DNA重组质粒的构建概述
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❖ 质粒可自行失去或经人工处理而消失
❖ 可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相 容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故 彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）
（四）人工构建质粒的基本元件
❖ 启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复 制
❖ 抗性基因：用于筛选阳性克隆。 ❖ 多克隆位点：插入外源基因。 对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等. 易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离
基因克隆示意图载体dna限制性内切酶切开目的基因重组体宿主细胞已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素epo组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体干扰素是治疗癌症的重要物质人血液中每升只能提取005g干扰素因而其价格昂贵
❖ 质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细 胞复制自身染色体的同一组酶系。
质粒DNA的特征
➢ 质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。 （单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）
严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝；
松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝
❖ 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制 和分配到子细胞的过程中相互竞争。
❖ 质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。
❖ 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转 移与丢失。
纯化、重组等等。
pBR322 plasmid 是 一个克隆载体，作为 一个克隆载体最基本 的要求都具备：
复制起点:Ori
克隆位点:EcoR I; Hind III;Bam HI; Sal I
筛选标记:Ampr。
T-vector PCR产物亚克隆载体
T—Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的
❖
3、Patience is bitter, but its fruit is sweet. (Jean Jacques Rousseau , French thinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。10:516.17.202110:516.17.202110:5110:51:196.17.202110:516.17.2021
❖
15、一年之计，莫如树谷；十年之计 ，莫如 树木； 终身之 计，莫 如树人 。2021年6月上 午2时9分21.6.2702:09June 27, 2021
❖
16、提出一个问题往往比解决一个更 重要。 因为解 决问题 也许仅 是一个 数学上 或实验 上的技 能而已 ，而提 出新的 问题， 却需要 有创造 性的想 像力， 而且标 志着科 学的真 正进步 。2021年6月27日星期 日2时9分34秒 02:09:3427 June 2021
❖
5、You have to believe in yourself. That's the secret of success. ----Charles Chaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Thursday, June 17, 2021June 21Thursday, June 17, 20216/17/2021
多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了 EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两
侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应 时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用 本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
T-vector 克隆PCR产物时用高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟～1小时) 完 成连接反应，大大地方便了实验操作。
组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发
的需要。
❖ 基因克隆示意图
载体DNA (限制性内切酶切开)
＋
目的基因
＋
宿主性克隆株
表达
胰岛素
人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体
❖
4、All that you do, do with your might; things done by halves are never done right. ----R.H. Stoddard, American poet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行6.17.20216.17.202110:5110:5110:51:1910:51:19
❖
重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增
DNA片段和载体的酶切 片段DNA与载体的连接
载体： plasmid（primary） 工具酶：限制性内切酶
连接酶
常见的基因工程载体
载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起 复制与表达的运载工具。
❖ 根据来源：plasmid; phage; viral; BAC; YAC
例：
干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取 0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗 传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体 做法是：
从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之 与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而 用酵母菌来产生干扰素。
质粒(Plasmid)
质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体 之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链 闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的 双链DNA分子，大小从1K-200Kb。
❖ 通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责 编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生 存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿 主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗 生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌 素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。
真核生物表达载体
（mammalian expression vector)
真核生物表达载体的结构单元
复制起点（真核和原核） 克隆位点 筛选标记(原核和真核标记）
增强子/启动子﹡ PolyA ﹡ 终止信号
Location of Features PCMV IE: CMV IE enhancer: 1-659 CMV IE promoter: 669-750 Intervening sequence (IVS): 890-1022 T7 RNA polymerase promoter: 1067-1085 Multiple cloning site: 1085-1137 T3 RNA polymerase promoter: 1158-1137 SV40 fragment containing polyadenylation signal: 1167-1388 f1 origin of replication: 1483-1938
酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的 时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且 成本也较低。
DNA重组操作过程
ab
b
剪切
载体
A 外源DNA片段
外源DNA插入
重组 Ab
引入宿 主细胞
抗性筛选
重组筛选
❖
9、要学生做的事，教职员躬亲共做； 要学生 学的知 识，教 职员躬 亲共学 ；要学 生守的 规则， 教职员 躬亲共 守。21.6.2721.6.27Sunday, June 27, 2021
❖
17、儿童是中心，教育的措施便围绕 他们而 组织起 来。上 午2时9分34秒 上午2时 9分02:09:3421.6.27
❖ 2、Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity. (Richard Nixon, American President )命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二一年六月十七日2021年6月17日星期四
❖ 根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核 生物表达载体
❖ 根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体
❖ 基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几 种常见的载体。
载体的基本结构单元： 1.复制起点 2.克隆位点 3.筛选标记 其他条件： 4.适当大小 5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分 离纯化、重组等等。
EGFP expression cassette: 2002-3455 SV40 enhancer/early promoter: 2002-2420 EGFP structural gene: 2449-3168 Kozak consensus translation initiation site: 2442-2452 Start codon (ATG): 2449-2451; Stop codon: 3166-3168 Insertion of Val at position 2: 2452-2454 GFPmut1 chromophore mutations (Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr): 27312735 His-231 to Leu mutation (A-->T): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 3182-3455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (b-lactamase) gene: 3449-4709 Start codon (ATG): 3849-3451 Stop codon (TAA): 4707-4709
噬菌体载体
❖ λ噬菌体(λphage)
外源DNA：9~23kb 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系
DNA重组质粒的构建
医学生物所 病毒免疫室
基因克隆 gene cloning
应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或 细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝。
核心技术：DNA重组技术 （ recombinant DNA technique ）
❖
10、阅读一切好书如同和过去最杰出 的人谈 话。02:09:3402:09:3402:096/27/2021 2:09:34 AM
❖
11、一个好的教师，是一个懂得心理 学和教 育学的 人。21.6.2702:09:3402:09Jun-2127-J un-21
❖
12、要记住，你不仅是教课的教师， 也是学 生的教 育者， 生活的 导师和 道德的 引路人 。02:09:3402:09:3402:09Sunday, June 27, 2021
用途 克隆PCR产物。 对克隆后的PCR产物使用M13 primers进行DNA测序。
原核生物表达载体 Bacterial expression vector
原核生物表达载体的基本结构单元包括：
复制起点
克隆位点
筛选标记
启动子﹡ 转录终止序列﹡ 核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序 列（翻译识别）
13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成 。21.6.2721.6.2702:09:3402:09:34June 27, 2021
❖
14、谁要是自己还没有发展培养和教 育好， 他就不 能发展 培养和 教育别 人。2021年6月 27日星 期日上 午2时9分34秒 02:09:3421.6.27
基因克隆的基本程序：
分—切—接—转—筛
PCR
酶切
连接 转化&转染
目的基因DNA片段的获得
抗性或标记筛选
外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组
重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞
重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定
目的基因或其表达产物的纯化和鉴定
基因克隆技术的特点： 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重
❖ 可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相 容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故 彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）
（四）人工构建质粒的基本元件
❖ 启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复 制
❖ 抗性基因：用于筛选阳性克隆。 ❖ 多克隆位点：插入外源基因。 对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等. 易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离
基因克隆示意图载体dna限制性内切酶切开目的基因重组体宿主细胞已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素epo组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体干扰素是治疗癌症的重要物质人血液中每升只能提取005g干扰素因而其价格昂贵
❖ 质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细 胞复制自身染色体的同一组酶系。
质粒DNA的特征
➢ 质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。 （单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）
严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝；
松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝
❖ 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制 和分配到子细胞的过程中相互竞争。
❖ 质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。
❖ 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转 移与丢失。
纯化、重组等等。
pBR322 plasmid 是 一个克隆载体，作为 一个克隆载体最基本 的要求都具备：
复制起点:Ori
克隆位点:EcoR I; Hind III;Bam HI; Sal I
筛选标记:Ampr。
T-vector PCR产物亚克隆载体
T—Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的
❖
3、Patience is bitter, but its fruit is sweet. (Jean Jacques Rousseau , French thinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。10:516.17.202110:516.17.202110:5110:51:196.17.202110:516.17.2021
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15、一年之计，莫如树谷；十年之计 ，莫如 树木； 终身之 计，莫 如树人 。2021年6月上 午2时9分21.6.2702:09June 27, 2021
❖
16、提出一个问题往往比解决一个更 重要。 因为解 决问题 也许仅 是一个 数学上 或实验 上的技 能而已 ，而提 出新的 问题， 却需要 有创造 性的想 像力， 而且标 志着科 学的真 正进步 。2021年6月27日星期 日2时9分34秒 02:09:3427 June 2021
❖
5、You have to believe in yourself. That's the secret of success. ----Charles Chaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Thursday, June 17, 2021June 21Thursday, June 17, 20216/17/2021
多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了 EcoR V 识别位点，用EcoR V 进行酶切反应后，再在两
侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应 时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用 本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
T-vector 克隆PCR产物时用高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟～1小时) 完 成连接反应，大大地方便了实验操作。
组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发
的需要。
❖ 基因克隆示意图
载体DNA (限制性内切酶切开)
＋
目的基因
＋
宿主性克隆株
表达
胰岛素
人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体
❖
4、All that you do, do with your might; things done by halves are never done right. ----R.H. Stoddard, American poet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行6.17.20216.17.202110:5110:5110:51:1910:51:19
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重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增
DNA片段和载体的酶切 片段DNA与载体的连接
载体： plasmid（primary） 工具酶：限制性内切酶
连接酶
常见的基因工程载体
载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起 复制与表达的运载工具。
❖ 根据来源：plasmid; phage; viral; BAC; YAC
例：
干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取 0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗 传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体 做法是：
从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之 与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而 用酵母菌来产生干扰素。
质粒(Plasmid)
质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体 之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链 闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的 双链DNA分子，大小从1K-200Kb。
❖ 通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责 编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生 存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿 主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗 生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌 素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。
真核生物表达载体
（mammalian expression vector)
真核生物表达载体的结构单元
复制起点（真核和原核） 克隆位点 筛选标记(原核和真核标记）
增强子/启动子﹡ PolyA ﹡ 终止信号
Location of Features PCMV IE: CMV IE enhancer: 1-659 CMV IE promoter: 669-750 Intervening sequence (IVS): 890-1022 T7 RNA polymerase promoter: 1067-1085 Multiple cloning site: 1085-1137 T3 RNA polymerase promoter: 1158-1137 SV40 fragment containing polyadenylation signal: 1167-1388 f1 origin of replication: 1483-1938
酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的 时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且 成本也较低。
DNA重组操作过程
ab
b
剪切
载体
A 外源DNA片段
外源DNA插入
重组 Ab
引入宿 主细胞
抗性筛选
重组筛选
❖
9、要学生做的事，教职员躬亲共做； 要学生 学的知 识，教 职员躬 亲共学 ；要学 生守的 规则， 教职员 躬亲共 守。21.6.2721.6.27Sunday, June 27, 2021
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17、儿童是中心，教育的措施便围绕 他们而 组织起 来。上 午2时9分34秒 上午2时 9分02:09:3421.6.27
❖ 2、Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity. (Richard Nixon, American President )命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二一年六月十七日2021年6月17日星期四
❖ 根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核 生物表达载体
❖ 根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体
❖ 基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几 种常见的载体。
载体的基本结构单元： 1.复制起点 2.克隆位点 3.筛选标记 其他条件： 4.适当大小 5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分 离纯化、重组等等。
EGFP expression cassette: 2002-3455 SV40 enhancer/early promoter: 2002-2420 EGFP structural gene: 2449-3168 Kozak consensus translation initiation site: 2442-2452 Start codon (ATG): 2449-2451; Stop codon: 3166-3168 Insertion of Val at position 2: 2452-2454 GFPmut1 chromophore mutations (Phe-64 to Leu; Ser-65 to Thr): 27312735 His-231 to Leu mutation (A-->T): 3143 Bovine growth hormone (BGH) gene fragment containing polyadenylation signal: 3182-3455 SV40 origin of replication: 2318 Ampicillin resistance (b-lactamase) gene: 3449-4709 Start codon (ATG): 3849-3451 Stop codon (TAA): 4707-4709
噬菌体载体
❖ λ噬菌体(λphage)
外源DNA：9~23kb 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系
DNA重组质粒的构建
医学生物所 病毒免疫室
基因克隆 gene cloning
应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或 细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝。
核心技术：DNA重组技术 （ recombinant DNA technique ）
❖
10、阅读一切好书如同和过去最杰出 的人谈 话。02:09:3402:09:3402:096/27/2021 2:09:34 AM
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11、一个好的教师，是一个懂得心理 学和教 育学的 人。21.6.2702:09:3402:09Jun-2127-J un-21
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12、要记住，你不仅是教课的教师， 也是学 生的教 育者， 生活的 导师和 道德的 引路人 。02:09:3402:09:3402:09Sunday, June 27, 2021
用途 克隆PCR产物。 对克隆后的PCR产物使用M13 primers进行DNA测序。
原核生物表达载体 Bacterial expression vector
原核生物表达载体的基本结构单元包括：
复制起点
克隆位点
筛选标记
启动子﹡ 转录终止序列﹡ 核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序 列（翻译识别）
13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成 。21.6.2721.6.2702:09:3402:09:34June 27, 2021
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14、谁要是自己还没有发展培养和教 育好， 他就不 能发展 培养和 教育别 人。2021年6月 27日星 期日上 午2时9分34秒 02:09:3421.6.27
基因克隆的基本程序：
分—切—接—转—筛
PCR
酶切
连接 转化&转染
目的基因DNA片段的获得
抗性或标记筛选
外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组
重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞
重组DNA 分子克隆的筛选和鉴定
目的基因或其表达产物的纯化和鉴定
基因克隆技术的特点： 1. 可在体外人工的, 有目的的, 根据需要进行基因的重