( P<0.05)、cleaved-caspase3(P<0.01)的蛋白水平均增加，联合应用Z-V AD-FMK刺激RIP1的蛋白水平进一步显著增加(P<0.01)，cleaved-caspase3(P<0.01)的蛋白水平降低。

LDH细胞毒性试验结果显示，与对照组相比，T/Z刺激HK2细胞后细胞坏死百分比增高(P<0.01)，在此刺激条件下给予Nec-1干预，HK2细胞死亡百分比下降(P<0.01)，转染RIP1过表达质粒细胞死亡百分比显著增高(P<0.01)。

2.坏死性凋亡诱导了HK2细胞炎症因子的表达
Western blot及ELISA结果显示，与对照组相比，T/Z刺激HK2细胞后IL-1β( P<0.05)、MCP-1(P<0.01)蛋白水平增高，在此刺激条件下给予HK2细胞Nec-1干预蛋白水平降低( P<0.05或P<0.01)；反之，转染RIP1过表达质粒蛋白水平明显上调( P<0.05或P<0.01)。

3.坏死性凋亡激活了HK2细胞NF-κB通路
Western blot结果显示，与对照组相比，T/Z刺激HK2细胞后IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65的蛋白水平增高(P<0.01)。

在此刺激条件下给予Nec-1干预后降低了其蛋白水平( P<0.05或P<0.01)；而转染RIP1过表达质粒后明显上调了其蛋白水平(P<0.01)。

RT-PCR结果与Western blot结果趋势相同。

4.抑制NF-κB通路减轻了坏死性凋亡诱导的HK2细胞炎症因子表达
Western blot结果显示，与对照组相比，T/Z刺激HK2细胞后IL-1β、MCP-1的蛋白水平增高(P<0.01)，在此刺激条件下单独给予HK2细胞PDTC干预，上述蛋白水平显著降低(P<0.01)，联合应用Nec-1干预后蛋白水平降低更显著(P<0.01)。

5.TNF-α/Z-V AD-FMK诱导HK2细胞RIP1泛素化
免疫共沉淀结果显示，与对照组相比，T/Z刺激HK2细胞后RIP1蛋白泛素化水平升高。

结论：
1.RIP1介导的坏死性凋亡参与了人肾小管上皮细胞的炎症因子的表
达，这可能是部分通过调节NF-κB信号通路活化实现的。

2.TNF-α/Z-V AD-FMK可能诱导了RIP1泛素化，初步提示其可能参与了人肾小管上皮细胞炎症因子的表达。

关键词：RIP1，坏死性凋亡，人肾小管上皮细胞，NF-κB，泛素化
Necroptosis and inflammatory factors expression in renal tubular epithelial cells and the molecule mechanism
ABSTRACT
Objective: Chronic kidney disease (CKD) is a kind of destructive disease. In recent years, CKD has gradually been regarded as a major public health problem. The course of CKD is slow, which leads to irreversible renal unit loss and end-stage renal disease. The continuous inflammatory response of kidney is closely related to the occurrence and development of CKD. Necroptosis is an important type of programmed cell death in addition to apoptosis, which was first proposed by Degterev et al in 2005 and named "necroptosis". Necroptosis is a caspase-independent cell death mode that can be regulated by TNF-induced receptor integrated protein (RIP). Necroptosis plays an important role in the inflammatory response of many diseases. However, the relationship between necroptosis and the expression of inflammatory factors in human renal tubular epithelial cells is still unclear.
In our previous studies, we found that Necrostatin-1 (Nec-1), a necroptosis inhibitor, can reduce renal inflammatory response in unilateral ureteral obstruction (UUO) mice, but the specific regulatory mechanism has not been clarified. On the basis of previous experiments, this experiment takes HK2 as the research object, TNF-α and pan caspase inhibitor Z-VAD-FMK were used as stimulants to construct necroptosis cell model. Furthermore, administering Nec-1 and NF-κB specific inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) to the cells separately or in combination, and transfecting the RIP1 overexpression plasmid. To further explore the mechanism of necroptosis and related inflammation in human renal tubular epithelial cells, so as to provide new ideas for elucidating the role of renal tubular injury in the progression of CKD.
METHODS:
Human renal tubular epithelial cells HK2 were cultured in vitro, and stimulated with TNF-α and Z-V AD-FMK（T/Z）for 24 h. Lactate dehydrogenase (LDH) cytotoxicity assay was used to detect the percentage of cell necrosis. The protein levels of receptor interacting protein 1 (RIP1), IKK-α and NF-κB p65 were determined by Western blot. The levels of interleukin-1β（IL-1β）and monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）were detected by Western blot and ELISA. RT-PCR was used to detect the mRNA expression level of NF-κB p65. Furthermore, Nec-1 and PDTC were used separately and in combination for intervention, and RIP1 overexpressed plasmids were transfected to detect the above indicators.Co-immunoprecipitation was used to detect the expression of ubiquitin (Ubiquitin, Ub) protein, a ubiquitination-related indicator of RIP1.
RESULTS:
1.TNF-α / Z-V AD-FMK induces RIP1 expression in HK2 cells
Western blot results showed that protein levels of RIP1 and cleaved caspase3 were increased when TNF-α stimulated HK2 cells alone, compared with the Control group. T/Z stimulated the protein level of RIP1 in HK2 cells to further increase( P<0.05), while the protein level of cleaved-caspase3 decreased(P<0.01). The results of LDH cytotoxicity test showed that compared with the Control group, the percentage of necrosis increased after T/Z stimulation of HK2 cells(P<0.01). When Nec-1 was administered under this stimulation condition, the percentage of necrosis of HK2 cells decreased(P<0.01), and the percentage of necrosis of transfected RIP1 overexpressing plasmid cells increased significantly(P<0.01).
2.Necroptosis induces expression of inflammatory factors in HK2 cells
The results of Western blot and ELISA showed that the levels of IL-1β( P<0.05) and MCP-1( P<0.01) protein in HK2 cells stimulated by
T/Z were higher than those in the Control group. Under this stimulating condition, the protein level of HK2 cells was reduced by Nec-1 intervention( P<0.05 or P<0.01); on the contrary, the transfection of RIP1 overexpression plasmid significantly increased its protein level( P<0.05 or P<0.01).
3.Necroptosis activates NF-κB pathway in HK2 cells
Western blot showed that the protein levels of IKK-α、NF-κB p65、and p-NF-κB p65 in HK2 cells stimulated by T/Z were higher than those in the Control group( P<0.01). Under this stimulating condition, the protein level of HK2 cells was dropped by Nec-1 intervention( P<0.05 or P<0.01); on the contrary, the transfection of RIP1 overexpression plasmid significantly raised its protein level( P<0.01). Real-time PCR results showed the same trend as Western blot results.
4.Inhibition of NF-κB pathway reduces expression of inflammatory factors in HK2 cells induced by necroptosis
Western blot showed that the protein levels of IL-1β and MCP-1 in HK2 cells stimulated by T/Z were higher than those in Control group(P<0.01). Under the stimulation condition, the above protein level was significantly reduced after the PDTC intervention of HK2 cells alone(P<0.01), especially after the combined application of Nec-1(P<0.01).
5.TNF-α / Z-V AD-FMK induces RIP1 ubiquitination in HK2 cells
The results of co-immunoprecipitation showed that compared with the control group, T/Z stimulated HK2 cells to increase the ubiquitination level of RIP1 protein.
CONCLUSION:
1.RIP1 mediated necroptosis is involved in the expression of inflammatory factors in human renal tubular epithelial cells, which may be partially mediated by the activation of NF-κB signaling pathway.
2.TNF-α/Z-V AD-FMK may induce the ubiquitination of RIP1, suggesting that it may be involved in the expression of inflammatory
factors in human renal tubular epithelial cells.
Key words:RIP1, Necroptosis, Human renal tubular epithelial cells, NF- B, Ubiquitination
英文缩写
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CKD chronic kidney disease慢性肾脏病
RIP receptor integrated protein受体相互作用蛋白TNF-αtumor necrosis factor-alpha肿瘤坏死因子-αUUO unilateral ureteral obstruction单侧输尿管结扎
PDTC ammonium pyrrolidine dithiocarbamate
吡咯烷二硫代氨基甲酸
铵
NF-κB nuclear factor kappa-B 选择性核因子κB
IL-1β interleukin-1β白介素-1β
MCP-1 monocyte chemotactic protein 1 单核细胞趋化蛋白cDNA complement DNA 互补脱氧核糖核苷酸mRNA message ribonuclunc acid 信使核糖核酸
RT-PCR reverse transcription polymerase
chain reaction
反转录聚合酶链反应
SDS- PAGE sodium dodecyl sulfate-poly
acrylamide gel electrophoresis
十二烷基磺酸钠-聚丙烯
酰胺凝胶电泳
SPSS statistical package for social 社会科学统计软件
TEMED N,N,N’,N’-teral ethylene N,N,N’,N’-四甲基乙二胺
SD standard deviation 标准差
研 究 论 文
肾小管上皮细胞坏死性凋亡和炎症因子表达及相关机制研究
前言
肾脏持续的炎症反应与CKD的发生发展密切相关，肾小管上皮细胞的损伤在其中发挥着关键作用。

直接损伤、高代谢或各种肾功能损伤因子都会激活肾小管上皮细胞，进而与肾间质，包括炎细胞相互作用，进一步引起肾脏损伤[3,4]。

深入肾小管上皮细胞损伤机制的研究，对于延缓慢性肾脏病进程显得尤为重要。

坏死性凋亡是2005年由Degterev等首次报道并命名的一种新型由受体相互作用蛋白（receptor interacting protein, RIP）调控的非caspase依赖性细胞死亡模式, 它同时具有坏死和凋亡两种特性，当机体凋亡信号通路被阻断后, 死亡受体介导的凋亡就转化为坏死性凋亡[5,6]。

其中，RIP1是坏死性凋亡的特异性生化指标，它是坏死性凋亡途径中的关键上游调控蛋白[7-9]。

研究发现，小分子药物Necrostatin-1（Nec-1）是一种有效的、广泛应用的RIP1抑制剂[10,11]，能够特异性抑制RIP1的磷酸化进而阻断坏死性凋亡途径的激活。

新近研究发现，坏死性凋亡在多种疾病包括肾脏病的发生发展中发挥了关键性的作用。

如急性坏死性胰腺炎[12]、克罗恩病[13]、缺血再灌注肾脏损伤[14]、顺铂诱导的急性肾脏损伤[15]。

在上述肾脏损伤性疾病的体外模型中，均提示肾小管上皮细胞发生了坏死性凋亡，并在病变发生发展中起重要作用。

同时，多项研究发现，RIP1介导的坏死性凋亡在炎症中发挥重要作用[16-19]。

我们前期研究发现Nec-1能够减轻单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠的肾脏炎症反应[20]，但肾小管上皮细胞在其中发挥的作用及相关机制未见报道。

本实验采用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）联合Z-V AD-FMK（T/Z）刺激体外培养的人肾小管上皮细胞，构建坏死性凋亡的细胞模型,进一步给予细胞Nec-1干预，RIP1过表达质粒转染等方法，深入探讨人肾小管上皮细胞发生坏死性凋亡及相关炎症的机制，从而为阐明肾小管损伤在CKD进展中的作用提供新思路。

材料与方法
1材料
1.1实验所用细胞株
人肾小管上皮细胞HK2，购自美国标准生物品收藏中心。

培养基配制：低糖型DMEM培养基与DMEM/F12培养基1:1配制，10 % 胎牛血清，100 U/mL链霉素，100 U/mL青霉素，37 °C，5% CO2环境培养。

1.2主要实验设备、仪器
电子恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司
电子恒温干燥箱天津市华北实验仪器有限公司台式高速冷冻离心机北京四环科学仪器厂
旋涡混合器上海精科实业有限公司
超低温冰箱青岛Haier公司
电子天平北京赛多利斯天平公司
恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂
CO2培养箱中国力康公司
超净工作台苏净安泰有限公司
一次性塑料培养瓶美国Corning公司
一次性6孔塑料培养板美国Corning公司
循环变温加热PCR仪美国Bio-rad公司
小型台式离心机美国Sigma公司
压力蒸汽灭菌器博讯实业有限公司医疗设备厂自动三重纯水蒸馏器上海力康发展有限公司
垂直电泳槽美国Bio-rad公司
转移电泳槽美国Bio-rad公司
转移电泳仪美国Bio-rad公司
凝胶成像分析仪美国UVP公司
标准型PH计北京赛多利斯有限公司
1.3主要试剂
聚偏二氟乙烯膜（PVDF）美国Millipore公司
三羟甲基氨基甲烷（Tris）美国Sigma公司
甘氨酸（Gly）美国Promega公司
十二烷基硫酸钠（SDS）北京Solarbio公司
氯化钠天津市凯通化学试剂有限公司
磷酸氢二钠天津市永大化学试剂有限公司
磷酸二氢钠天津市风船化学试剂科技有限公司盐酸天津市风船化学试剂科技有限公司甲醇天津市利安隆博华医药化学有限公司DMEM培养基美国Gibco公司
DMEM/F12培养基美国Gibco公司
Opti-MEM培养基美国Thermo Fisher公司
30%丙烯酰胺北京Solarbio公司
RIPA细胞裂解液北京Solarbio公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒北京Solarbio公司
0.5M Tris-C1 PH6.8 北京Solarbio公司
1.5M Tris-C1 PH8.8 北京Solarbio公司
过硫酸铵（APS）美国Sigma公司
TEMED 美国Sigma公司
Tween-20 华美生物工程公司
ECL增强化学发光试剂盒北京TIANGEN公司
预染蛋白分子量marker 美国Thermo Scientific公司
EDTA 美国Gibco公司
NP-40 美国Sigma公司
TNF-α美国PeproTech公司
Z-V AD-FMK 美国MCE公司
Nec-1 美国MCE公司
PDTC 美国Abcam公司
RIP1质粒美国Addgene公司
β-actin 兔抗人多克隆抗体美国PeproTech公司
RIP1鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
NF-κB p65鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
p-NF-κB p65鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
IKK-α鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
IL-1β鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
MCP-1鼠抗人多克隆抗体美国Abcam公司
caspase-3兔抗人多克隆抗体美国Cell Signaling公司
普通小鼠igG抗体美国SANTA CRUZ公司
RIP1泛素化抗体美国Cell Signaling公司
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，
美国Promega公司LDH）细胞毒性检测试剂盒购
Lipofectamine 3000转染试剂盒美国Thermo Fisher公司
IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒武汉六合生物公司
MCP-1酶联免疫吸附测定试剂盒武汉六合生物公司
反转录试剂盒美国Promega公司
RT-PCR SYBRPremix Ex Taq TMⅡ试
美国TAKARA公司剂盒
蛋白质A / G琼脂糖珠美国SANTA CRUZ公司
1.4主要试剂配制
1.4.1上样缓冲液（6×buffer）
4×Tris.HCL/SDS pH6.8 7 mL，DTT 0.93 g，溴酚蓝1.2 mg，SDS 1g，甘油3 mL，等量分装成1 mL/管，并于-20 °C保存。

1.4.2Western blot电泳缓冲液
准确称量甘氨酸14.5 g，Tris 3.05 g，SDS 1 g，搅拌溶解后蒸馏
水定容至1000 mL。

1.4.3Western blot转膜缓冲液
准确称量甘氨酸14.5 g，Tris 3.05 g，搅拌溶解后蒸馏水定容至800 mL，加甲醇200 mL定容至1000 mL，4 °C层析柜预冷备用。

1.4.4Western blot洗膜液
Tris 1.21 g,氯化钠9 g，Tween-20 1 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，加入浓HCL 0.6 mL，pH调至7.4。

1.4.5PBS
Na2HPO4 5.8 g, NaH2PO4 0.6 g, NaCl 17 g,溶于2000 mL蒸馏水中。

1.4 .6washing buffer
mL 1M tris HCL（PH 8.0） 10
2M NaCl 15 mL
0.5M EDTA 2 mL
NP-40 1 mL
H2O 172 mL
2 实验方法
2.1细胞培养
2.1.1细胞复苏与培养
人肾小管上皮细胞HK2购自美国标准生物品收藏中心。

培养基配制：低糖型DMEM培养基与DMEM/F12培养基1:1配制，10 % 胎牛血清，100 U/mL链霉素，100 U/mL青霉素。

细胞复苏步骤：水浴锅预热30 min，自液氮罐内取出冻存管，用镊子夹住瓶盖，迅速置于37 °C 恒温水浴锅，轻摇使管内液体迅速融化。

用75 %的乙醇喷洒冻存管外壁后，吸取冻存管内细胞至15 mL 离心管，1000 rpm离心3~4 min。

弃去其上清液，再加入3 mL培养基吹打均匀，将细胞接种到含双抗和10 %血清的培养基中，置入37 °C，5 % CO2培养箱中培养。

2.1.2细胞换液与传代
细胞换液：根据细胞生长速度，一般隔天换液一次。

先将培养瓶内的陈旧培养基弃去，再向培养瓶内加入2 mL PBS，轻轻摇晃清洗
贴壁细胞2次，弃去PBS，加入新鲜培养基，置于培养箱内培养。

细胞传代：根据细胞生长速度，一般2~3天传代一次。

弃去培养瓶内陈旧培养基，再向培养瓶内加入2 mL PBS，轻轻摇晃清洗贴壁细胞2次，弃去PBS，加入1 mL 胰蛋白酶，水平轻轻晃动使其覆盖细胞，置于37 °C培养箱内2 min，显微镜下观察，细胞游离成亮球状，加入1 mL培养基，旋转吹打贴壁细胞，然后将吹打下来的细胞悬液吸入15 mL离心管内，1000 rpm离心3~4 min，弃去上清液，再向离心管内加入3 mL 培养基重悬细胞，接种到含新鲜培养基的培养瓶中，继续培养。

2.1.3细胞冻存
细胞冻存：选择对数生长期细胞，在冻存前24小时换液，先消化细胞，然后将培养瓶内的细胞悬液吸入离心管，1000 rpm离心 5 min，弃去上清液，向离心管内加入1 mL冻存液（含900 uL FBS+100 uL DMSO）重悬细胞，转移至冻存管内，标注细胞名称、代数及日期，封口膜封口，4 °C 1小时，-20 °C 30分钟，-80 °C过夜，再放入液氮内保存。

2.1.4细胞分组
1）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α刺激组（T组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z 组）,western blot检测HK2中RIP1、caspase-3、cleaved-caspase3蛋白的表达水平。

2）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、转染RIP1+质粒组（RIP1+组），western blot检测HK2中RIP1蛋白的表达水平。

3）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α刺激组（T组）、Z-V AD-FMK刺激组（Z组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z组）、Nec-1干预组（T/Z+N组），乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验检测细胞死亡百分比。

4）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK 刺激转染RIP1+质粒组（T/Z+RIP1+组），乳酸脱氢酶（LDH）细胞
毒性实验检测细胞死亡百分比。

5）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α刺激组（T组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z组）、Nec-1干预组（T/Z+N组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激转染RIP1+质粒组（T/Z+RIP1+组），western blot检测HK2中IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β、MCP-1蛋白的表达水平，ELISA法检测细胞上清液IL-1β、MCP-1含量，RT- PCR 检测NF-κB的mRNA水平。

6）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α刺激组（T组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z组）、PDTC干预组（T/Z+P组）、PDTC联合Nec-1干预组（T/Z+P/N 组）,western blot检测HK2中IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β、MCP-1蛋白的表达水平。

7）将生长状态良好的HK2随机分为正常对照组（Control组）、TNF-α联合Z-V AD-FMK刺激组（T/Z组），免疫共沉淀法检测RIP1泛素化水平。

2.2细胞转染
RIP1过表达质粒由Addgene公司惠赠，细胞转染前一天进行细胞传代（步骤同上），将细胞铺入六孔板中培养，待细胞密度60%-70%进行转染，准备A、B两个2 mL的EP管，A管中加入125 μL Opti-MEM 培养基和5 μL Lipofectamine 3000 Reagent试剂，B管中加入125 μL Opti-MEM培养基、5 μL P3000 Reagent试剂以及1 μg RIP1质粒，A、B管混匀，于细胞超净台上放置5 min，将混合液加入细胞培养皿中，转染6 h后更换含10 %血清的完全培养基做后续处理。

2.3免疫蛋白印迹（Western blot）检测HK2细胞中RIP1、caspase-3、cleaved-caspase3、IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β、MCP-1蛋白表达
2.3.1细胞总蛋白提取
配置裂解液：RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂1:1配置。

弃去培养基，用预冷的生理盐水洗涤两次，弃去生理盐水，向培养瓶内加入新配置的蛋白裂解液250 uL，冰浴40 min，刮匙刮除贴壁细胞于EP管中，之后于4 °C，12000 rpm离心20 min，小心吸取上清液至另一EP
管中，定量后蛋白变性，用于蛋白免疫印迹实验。

2.3.2蛋白定量
采用蛋白定量试剂盒（BCA Protein Kit）测量蛋白浓度，简要步骤如下：1、配置工作液：每50体积的BCA试剂A加1体积的BCA 试剂B，根据标准品和样品的数量配置适量体积的BCA工作液，并震荡混匀。

2、稀释标准品：标准品的浓度分别为500、400、300、200、150、100、50和0 ug/mL，将稀释好的标准品加入到96孔板中，每个孔20 uL，并设置3个复孔。

3、在相应的96孔板内加入2 uL的待测样品，并在补加PBS至20 uL。

最后向各个孔内加入200 uL配置好的BCA工作液，将96孔板置于37 °C温箱30 min，用酶标仪测定各孔的OD值（570 nm），绘制标准曲线，计算出待测蛋白的浓度。

根据蛋白定量测定的蛋白样品的实际浓度，按照每个上样孔30 ug的上样质量计算出每组蛋白样品的实际上样体积，按照1:5的比例，向每管蛋白样品中加入相应体积的6×buffer上样缓冲液，震荡混匀后，置于100 °C水浴锅内高温变性7 min，迅速插入冰内冷却备用。

2.3.3蛋白免疫印迹
1）固定玻璃夹板，在玻璃板之间加入蒸馏水以检查玻璃板的严密程度。

2）弃去两玻璃板间的蒸馏水，并用滤纸吸干多余水分，在锥形瓶中配置12 %分离胶，灌注到两玻璃板之间，然后加入无水乙醇隔绝空气，室温放置30 min，等待分离胶凝固。

3）弃去无水乙醇，并用滤纸吸干多余水分，在锥形瓶中配置5 %浓缩胶。

4）灌注浓缩胶，插入梳子，室温放置30 min，等待浓缩胶凝固。

5）取出蛋白样品，离心后上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6）浓缩胶恒压90 V电泳，到达分离界面后，分离胶恒压120 V 电泳，当指示剂距离玻璃板底端1 cm左右时，停止电泳。

7）取下凝胶，进行转模。

凝胶在负极，PVDF膜在正极，低温条件下恒压60 V转膜，待凝胶上目的蛋白完全转移到PVDF膜后，取下PVDF膜在TBST中漂洗10 min后，置于5 %脱脂奶粉中，37 °C 恒温箱孵育1 h，进行抗原封闭。

8）取出PVDF膜，用滤纸吸干水分，加入TBST稀释的一抗，4 °C 过夜。

次日，取出条带，室温恢复40 min。

9）TBST漂洗PVDF膜15 min×3，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，37 °C恒温箱孵育2小时。

10）TBST洗膜15 min×3。

根据条带数量配制ECL化学发光检测液，将试剂盒中的A液和B液1：1混合，现用现配。

11）将配好的发光液滴加于PVDF膜上，待其反应1 min后，用ImageQuant TM LAS4000数字成像系统进行显色并分析数据。

每组实验重复3次。

2.4乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验检测细胞死亡百分比
2.4.1原理
乳酸脱氢酶（LDH），是一种极其稳定的细胞质酶，正常情况下存在于细胞的胞质中，但是当细胞膜一旦受损，LDH就会被释放到细胞外；LDH可以催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应后转化成甲臜化合物，通过酶标仪可以进行检测。

颜色深浅与裂解细胞的数目成正比，96孔板收集可见光波长的吸收值。

2.4.2培养孔分组
无细胞的培养液孔（背景空白对照孔），未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔即Control组)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞孔（药物处理样品孔即Control组、T组、Z组、T/Z组、T/Z+N组、T/Z+RIP1+组），每个处理孔设置三个复孔。

2.4.3步骤
1）细胞传代并计数，根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔板中，使待检测时细胞密度不宜超过80 %-90 %。

2）吸去培养液，用PBS液洗涤一次。

换新鲜培养液（含1 %血清的低血清培养液），各培养孔加药物刺激24 h。

3）预定检测时间点的前1小时，取出96孔板，在样品最大酶活性对照孔内加入试剂盒提供的LDH释放试剂20 uL。

反复吹打混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。

4）到达预定时间后，吸取96孔板内各孔培养基到2 mL EP管中，
400 g离心5 min。

5）工作液制备：cyto Tox96 INT溶液(1×)的配置：按所需的INT 溶液(1×)的量，将INT溶液(10×)用INT稀释液稀释至1×。

例如，取20 μL INT溶液(10×)，加入180 μL INT稀释液，混匀后即配置为200 μL INT溶液(1×)。

INT溶液（1×）溶液应现配现用，在4 °C保存。

6）分别取各孔的上清液50 uL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。

各孔分别加入50 uL LDH检测工作液。

7）震荡混匀，室温避光孵育30 min。

向各孔内加入终止液，然后在490 nm处测定吸光度。

8）计算方法：测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度,细胞死亡百分比(%)=(药物处理样品孔吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性对照孔吸光度-样品对照孔吸光度)×100。

每组实验重复3次。

2.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞上清液IL-1β、MCP-1含量
1）各组细胞终止刺激后，收集细胞培养基。

2）1000 ×g离心25 min，各取50 μL的标准品及待测样品于ELISA 板中，每组各设两个复孔，
3）在每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封条件下，37 °C孵育60 min。

4）弃去孔内液体，用PBS洗涤液重复洗5次，再向每孔中加入50 μL底物A、B，37 °C避光孵育15 min。

5）在每孔中加入50 μL终止液，在450 nm波长处测定每孔的OD值。

6）根据标准品的吸光度和其浓度绘制出标准曲线，各组样品中IL-1β、MCP-1的含量根据其OD值及标准曲线换算出相应浓度，每组实验重复3次。

2.6 RT- PCR检测NF- B的mRNA水平
2.6.1 TRIzol法提取细胞总RNA
1）弃去培养基，并用预冷的生理盐水洗涤两次，尽量吸干净皿内生理盐水。

2)向每个培养皿内加入1 mL Trizol,冰上放置5 min,用枪头吹打，
使Trizol铺满整个皿底。

3)将各个皿中的裂解液吸到1.5 ml EP管中,向每个管中加入200
uL三氯甲烷,用力振摇15 s,冰上放置10 min, 4 °C，12000 g离心15 min。

4)离心后液体分为三层：上层的无色水样层是RNA,中层白色是DNA，底层红色是蛋白质，小心吸取上层的无色液体移入新的EP管
中。

5)加入等体积异丙醇，震荡混匀，在-20 °C冰箱内孵育10-30 min,
4 °C，12000 g离心1
5 min。

6)弃去上清，在沉淀中加入750 uL无水乙醇和250 uL DEPC水,
漩涡振荡30 s，4 °C，7500 g离心20 min来洗涤RNA。

7)小心弃去上清，用枪头吸净上清液，管内沉淀放置于超净台中
鼓风静置干燥3-5 min。

待无水乙醇挥发，不宜过干，否则影响RNA
的溶解。

8)加入20 uL DEPC水用来溶解RNA，分装至5uL管内，-80 °C
冰箱保存备用。

9）另取2 uL RNA测定其浓度，浓度单位为ng/uL，纯度在1.8-2.0
最佳。

2.6.2反转录合成cDNA
1）配置引物和RNA混合物（总体积10 uL）
ug/浓度
RNA 2
Random primers(0.5 ug/reaction) 1 uL
Oligo(dr)15 primers 1 uL
Nuclease Free Water 加至10 uL
2）将上述物质混合，并进行70 °C,5 min预变性，置于冰上。

3）配置RT-MIX，向各样品管加入10 uL。

Nuclease Free Water 1.6 uL
Goscript 5× Reaction Buffer 4 uL
Mgcl2(25mol) 2
uL PCR Nucleatiole Mix 1 uL
Robonnclease Inhibitor 0.4 uL
Reverse Franscriptese 1 uL
4)反应条件为：
退火：25 °C,5 min，延伸：42 °C,60 min，逆转录酶失活70 °C,15
min,4 °C ∞，获得cDNA，-80 °C保存，备用。

2.6.3 RT- PCR反应
采用TAKARA试剂盒进行Real-time PCR检测，每组样品同时
设置两个复孔，每组实验重复3次。

1）PCR引物序列
HS-RPS18引物序列为：
Sense： 5’-ATCCTCAGTGAGTTCTCCCG-3’
antisense: 5’-ATTACCGTCACTACCGTTTC-3’
NF-κB引物序列为：
Sense： 5’-AGGCTCCTGTGCGTGTCTCC-3’
antisense: 5’-GGTCATGGACGGTCTATGTCTGCT-3’
2）PCR反应体系（20uL）
TB Green Premix Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）2×10 uL
uL PCR Forward Primer（10uM） 0.8
uL PCR Reverse Primer（10uM） 0.8
uL Rox Reference Dye（50×） 0.4
DNA模板 2 uL
uL Nuclease Free Water加至 20 3）扩增条件：
预变性：95 °C,30 s。

PCR反应：95 °C 5 s、55 °C 30 s、72 °C 30
s，40个循环。

4）PCR反应结果分析：使用3个复孔的Ct值取平均值，采用公
式2-△△Ct计算基因表达的相对倍数变化。

2.7免疫共沉淀法检测RIP1泛素化水平
1）用预冷的生理盐水洗涤细胞两次，最后一次吸干生理盐水。

2）向每个培养皿中加入1 mL RIPA 裂解液（加蛋白酶抑制剂），
用细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5 mL EP管中，4 °C,
缓慢晃动30 min。