MPF的研究历程

Nurse回忆说："我发现这个遗传学方法相当好。 "所以在他拿到phD学位后，就来到了英国 Edinburgh大学工作，也开始在另一种酵母--裂 殖酵母中来找细胞周期基因，跟Hartwell一样， 也很快拿到一系列突变基因，也叫“wee”突变， 它们作用在酵母进入有丝分裂的初期，其中 wee2,也就是Nurse开始称为cdc2的基因，被他 证明是控制细胞分裂起始的。Nurse后来又转 到了Sussex大学，稍后又来到Oxford，期间他 跟同事一起发现cdc2基因编码一种蛋白激酶， 而且他们发现cdc2跟Hartwell在 裂殖酵母中发 现的cdc28有相似之处。就此看来，Nurse的获 奖有一定程度上要感谢那部破机器。
2 Willian Wasserman 和Dennis Smith (Puidue大学) 1978发表一篇关于MPF在早期两栖动物发育过

程中的行为报告
3 他们推断： MPF 在早期胚胎中表现的 活性只是在卵母细胞中显示出的活性的 剩余部分 4 但Wasserman和Smith发现MPF的活性 在与细胞周期的变化相关的卵裂过程中 表现出明显的波动 5 例如人们发现从受精后30-60min内正在 分裂的蛙卵中取出的细胞质表现出很小 甚至不表现出可以被人们发现的 MPF 活 性（通过将未成熟的卵母细胞注射进去 进行化验得知）


6 如果孕酮只是通过在卵母细胞外面表面、 介导，从而诱导成熟，那么如果将激素 注入卵母细胞内，卵母细胞将没有任何 反应。 7 激素在细胞表面的活动诱发了卵母细胞 质里的次级变化，导致生发泡破裂和与 成熟相关的其他变化

二、 1 为了解更多的细胞质对诱发成熟的反应 变化， Yoshio Masui(Toronto 大学 ) 和 Clement Market(yale大学)开始了一系列实验。他们取走 经孕酮处理的不同阶段的单独的蛙卵母细胞， 将供体细胞质的 40 — 60 纳米注入完全生长的不 成熟未经处理的卵母细胞中。 2 他们发现，从卵母细胞（孕酮处理后的第12 小时的卵母细胞）取出的细胞质对受体有很微 小甚至没有影响。 3 然而，这一时期之后，细胞质获得了这种在 受体细胞内诱导成熟的能力。 4 从供体卵母细胞取出的细胞质在经孕酮处理 20小时后表现出最大效力，到40小时效力开始 下降
试验研究—— 山重水复与柳 暗花明
试验研究——山重水复与柳暗 花明

Paul Nurse和Tim Hunt是20多年的好朋友，他 们有很多共同点，比如都是研究错综复杂的细 胞分裂的分子舞蹈的先驱，都在Britain‘s Imperial Cancer Research Fund(ICRF)工作。 Nurse是Director－general而Hunt则是细胞周 期调控实验室的主任。据Nurse说，他们两个 的性格是互补的。而今，这两个好朋友又多了 一个共同点，他们一起分享了2001年的科学界 最高荣誉--诺贝尔奖。
利兰· 哈特韦尔 蒂莫西· 亨特 Leland H. R. Timothy (Tim) Hartwell Hunt 美国 英国 弗雷德· 哈钦森癌 帝国癌症研究基 症研究中心 金 美国西雅图 英国伦敦 b 1939年 b 1943年
保罗· 纳斯 Sir Paul M. Nurse 英国 帝国癌症研究基 金 英国伦敦 b 1949年

6 但是如果细胞质是在受精之后的第90 分钟从受精卵中取出来的，那么就能够 再次发现MPF的活性 7 MPF 的活性在受精后的第 120 分钟达 到顶峰，在第150分钟活性开始下降 8 第180分钟第一次细胞浆移动时，卵内 没有发现MPF的任何活性 9 第二次减数分裂进行时，MPF活性又 一次出现，在受精后的第225分钟达到顶 峰，然后又下降到一个非常低的水平。

10 在爪蟾的卵中发现了相似的实验结果， 只是MPF 活性的波动比在Rana中更迅速， 与此活性相关的是：在爪蟾早期胚胎中受 精卵分裂速率更快 11 因此MPF活性在两栖类中消失和再现的 时间长短与细胞周期长度有关 12 在这两个物种中， MPF 活性尖峰的出现 符合核膜裂解的时间，也是细胞进入减数 分裂的开始 13 这些发现表明：MPF不仅仅是简单的控 制卵母细胞成熟的时间，事实上它可能在 调控分裂细胞的细胞周期方面发挥着至关 重要的作用


Figure1
5 然而，从早期胚胎中取出的细胞质能继续表 现出诱导卵母细胞成熟的能力。 6 Masui 和Markert推断细胞质的实质是：即 作为促成熟因子诱导受体卵母细胞成熟。这就 是现在为人所知的MPF

三、 1 因为那时“MPF与诱导卵母细胞成熟有 很大关系”只是假设，所以开始的时候，人们 对MPF作用机制和其实质几乎没怎么关注
1987年，Nurse又在人中分 离出cdc2同源的cdk1。这样， 整个细胞周期的调节的分子 机制的脉络就清晰了。
MPF 研究历程
Yoshio Masui(Toronto大学) 和 Clement Market(yale大学
一、当两栖动物的卵母细胞临近卵子发 生的末期时，大细胞核（生发小泡）向 细胞外围移动 2 随后，核被膜分解。在靠近卵母细胞动 物极的地方，凝聚的染色体沿中期板 （赤道板）排列，经过第一次减数分裂， 产生次级卵母细胞和一个极体。
MPF的研究历程 及其 特性描述
耿伟平 1020800005 韩娇娇1020800007
生物学专业词汇
Amphibian 两栖动物 Oocyte 卵母细胞 Germinal vesicle 生发小泡 Steroid 类固醇 Hormone 激素 Progesterone 孕酮 Donor 供体 Recipient 受体 MPF(maturation promoting factor）成熟促进因 子
?2解决这个问题遇到的困难之一就是不同种生物的影响?3mpf最初是在两栖动物中研究的而周期蛋白是在海胆和clams中研究?4有证据表明在蛙卵母细胞中存在一个非活性的mpf分子前体库在第一次减数分裂期间可以转变为有活性的mpf?5另一方面周期蛋白在clam卵母细胞中完全看不到但受精之后不久便会出现?6ruderman想到周期蛋白a是mpf的活化状态九1与此同时另一个关于纯化和描述mpf活性物质的实质的研究开始了19801980californiacalifornia大学的berkeleyberkeley通过铵盐沉降蛋白质在柱层析仪中加入再溶通过铵盐沉降蛋白质在柱层析仪中加入再溶解物质提纯了解物质提纯了mpfmpf的大学的michealmichealwuwu和和johnjohngerhartgerhart的20203030折叠部分折叠部分?3纯化的mpf的注射物除了刺激卵母细胞成熟外还刺激进入两栖动物卵母细胞的蛋白质中?4当部分纯化的mpf制剂和32patp在体外培养时蛋白质发生磷酸化这表明mpf作为一种蛋白激酶诱导成熟?十mpf被最后纯化出来?2在这些纯化的制剂中mpf的活性与两个多肽有关32kd另一条多肽分子量为45kd?3纯化的mpf制剂具有较高水平的蛋白激酶活性能够利用带有放射性32p的atp合成蛋白质?4当纯化的制剂被培养在32patp中发现45kd的多肽被标记上1988年经过6步成功的层析一条多肽分子量是?十一1到1980年末揭示周期蛋白mpf作用的研究渐渐与另一个关于裂殖酵母的研究融合到一起这个裂殖酵母的研究是由oxford大学的paulnurse和他的同事做的?2研究表明酵母产生一种分子量为34kd的蛋白激酶这种蛋白激酶的活性是细胞进入m期所必需的?3这种酵母蛋白质被称为p34cdc2或简单称为cdc2?4酵母与两栖动物研究小组的合并第一次发现cdc2与mpf相联系的证据?5以前研究表明

生物专业词汇



Fertilization 受精 Xenopus 爪蟾 Mammalian 哺乳动物 Sea urchin 海胆 HeLa 海拉细胞（人宫颈癌传代细胞） yeast 酵母 Vertebrate 脊椎动物
荣获2001年诺贝尔生理学或医学奖 发现了控制细胞，Nurse同学 刚刚在East Anglia大学完成研究生课程， 他的方向是研究氨基酸代谢的，但因为 当时那个实验室的氨基酸分析仪老是不 听话，他不得不花大量的时间来 babysetting那个破机器，这就令他有足 够的空闲时间去看大量的文献，包括 Hartwell的发现。

4 从培养的 Hela 细胞 ( 人宫颈癌上皮 细胞 , 1951 年从一位名叫 Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞 培养而成)的G1早期、G2晚期、或者 s期提取的物质没有MPF活性 5 在 G2 早期， MPF 出现； G2 晚期 MPF 显著上升；在有丝分裂期 MPF 到达尖峰
与此同时，在剑桥刚完成phD的Hunt，来到 Massachusetts的Marine Biological Laboratory，他开始致力于研究海胆卵的受精 过程是如何触发蛋白质合成的，这是海胆胚胎 发育前期的重要步骤。但是这条路很快走进了 个死胡同中，难以继续。1982，Hunt开始尝 试一个他现在称为是"绝望中的疯狂"的实验方 法。他要将受精卵的蛋白质合成谱跟单性生殖 的作比较，结果是，用他的话说，"一个崭新 的发现"。在受精卵中，分裂时有种浓度较高 的蛋白的浓度会大幅度下降，然后又上升，直 到下一次分裂周期又下降。Hunt把这种蛋白 命名为cyclin，即周期蛋白。
控制细胞周期的基本分子机制是在进化过 程中是高度保守的，而且在酵母、昆虫、 植物、动物和人类中以相同的方式发挥作 用。
细胞周期调控的实际应用 The Implications of the Discoveries

癌细胞中染色体的不 稳定性可能是源于受 损的细胞周期控制。 该图显示了正常细胞 和癌细胞中相同的三 对染色体(1号、3号和 14号染色体)的差异。 在癌细胞中，染色体 数目可能会有改变(非 整倍性)，部分染色体 还有可能进行重组(以 不同颜色显示)。

四、很显然，相同的 MPF 活性时间不仅 局限在两栖动物的卵和卵母细胞中，而 且表现在许多类生物中 2 例如，人们发现，培养的正在生长的哺 乳动物细胞也具有 MPF 活性。检验方法： 将哺乳动物细胞提取物注入两栖动物卵 母细胞，诱发了生发泡的裂解 3 伴随着细胞周期的哺乳动物的 MPF 的 活性波动，和正在分裂的两栖动物卵里 的MPF的活性波动是一致的
CDK和细胞周期 蛋白是控制和协调 DNA合成、染色 体分离和细胞分裂 的重要分子。 CDK和细胞周期 蛋白一起使细胞从 一个细胞周期到下 一个细胞周期。
模式生物
Leland Hartwell —他鉴定了参与细胞周期控制的特定基因，称为CDC-基因(细胞分裂 周期基因)。其中一个基因，CDC28，控制细胞周期的第一步，即通 过G1期。 — Hartwell同时也确定了“控制点”在细胞周期控制中的基本作用。 这些控制点监控着上一阶段中所有步骤是否正确地进行了，而且保 证了细胞周期各阶段之间的正确顺序。

在20年代时，细胞周期仍 是一个黑匣子，科学家们 只是通过显微镜观察到一 些宏观上的细胞运作，至 于什么分子在调控这些过 程，人们对此一无所知， 一些科学家在拼命寻找一 个入手点，Nurse回忆说： "这就像大海捞针一样困难。 "
60年代末，美国华盛顿FredHutchinson癌症研 究中心的Hartwell，一个做酵母遗传学研究的 专家，开始把一个project交给他实验室的一个 本科生，华盛顿大学的Brian Reid，“我给了他 一些酵母的突变株，它们在高温下会形成很奇 特的形状，”Hartwell回忆说，“这些突变株 在分裂上有缺陷，所以在一两代之后就会形成 一个很大的芽。 “Hartwell马上意识到这是研究分裂的极好素 材，到了70年代早期，他已经成功的从这些突 变株中分离出一系列突变的基因，命名为cdc （cell cycle division）基因。
Paul Nurse
CDK和细胞周期蛋白 一起形成了一个酶，该 酶可以通过化学修饰作 用(磷酸化)激活其它蛋 白。CDK分子的数量 在细胞周期中保持恒定， 但是其活性在细胞周期 蛋白的调控作用下具有 较大的变化。

Tim Hunt:发现了细胞周期蛋白，即与CDK分子 相结合的蛋白。
细胞周期蛋白在每一周期中合成并降解。周期蛋白降解是细胞周期 的一个重要的控制机制。 (D = 细胞分裂)

五、在研究海胆胚胎过程中发现了另一 个调控细胞周期的因素 2 海胆的卵是研究细胞分裂的一个很合适 的材料，因为受精后的细胞有丝分裂非 常迅速，具有高度可预知的时间间隔 3 如果将海胆卵放在加有抑制剂的海水中 受精（这种抑制剂能抑制蛋白质的合成） 卵将不能进行第一次有丝分裂，而是停 留在染色质紧缩状态之前，且核被膜解 体

3 通过用类固醇激素 — 黄体酮（孕酮）， 对完整的卵母细胞进行处理，能够发现与 细胞成熟有关的过程， eg.生发泡破裂和经 过第一次减数分裂 。 4 黄体酮处理卵母细胞 13 — 18 小时期间， 生发泡在卵母细胞表面附近运动，这是能 够观察到的第一个成熟标志。 5 不久，生发泡解体。孕酮处理 36 小时后， 卵母细胞进入第二次减数分裂中期。

实际上，Hunt和Nurse分别研究了一个问题 的两个方面，进一步的工作表明，cyclin调 节cdc2一类蛋白的激酶活性，这类蛋白后来 被成为cdks，即cyclin依赖性的蛋白激酶。 实际上，cdc2跟调节它的cyclin组成的复合 物就是成熟促进因子MPF。MPF是70年代 早期由日本科学家Yoshio Masui在青蛙卵中 发现的，不过它的具体细节一直搞不清楚， 直到此时，一切谜团才被解开。1998年, Yoshio Masui与Hartwell, Nurse一起荣获the Lasker Basic Medical Research Award，不 过为什么诺贝尔奖没有他，