外源药剂预处理对蒙古黄芪种子活力及活性氧、线粒体膜电位的影响

特产研究
Special Wild Economic Animal and Plant Research
15
DOI：10.16720/ki.tcyj.2021.050
外源药剂预处理对蒙古黄芪种子活力及活性氧、线粒体膜电位的影响
鲁海坤，于营，隋昕，刘亚苓，于芸泽，郭靖※
（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）
摘要：为研究蒙古黄芪（
Bunge）种子老化过程中活性氧和线粒体膜电位的变化与种子活力的关系，筛选提高
种子抗老化能力外源药剂的适宜浓度，以不同浓度 NAC 和 CsA 预处理的种子为试材，进行人工老化 3 d 处理后测定种子发芽率、
发芽指数、活性氧含量和线粒体膜电位。

实验结果表明，相比初始种子，蒙古黄芪种子经人工老化 3 d 后，其胚轴活性氧含量升高、线
粒体膜电位下降，发芽率和发芽指数分别下降 32.7%和 40.6%；而经 10 mmol/L NAC 和 90 mol/L CsA 预处理的种子，相比于未进
行外源药剂预处理（蒸馏水处理）的种子，在人工老化 3 d 后，其发芽率分别提高 31.2% 和 16.2%，发芽指数分别提高 38.3% 和 21.1%，
且胚轴活性氧含量有所下降，线粒体膜电位升高。

表明通过适宜浓度的 NAC 和 CsA 预处理可以增强蒙古黄芪种子的抗老化能力，
提高种子活力，延长种子的寿命。

关键词：蒙古黄芪；种子活力；外源药剂；活性氧；线粒体膜电位
中图分类号：S567.23+9
文献标识码：A
文章编号：1001-4721（2021）06-0015-06
. All Rights Reserved.
LU Hai-kun, YU Ying, SUI Xin, LIU Ya-ling, YU Yun-ze, GUO Jing ※
(Institute of Special Animal and Plant Sciences of Chinese Academic Agricultural Sciences, Changchun 130112,China)
: In order to study the relationship between the changes of active oxygen and mitochondrial membrane potential and seed vigor
during the aging of
Bunge seeds, the concentration of exogenous agents which was suitable for improving the anti-
aging ability of seeds was screened. The seeds pretreated with different concentrations of NAC and CsA were used as the test materials, and
after artificial aging for 3 days, the seed germination rate, germination index, active oxygen content and mitochondrial membrane potential
were measured. The results showed that compared with the initial seeds, after artificial aging of
seeds for 3 days, the active
oxygen content of hypocotyls increased, the mitochondrial membrane potential decreased, and the germination rate and germination index
decreased by 32.7% and 40.6%, respectively. When the seeds were pretreated with 10 mmol/L NAC and 90 mol/L CsA, their germination
rate increased by 31.2% and 16.2%, and germination index increased by 38.3% and 21.1% respectively compared with the seeds without ex-
ogenous agent pretreatment (distilled water treatment) after artificial aged for 3 days. Additionally, the hypocotyl active oxygen content de-
creased, and the mitochondrial membrane potential increased in exogenous agent treated seeds. It shows that pretreatment with appropriate
concentrations of NAC and CsA can enhance the anti-aging ability of
seeds, increase seed vigor, and prolong seed life.
: Astragalus mongolicus; seed vigor; exogenous medicament; reactive oxygen species; mitochondrial membrane potential
种子老化是指种子活力自然衰退的过程，这是一 种不可逆转的过程，成为农业生产及种质资源保存的 不利因素[1]，因此，研究种子老化机理，探求适宜种子
的保存条件，对于农业生产、优质种质资源保存和生物 多样性保护等具有重要意义 [2]。

目前普遍认为活性氧 造成的氧化胁迫是种子老化的主要原因 [3]。

1980 年，
收稿日期：2021-03-10 基金项目：吉林省科技发展计划项目（20180201034 YY）；中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2016-ISAPS）；吉林省中药
材种子种苗检测实验室（2018-8-14） 作者简介：鲁海坤（1995-），男，河南信阳人，硕士研究生，从事药用植物种质资源保存工作。

※通讯作者：郭靖（1968-），女，硕士，研究员，硕士生导师，从事中药材资源评价、育种及规范化栽培研究。

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特
产
研
究
2021 年第 43 卷第 6 期
Miquel等[4]提出了衰老的线粒体学说，认为活性氧、线
粒体和种子老化三者密切相关。

线粒体可以为细胞的
生命活动提供能量，是进行氧化磷酸化形成 ATP 的主
要场所，被誉为细胞的“能量工厂”。

此外，线粒体还参
与细胞信号传递、细胞分化和细胞凋亡等，在调控细胞
和机体生命活动方面发挥重要作用[5-7]；同时，线粒体
也是活性氧产生的主要部位 [8]，植物细胞消耗的氧中
约有 1% 在线粒体中产生活性氧，其中由线粒体呼吸
链底物端漏出的电子还原 O2 单电子生成的 O2-是线 粒体活性氧的主要来源 [9]。

O2-是多数活性氧的前体， 可以被超氧化物歧化酶转变为过氧化氢。

在正常生理
状态下，植物细胞内活性氧的产生和消除处于动态平
衡状态，但当植物遭受胁迫时，细胞内的活性氧积累过
多引起氧胁迫，线粒体最先受到伤害。

Wang 等[10]在榆
树种子老化研究初步揭示了种子老化过程中线粒体作
用的机理，即活性氧可使线粒体膜通透性转换孔
（MPTP）开放，进而导致线粒体膜电位降低，随后释放
细胞色素 c 和细胞死亡诱导因子，最终诱导细胞死亡。

N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）是一种广谱活性氧
.抑A制ll剂，R可i以gh有t效s清R除es细e胞r中ve的d过. 氧化氢，超氧阴离子
和羟自由基等活性氧有抑制细胞凋亡的作用，在生物
医药研究中应用广泛[11-13]。

环孢霉素 A（CsA）可以与
MPTP 组件上的亲环素蛋白结合，从而抑制 MPTP 开
放，维持线粒体膜电位，抑制细胞色素 c 释放，减少细
胞凋亡的发生[14,15]。

蒙古黄芪（
Bunge）是豆科
黄芪属多年生药用植物，其干燥根名为黄芪，是我国传
统的大宗药材。

由于近年来野生黄芪资源过度采挖，商
品黄芪主要来源于人工栽培，种子是蒙古黄芪的主要
繁殖材料，因此，为保证蒙古黄芪产业的发展和优质种
质资源的保存，研究其种子老化机理和适宜的贮藏方
法尤为重要。

本试验通过 NAC 和 CsA 预处理蒙古黄
芪种子，研究外源药剂处理对种子活力、活性氧含量以
及线粒体膜电位的影响，分析蒙古黄芪种子老化与活
性氧和线粒体的关系，以期为探索种子老化机理和种
子保存提供参考。

1 材料和方法
1.1 材料
试验种子购于河北省安国市，经中国农业科学院
特产所郭靖研究员鉴定为蒙古黄芪种子，种子初始发
芽率为 89%，发芽指数为 30.3，含水量为 9.8%。

1.2 方法 种子预处理 随机挑选种子，用不同浓度的
NAC（0、5、10、20、40 mmol/L）、CsA（0、30、60、90、120 mol/L）浸泡 4 h（浓度 0 为蒸馏水），之后用蒸馏水冲
洗 3 遍，再于室温下回干 2 d，当种子含水量降至初始 含水量后，用铝箔袋密封包装，保存于 4 ℃冰箱备用。

种子老化处理 将预处理后的蒙古黄芪种子 置于恒温水浴锅（53±0.5 ℃）中进行老化 3 d 处理。

种子发芽测定 种子发芽率测定参照 ISTA （1996）方法进行 [16]，挑选大小一致的蒙古黄芪种子， 置于培养皿内的滤纸上，每皿 100 粒，3 次重复，于光 照培养箱内发芽，温度和光照控制为 15/25 ℃（高温 8 h/ 低温 16 h，高温时光照，低温时黑暗，光照强度为 36 mol m-2 s-1）逐日检查发芽种子数，第 7 天统计发芽 率和发芽指数。

发芽率=（终发芽种子数/供试种子数） 100% 发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt），式中：Gt 为 t 日发芽 数，Dt 为相应天数。

活性氧和线粒体膜电位测定 参照 Ratajczak[17] 的方法，使用DCFH-DA（2, 7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）探针检测活性氧含量。

取吸胀后的蒙古 黄芪种子，用镊子去掉种皮，切下胚轴，并用双刀片进 行徒手切片，将切片浸入 5 M DCFH-DA（用 0.01 M PBS 稀释，pH7.4），于室温黑暗下染色 30 min，然后用 PBS冲洗3 次，每次5 min。

用生物荧光显微镜（Olympus BX53） 观察并拍照，激发光和发射光波长分别为 464~495 nm（蓝色）和 515~555 nm（绿色）。

参照 Kobayashi[18]的方法，使用 JC-1 荧光染料检 测线粒体膜电位变化。

取蒙古黄芪种子胚轴的手工切 片，浸入 10 g/mL JC-1（用 0.01M PBS 稀释，pH7.4）， 于黑暗下染色 20 min，然后用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。

用生物荧光显微镜（Olympus BX53）观察并拍 照，激发光和发射光波长分别为 528~554 nm（绿色） 和 575~633 nm（红色）。

以图片灰度值表示荧光强度。

2 结果与分析
2.1 不同浓度 NAC 预处理对人工老化种子发芽指标 的影响
如图 1 所示，不同浓度 NAC 处理的蒙古黄芪种 子经人工老化 3 d 后，其发芽率和发芽指数存在显著 差异（ ＜ 0.05）。

蒸馏水对照试验的种子发芽率和发 芽指数分别为 60% 和 18.0，相比空白种子（未经人工


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老化和外援药剂预处理）分别下降 32.7% 和 40.6%； 40 mmol/L NAC 处理的种子发芽率和发芽指数最低， 分别为 13% 和 3.7；20 mmol/L NAC 处理的种子发芽 率和发芽指标稍高于 40 mmol/L NAC，分别为 41% 和 11.9；5 mmol/L NAC 处理的种子与 0 mmol/L NAC 处理 之间发芽率和发芽指数均无显著差异（ ＞ 0.05），且 高于 20 mmol/L 和 40 mmol/L NAC 处理，而 10 mmol/L NAC 处理的种子发芽率和发芽指数显著高于其他处 理（ ＜ 0.05），发芽率为 78.7%，发芽指数为 24.9，相 比 0 mmol/L NAC（蒸馏水）处理，其发芽率提高 31.2%， 发芽指数提高38.3%。

以上研究结果表明，低浓度 NAC 处理有益于种子活力的保持，可提高种子老化后的发 芽率和发芽指数，而高浓度 NAC 可能对种子有毒害 作用导致种子活力降低，且 10 mmol/L NAC 预处理能有 效提高种子抗老化能力，发芽指标显著高于蒸馏水处理。

A
100
发牙率（%） Germination rate
80
60
40
. All Righ2t0 s Reserved.
0
0
5 10 20 40
NAC 浓度（ mol/L）
NAC concentrations
B
30
发牙指数 Germination lndex
25
20
15
10
5
0 0
5
10 20
40
NAC 浓度（ mol/L）
NAC concentrations
注：图中不同小写字母表示药剂不同浓度处理之间差异显著（ ＜ 0.05），下 同。

: The different lowercase letters in the figure indicate that there is a significant difference between treatments with different concentrations of the agents ( ＜ 0.05), the same as below.
图 1 不同浓度 NAC 处理对种子老化后发芽指标的影响 Fig. 1 The effect of different concentrations of NAC treat-
ments on the germination indicator of seeds after aging
2.2 不同浓度 CsA 处理对人工老化蒙古黄芪种子发 芽指标的影响
如图 2 所示，不同浓度 CsA 预处理对老化后蒙 古黄芪种子活力影响不同。

随着 CsA 浓度升高，种子 老化后其发芽率和发芽指标整体呈先降低后上升，之 后基本保持恒定。

与 蒸馏水空白处理相比，30 mol/L
CsA 预处理再老化 3 d 后，种子发芽率和发芽指数下 降，分别为 55.3% 和 15.5；60 mol/L CsA 处理的种 子发芽率和发芽指标未发生显著变化（ ＞ 0.05）； 90 mol/L CsA 处理的种子发芽率和发芽指数分别提 高 16.2% 和 21.1；120 mol/L 处理的种子发芽率和发 芽指数分别提高 14.5% 和 16.1，但与 90 mol/L CsA 处理组无显著差异（ ＞ 0.05）。

说明适宜浓度的 CsA 可以有效提高种子活力，且在一定浓度之上再提高其 浓度，种子发芽指标不再提高。

A
80
发牙率（%） Germination rate
60
40
20
00
30
60
90 120
CsA 浓度（ mol/L）
B 25
CsA concentrations
发牙指数 Germination lndex
20
15
10
5
0 0
30
60
90 120
CsA 浓度（ mol/L）
CsA concentrations
图 2 不同浓度 CsA 预处理对种子老化后发芽指标的影响 Fig. 2 The effect of different concentrations of CsA treat-
ments on the germination indicator of seeds after aging
2.3 外源药剂处理对人工老化蒙古黄芪种子活性氧 含量的影响
应用 DCFH-DA 探针标记蒙古黄芪种子胚轴中 的活性氧，分析不同浓度 NAC 预处理对种子老化后 其胚轴内活性氧含量变化的影响。

如图 3 所示，不加 活性氧探针的阴性对照整个视野都没有荧光信号，表 明没有自发荧光干扰（图 3 a）；未进行老化处理的种子 胚轴，可见有微弱的绿色荧光，表明胚轴内有少量的活 性氧（图 3 b）；蒸馏水预处理后老化 3 d 的种子胚轴， 可见较亮的绿色荧光（图 3 c），说明种子在老化 3 d后 其胚轴内活性氧明显增加；10 mmol/L NAC 预处理后 再老化 3 d 的种子胚轴（图 3 d），其绿色荧光较蒸馏水 预处理后老化 3 d 处理的种子胚轴弱，说明 10 mmol/L NAC 预处理能大幅减少种子胚轴内的活性氧积累；


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特
产
90 mol/L CsA预处理后再老化 3 d的种子胚轴（图 3 e）， 其绿色荧光强度明显低于图 3 c，略高于图 3 d，说明
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90 mol/L CsA 预处理有助于减轻老化过程中种子胚 轴的活性氧积累。

60
灰度值 Ｇ ray level
40
20
0
a
b
c
d
e
不同处理 Different treatment
注：（a）不加活性氧探针的阴性对照，（b）未老化处理，（c）蒸馏水预处理后老化 3 d，（d ）10 mmol/L NAC 预处理后老化 3 d，（e）90 mol/L CsA 预处理后老化 3 d （bar=100 m）。

: (a) negative control without active oxygen probe, (b) unaged treatment, (c) aged 3 d after pretreatment with distilled water, (d) aged 3 d after pretreatment with 10 mmol/L NAC, (e) aged 3 d after pretreatment with 90 mol/L CsA.
图 3 外源药剂处理对种子活性氧含量的影响 Fig. 3 The effect of exogenous medicament treatments on the active oxygen content of seed hypocotyls
2.4 外源药剂处理对人工老化蒙古黄芪种子线粒体 膜电位的影响
. All线粒Ri体g是ht机s体R供e能se的r主ve要d细.胞器，而线粒体膜电
位是维持线粒体内氧化磷酸化、产生 ATP 的先决条件。

用特异性荧光染料 JC-1 对不同处理的种子胚轴线粒 体膜电位进行检测。

如图 4 所示，不加 JC-1 染料的阴 性对照（图 4 a）未检测到荧光信号，表明种子胚轴没有 自发荧光干扰；未进行老化处理的种子胚轴（图 4 b），其
红色荧光强，表明其线粒体膜电位（△ m）高；蒸馏水 预处理后老化 3 d 的种子胚轴（图 4 c），其红色荧光 弱，膜电位低；经 10 mmol/L NAC 预处理后再老化 3 d 的种子胚轴（图 4 d），其红色荧光较强，膜电位较高；经 90 mol/L CsA 预处理后再老化 3 d 的种子胚轴（图 4 e）， 其红色荧光较弱，膜电位较低。

以上结果表明 NAC 和 CsA 预处理能有效提高老化种子的线粒体膜电位。

灰度值 Ｇ ray level
70
60
50
40
30
20
10
0
a
b
c
d
e
不同处理 Different treatment
注：（a）不加 JC-1 的阴性对照，（b）未老化处理，（c）蒸馏水预处理后老化 3 d，（d ）10 mmol/L NAC 预处理后老化 3 d，（e）90 mol/L CsA 预处理后老化 3 d（bar=20 m）。

: (a) Negative control without JC-1, (b) unaged treatment, (c) aged 3 d after pretreatment with distilled water, (d) aged 3 d after pretreatment with 10 mmol/L NAC,
(e) aged 3 d after pretreatment with 90 mol /L CsA.
图 4 外源药剂处理对蒙古黄芪种子线粒体膜电位的影响 Fig. 4 The effect of exogenous medicament treatments on the mitochondrial membrane potential of Astragalus mongolica seeds


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3 讨论
3.1 活性氧引起种子活力降低 种子衰老是一个复杂的量变到质变的连续过程，
表现出形态、物理化学反应和生理生化代谢等一系列 变化 [19]。

种子衰老的原因和机理有多种解释，包括膜 系统损伤、有毒物质积累、酶活性降低、内源激素不平 衡和核酸蛋白质等大分子物质降解等多个方面。

在种 子衰老的众多理论中，被广泛接受的是衰老的自由基 学说[20]，认为种子在其生长发育过程中不断进行的有 氧代谢产生了活性氧自由基，在种子采收贮藏期间随 时间延长不断积累，过量的活性氧攻击生物膜，诱导发 生脂质过氧化作用，并且抑制了种子内抗氧化系统的 形成，造成种子内活性氧产生和清除失衡，膜脂过氧化 程度加剧，表现为丙二醛含量大幅增加，致使体内维持 细胞正常生理活性的酶失活及 DNA 降解等，诱导细 胞死亡，种子活力降低[21-23]。

本试验中，蒙古黄芪种子经人工老化后，其活性氧 含量上升，线粒体膜电位降低，导致细胞功能异常，种 子活力降低。

而经 10 mmol/L NAC 预处理的种子，其 胚轴活性氧含量降低，线粒体膜电位升高，种子发芽率
.和A发ll芽指Ri数g都ht有s显R著e提se升r，v可ed能.是由于 NAC 提高了
细胞内非酶抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）的含 量，清除了多余的活性氧（ROS），增强了细胞抗氧化能 力，从而减轻了细胞的氧化损伤 [24]，增强了种子的抗 老化能力，延缓了种子衰老。

3.2 线粒体参与种子老化过程
衰老的自由基学说不断发展完善，形成现在的脂 质过氧化学说和衰老的线粒体学说。

衰老的线粒体学 说认为，线粒体的呼吸电子传递链是种子内源性 ROS 产生的主要部位，在种子的衰老过程中，线粒体中活性 氧积累导致其最先发生氧化损伤，进而引起细胞功能 异常，加速种子衰老死亡[25]。

在种子老化过程中，ROS 攻击线粒体膜中不饱和脂肪酸，脂质过氧化作用破坏了 线粒体膜的完整性，线粒体发生膨胀，增加的电子漏反 过来进一步促进ROS的产生和积累，形成恶性循环[26]。

线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化产生 ATP 的先决条件，同时也能反应出线粒体内膜通透性 和细胞活性[27]。

活性氧和膜损伤可以相互作用，Wang 等[28]在烟草研究中发现，ROS可以使线粒体通透性转 变孔（MPTP）持续性开放，分子质量大的物质可非选 择性进入孔道，此时线粒体发生肿胀、外膜破裂，线粒 体膜电位下降。

膜电位的持续降低甚至完全崩解会导 致 ATP 产生不足，凋亡诱导因子释放，活性氧进一步 积累，启动 PCD 加速种子的老化[29,30]。

Wang等[10]在榆树种子老化研究中，发现活性氧与 线粒体通透性转换孔组分的表达呈正相关，导致细胞 氧化还原电位失衡，线粒体外膜破裂，跨膜电位（△ m） 丧失，ATP 产生水平下降，最终细胞发生程序性死亡。

而线粒体膜通透性转换孔的不正常开放可以被抗坏血 酸（AsA）和 CsA 有效缓解，通过 AsA 和 CsA 预处理 可以减缓膜电位的损失，降低人工老化对种子活力的 影响。

本试验中，蒙古黄芪种子经人工老化后，其活性氧 含量升高，线粒体膜电位下降，种子活力大幅下降，而 经 90 mol/L CsA 预处理的种子，其活性氧含量减少， 线粒体膜电位有所提高，种子的发芽率和发芽指标 显著高于蒸馏水处理的种子，可能是因为 CsA 抑制了 MPTP 开放，减少了细胞色素 c 和其他凋亡因子的释 放，减轻了种子老化过程中线粒体结构与功能的损伤， 保证了 ATP 的供应，在一定程度上抑制了细胞凋亡， 使种子活力下降速度减缓。

4 结论
本研究结果表明，蒙古黄芪种子老化后其活性氧 含量增加，线粒体膜电位下降，种子发芽率和发芽指数 降低。

采用适宜浓度的 NAC 和 CsA 预处理蒙古黄芪 种子，可以减少种子老化过程中活性氧的积累，抑制线 粒体膜电位下降，增加种子抗老化能力，提高种子活力。

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2021 年第 43 卷第 6 期
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