苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用及其分子机制研究

苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用及其分子机制研究背景：慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是造血干细胞的恶性增殖性疾病。

大约95%的CML患者的原代细胞中出现Ph染色体,核型为t(9；22)(q34；q11),其编码的Bcr-Abl融合蛋白具有异常增高酪氨酸激酶活性,是导致CML发生的主要机制。

伊马替尼(imatinib)是Bcr-Abl的靶向抑制剂,可使CML慢性期患者8年生存率(?)85%。

目前是CML慢性期患者的一线用药。

然而有资料表明,近35%的患者在治疗过程中产生了耐药性,严重影响了CML 的治疗效果。

Bcr-Abl点突变是伊马替尼耐药的主要机制,其突变发生在很多位点,而T315I位点最为常见。

更为重要的是,第二代酪氨酸激酶抑制剂如尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib)对Bcr-Abl-T3151突变无效。

迄今为止,各种酪氨酸激酶抑制剂均不
能完全清除CML患者体内Bcr-Abl阳性的白血病干细胞(leukemia stem
cell,LSC)；即使患者经过伊马替尼治疗达到完全分子学缓解,仍可以检测到LSC,这是导致CML复发的主要机制之一。

最新的研究显示,CML LSC存活不依赖于Bcr-Abl的活性。

因此,治疗CML迫切需要寻找更佳的药物,来克服T315I位点突变产生的耐药,并且彻底清除休眠
期的LSC。

从天然中药中筛选出抗肿瘤药物,不失为一条切实可行的思路。

中药苦参具
有多种活性成分,包括苦参碱(matrine)、氧化苦参碱(oxymatrine)、槐果碱(sophocarpine)、槐定碱(sophoridine)等。

其中对苦参碱的研究最为广泛。

苦参碱具有抗肿瘤、抗炎、抗肝纤维化、抗
心律失常等多方面的作用,而抗肿瘤作用近年来受到了越来越多的关注。

许多研究结果显示,苦参碱具有广谱抗肿瘤作用,且在对肿瘤细胞杀伤抑制
的同时,对正常造血细胞几乎没有影响。

这表明,苦参碱对肿瘤细胞有一定的特异性。

但是,关于苦参碱对p210-T315I突变的细胞株以及CML LSC的研究还未见报道。

为此,本研究分为两部分进行阐述： 1.苦参碱对慢性粒细胞白血病细胞生长抑制和诱导凋亡的影响研究；2.苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用的分子机制研究。

第一部分：苦参碱对慢性粒细胞白血病细胞生长抑制和诱导凋亡的影响研究
目的：探索苦参碱在体内外对CML细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。

方法：采用MTT法检测苦参主要活性成分对CML细胞株K562细胞的生长抑制作用；MTT 法检测不同浓度的苦参碱作用CML细胞株细胞和人正常肝细胞株L02细胞的生长抑制作用；集落培养法和流式细胞术检测苦参碱作用CML细胞株细胞的集落形成能力、细胞周期和细胞凋亡情况。

采用MTT法、Annexin V/PI双染法检测苦参碱作用CML慢性期、急变期、T315I突变患者原代细胞和正常对照组的细胞生长、凋亡作用。

免疫磁珠方法分
选出CML患者和正常对照的CD34+细胞,MTT法检测苦参碱作用CML患者CD34+细胞的生长抑制作用,集落培养实验和Annexin V/PI双染法比较苦参碱作用后两组的集落形成能力和细胞凋亡。

构建32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠模型,检测苦参碱对小鼠瘤体生长的影响。

结果：(1)苦参碱对K562细胞株细胞的抑制作用更为敏感,苦参碱的24小时IC50为1.37mmM,槐果碱、槐定碱和氧化苦参碱均大于 3.2mM；(2)苦参碱对K562、K562/G、32Dp210、32Dp210-T315I细胞株细胞具有生长抑制作用,明显高于L02,p
值分别为0.017、0.031、0.048、0.013；(3)苦参碱抑制K562、32Dp210-T315I 细胞株细胞的集落形成能力；(4)苦参碱不影响K562细胞株细胞的细胞周期；(5)苦参碱对K562、K562/G、32Dp210、32Dp210-T315I细胞株细胞均具有诱导凋亡作用；(6)苦参碱对CML慢性期、急变期、T315I突变患者原代细胞均具有生长
抑制作用,且明显高于正常对照组,p值分别为0.017、0.044、0.030；(7)苦参碱对CML慢性期、T315I突变患者原代细胞均具有诱导凋亡作用,浓度为1.6mM时明显高于正常对照组,p值分别为0.006、0.007；(8)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有生长抑制作用,24小时IC50为3.38mmM；(9)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有抑制克隆形成能力,明显高于正常对照组,p值分别为0.002；(10)苦参碱对CML慢性期、T315I突变患者CD34+细胞均具有诱导凋亡作用,明显高于正常对照组,p值分别为0.004、0.013；(11)苦参碱组(50mg/kg)苦参碱组(100mg/kg)均可以显著抑制32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体增长,与对照组有统计学差异,分别0.000、0.000。

结论：(1)苦参碱对CML细胞株细胞具有显著的抑制增殖和集落形成能力,并诱导细胞凋亡,而对L02细胞作用不明显；(2)苦参碱对CML患者原代细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用,明显高于正常对照；(3)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有抑制增殖和集落形成能力,并诱导细胞凋亡,而对正常对照作用不明显。

(4)苦参碱可以显著抑制32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体增长；(5)苦参碱具有低毒高效,可以克服Bcr-Abl-T315I突变、CML LSC引起的耐药。

第二部分：苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用的分子机制研究目的：探索苦参碱对CML细胞株细胞、CML CD34+细胞的信号转导通路的影响。

方法：采用Western blot检测苦参碱作用K562,32Dp210-T315I细胞株细胞后Bcr-Abl及其下游通路
PI3K/Akt、JAK/STAT、Ras/RAF/MEK/ERK关键蛋白的表达变化；Western blot
检测苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞的β
-catenin/c-Myc通路关键蛋白及其Caspase家族蛋白的表达变化；实时定量PCR 方法检测苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞的c-Myc的表达变化；免疫组织化学的方法检测32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc; c-Myc抑制剂10058-F4联合苦参碱作用K562,32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,用MTT法、Annexin V/PI双染法检测细胞生长、凋亡；用siRNA (small interfering RNA)沉默THP-1细胞株细胞的c-Myc基因,通过MTT法、Annexin V/PI双染法检测c-Myc基因沉默后对苦参碱作用THP-1的影响；Caspase抑制剂z-VAD-fmk作用于K562、3(?)p210-T315I细胞株细胞
和CML患者CD34+细胞,用MTT法检测z-VAD-fmk对苦参碱作用的影响。

结果：(1)苦参碱并不能明显引起p-Bcr-Abl、Bcr-Abl以及下游的PI3K、p-Akt、 P-STAT5、p-ERK等信号分子的变化；(2)苦参碱作用K562、32Dp210-T315I 细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,(3-catenin、c-Myc蛋白水平均出现明显下调,并伴随Caspase-9、Caspase-3和]PARP不同程度的激活；(3)苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,c-Myc mRNA水平出现明显
下调；(4)与对照组相比,苦参碱组32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc 蛋白表达显著降低；(5)10058-F4预处理K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML 患者CD34+细胞后给予苦参碱,可增强苦参碱的细胞抑制作用,p值分别为0.007、0.001、0.003；同时可增强苦参碱诱导K562细胞株细胞和CML患者CD34+细胞凋亡的能力,p值分别为0.002、0.008；(6)沉默THP-1的c-Myc基因后给予苦参碱,可增强苦参碱的生长抑制作用,p值为0.001；同时增强苦参碱诱导凋亡能力,
当苦参碱浓度为0.8、1.6mM时p值分别为0.013、0.004；(7)z-VAD-fink处理K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后给予苦参碱,可部分逆转苦参碱的抑制作用,p值分别为0.003、0.021、0.002。

结论：(1)苦参碱不依赖Bcr-Abl,而是通过下调β-catenin/c-Myc通路,从而诱导
K562,32Dp210-T315I细胞株细胞以及CML CD34+细胞的凋亡；(2)苦参碱可以降低32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc蛋白表达；(3)c-Myc抑制剂可以增强苦参碱对K562、32Dp210-T315I细胞株细胞以及CML C D34+细胞的生长抑制和诱导凋亡作用；(4)沉默c-Myc可以增强苦参碱对THP-1细胞株细胞的生长抑制和诱导凋亡作用；(5)苦参碱诱导的凋亡在一定程度上依赖Caspase家族蛋白的活化。