黄芩素经由miR-125b-5p

◇
基础研究◇
摘要
目的：探讨黄芩素诱导人喉癌细胞凋亡的
机制。

方法：选取AMC-HN-8细胞为研究对象，以不同浓度黄芩素（0、10、30、100、300μmol/L ）作用于细胞，采用CCK -8法检测其半数抑制浓度（IC 50）；采用蛋白质印迹法（Western blot ）检测Bax 、cleaved-caspase-3、Cyto-c 、IRF4蛋白表达；RT-qPCR 检测miR-125b-5p 和IRF4的表达；双荧光素酶报告基因验证Targetscan 预测结果（miR-125b-5p 与IRF4-3'UTR 的结合）；凋亡和坏死抑制剂探索黄芩素诱导喉癌细胞的死亡方式。

再将AMC-HN-8分为：空白组、黄芩素（IC 50）、miR-125b-5p in-hibitor 组、黄芩素+inhibitor NC 组、黄芩素+miR-125b-5p inhibitor 组，细胞侵袭和克隆形成实验分别检测细胞的侵袭和增殖能力；采用流式细胞术检测细胞凋亡。

结果：黄芩素以剂量依赖性方式抑制AMC-HN-8细胞的增殖，其IC 50值为47.31μmol/L ；与空白组相比，47.31μmol/L 的黄芩素诱导了细胞凋亡和抑制了细胞侵袭，同时上调了miR-125b-5p 的表达，抑制了IRF4的mRNA 和蛋白的水平。

荧光素酶结果表明，相对于NC 模拟物（mimic ）组，miR -125b -5p mimic 能够抑制IRF4-3'UTR 启动子的活性。

黄芩素以凋亡的方式诱导喉癌细胞死亡。

另外，47.31μmol/L 的黄芩素与miR-125b-5p inhibitor 联合影响AMC-HN-8细胞行为学的结果表明，与空白组比较，黄芩素组细胞克隆数减少，侵袭能力减弱，凋亡增加；miR-125b-5p inhibitor 组细胞克隆数增加，侵袭能力加强，
凋亡减少；黄芩素+inhibitor NC 组则与黄芩素一致，inhibitor NC 对细胞行为学没有显著影响；黄芩素+miR-125b-5p inhibitor 组细胞克隆、侵袭、凋亡则介于黄芩素组与miR-125b-5p inhibitor 组之间。

结论：黄芩素能抑制AMC-HN-8细胞增殖，其机制可能与miR-125b-5p 靶向抑制IRF4的表达，诱导促凋亡蛋白Bax 、cleaved-caspase-3、Cyto-c ，抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2从而诱导细胞凋亡有关。

关键词喉癌细胞；黄芩素；细胞凋亡；miR-125b-5p ；IRF4
中图分类号：R965.2文献标志码：A
文章编号：1009-2501(2023)11-1209-10doi ：10.12092/j.issn.1009-2501.2023.11.002
MicroRNAs （miRNAs ）是一类大约有22个核苷酸的非编码RNAs ，miRNAs 通过与信使RNA 结合，在转录后调控基因的表达［1-2］。

众所周知，miRNAs 在各种人类癌症中发挥重要作用，作为癌基因或肿瘤抑制基因［3-4］。

喉癌是世界上第11种最常见的癌症，死亡率高，喉部鳞状细胞癌（11，LSCC ）约占所有喉部恶性肿瘤的85%～90%［5-6］。

尽管近年来在LSCC 治疗方面取得了一定进展，但晚期喉癌患者的临床治疗效果仍然并不理想。

在过去的20年里，晚期喉癌患者的临床结果并没有改善，这主要是由于缺乏明确的诊断，导致治疗效果下降和频繁复发［7-8］。

此外，对化疗或放疗的抵抗和手术后的高局部或区域复发率也是造成高死亡率的原因［9］。

因此，迫切需要更好地了解LSCC 潜在的分子机制，并开发更有效的诊断和治疗目标，以及更有效的诊断和治疗方法。

最近
2023-01-11收稿2023-05-30修回
西南医科大学附属中医医院联合项目课题2020XYLH-024王剑，男，硕士，副主任医师，研究方向：耳鼻咽喉头颈肿瘤。

E-mail ：*************************朱佳丽，通信作者，女，副主任医师，研究方向：耳鼻咽喉。

E-mail ：***************
黄芩素经由miR-125b-5p/IRF4轴进而促进喉癌细胞死亡并
抑制其侵袭的机制研究
王剑，孙永东，周兴玮，刘雷，陈龙，童兴科，朱佳丽
西南医科大学附属中医院，耳鼻咽喉头颈外科，泸州646000，四川
中国临床药理学与治疗学
中国药理学会主办
CN 34-1206/R ，ISSN 1009-2501
2023Nov;28(11):1209-1218
·
·1209
Chin J Clin Pharmacol Ther2023Nov;28(11)
发现的microRNAs已经被认为与喉癌的发展有关，有研究通过基因芯片、靶基因预测、pathway 分析、GO分析，发现miR-125b-5p在喉癌中表达下调［10-11］，但这种表达差异暂未在喉癌的侵袭转移中得到证实。

根据生物信息学软件预测，发现干扰素调节因子4（interferon regulatory factor4，IRF4）的3'UTR与miR-125b-5p有靶向结合位点。

重要的是，IRF4在多种癌症中表达上调［12］，推测miR-125b-5p与IRF4靶向结合参与了喉癌的发生发展。

喉癌是临床常见的恶性肿瘤之一，主要以鳞状细胞癌为主，临床症状表现为声音嘶哑、呼吸困难、咳嗽、吞咽困难和颈部淋巴结转移等症状，给患者带来了极大的痛苦［13］。

有研究证明黄芩素能够通过多种信号通路产生抗癌作用［14］，miR-NAs能够影响细胞凋亡参与喉癌的发生和发展［15］，但黄芩素调控miRNAs在喉癌中扮演何种角色，这方面的研究仍然未见报道。

因此，本研究集中探讨了黄芩素通过诱导miR-125b-5p抗喉癌生长、增殖的作用机制，通过黄芩素对喉癌细胞AMC-HN-8miR-125b-5p/IRF4轴及生物学功能的研究，为临床喉癌治疗提供实验依据和理论基础。

1材料与方法
1.1主要试剂及仪器黄芩素购自大连美仑生物技术有限公司（批号MB6699）；RPMI1640培养基（批号42401042）、胰蛋白酶（批号25200072）购自美国Gibco；RNA Trizol Reagent（批号vs18061730）购自合肥博美生物科技有限责任公司；Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green®（批号638316）购自北京宝日医生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO，A610163）购自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8试剂盒（BS350A）购自上海Biosharp 公司；Annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（KGA1030-100T）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；抗Bax（批号ab32503）、cleaved-caspase-3（批号ab32042）、Cyto-c（批号ab133504）、IFR4（批号ab124691）抗体购自英国Abcam；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0009）购自上海碧云天生物技术有限公司；BA210Digital数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团）；SpectraMAX Plus384酶标
仪（美谷分子仪器有限公司）；PIKORed96实时荧光定量（RT-PCR）仪（美国ThermoFisher仪器有限公司）。

NC mimic、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor、inhibitor NC购买于中国锐博生物。

Z-VAD-FMK和NEC-1购自美国MedChemexpress （ACE）公司。

1.2细胞培养和处理喉癌细胞AMC-HN-8在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI1640中置于37℃和5%CO2的湿润空气培养箱中进行培养。

用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，并重新悬浮在含有10%FBS的培养基中。

然后将细胞（3×105）接种到6孔培养板中，根据制造商的说明，按照实验分组使用Lipofectamine2000转染miR-125b-5p模拟阴性对照（NC mimic）、miR-125b-5p模拟物（miR-125b-5p mimic）、抑制剂NC （inhibitor NC）、miR-125b-5p抑制剂（miR-125b-5p inhibitor）。

当培养箱中的培养细胞融合到50%时，将opti-MEM培养基分别与LipofectamineTM 2000（A液）和每个序列轻轻混合（B液）孵育5 min，然后将A液和B液混合并在室温下孵育20 min。

将该混合物均匀地加入到培养基中，并置于培养箱中，等待6h后，用含有10%胎牛血清的新鲜培养基替换原培养基。

1.3CCK-8检测将AMC-HN-8细胞接种在96孔板中，并在第2天细胞贴壁后进行给药，黄芩素按照0、10、30、100、300μmol/L5个剂量孵育细胞48h后，在每孔中加入CCK-8试剂。

Z-VAD-FMK （20μmol/L）和NEC-1（10μmol/L）被用来与黄芩素联合培养48h观察细胞死亡方式。

miR-125b-5p mimic（5pmol）转染后培养48h观察细胞增殖的变化。

根据细胞计数试剂盒-8（CCK-8）的操作说明处理细胞，记录450nm处的吸光度（A）。

最后，根据细胞增殖情况绘制生存曲线。

1.4流式细胞仪分析将半融合的AMC-HN-8细胞分别转染miR-125b-5p抑制剂（miR-125b-5p in-hibitor）或抑制剂NC（inhibitor NC），或者联合黄芩素孵育。

48h后，收集所有细胞，用Annexin V-FITC（MultiSciences）和碘化丙啶（PI）进行染色。

细胞凋亡通过流式细胞仪测定，使用Annexin-V 和PI双染技术测定磷脂酰丝氨酸膜再分布。

然后用BD Caliber流式细胞仪测量凋亡细胞的数量。

··1210
中国临床药理学与治疗学2023Nov;28(11)
1.5细胞侵袭试验AMC-HN-8转染miR-125b-5p抑制剂（miR-125b-5p inhibitor）后24h进行侵袭实验，将100μL细胞悬液接种到transwell上腔，以达到8×104个细胞/腔的最终浓度。

然后，在下腔加入含10%血清的培养基。

最后，在培养48h后，取出转孔室，用结晶紫染色。

在显微镜下随机拍摄照片，收集实验数据进行分析。

1.6Western blot实验收集转染和黄芩素处理过的喉癌细胞，加入预冷的RIPA裂解缓冲液200μL，在冰上反应30min。

然后，用超声波研磨3次，每次5s。

在4℃和12000r/min下离心15 min。

将上清液在100℃下煮沸10min，然后BCA 蛋白检测试剂盒对蛋白质进行定量。

样品加载到10%聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素薄膜上（PVDF膜）。

5%脱脂奶粉在室温下摇晃并孵化1h，按1∶500比例加入一抗（an-ti-Bax、anti-cleaved-caspase-3、anti-Cyto-c、anti-Bcl-2、anti-IRF4）。

在4℃下孵育过夜后，TBST膜洗涤10min3次。

然后加入相应的二抗（1:400），在室温下孵育1h，TBST膜洗15min3次，进行化学发光反应显色。

用Image-J图像分析软件分析目标蛋白的表达水平，以同一泳道的目标蛋白与β-肌动蛋白的灰度值比作为测量结果进行比较分析。

1.7RNA提取和RT-qPCR按照制造商的说明，分别用Trizol试剂提取转染和黄芩素处理后的AMC-HN-8细胞的总RNA。

取5μg的总RNA，通过反转录反应合成cDNA。

纯化的RNA作为模板，使用miR-X miRNA第一链合成试剂盒合成cDNA。

用cDNA、miR-X miRNA qRT-PCR TB Green®试剂盒和miR-125b-5p的基因特异引物进行RT-qPCR。

所有引物都是由生工生物技术（上海）有限公司合成。

miR-125b-5p的引物序列，正向：5'-ACTTT-TATTGGTCTCAAGTCAGTGTACAG-3'，反向由miR-X miRNA qRT-PCR TB Green®Kit提供。

U6的引物序列由miR-X miRNA qRT-PCR TB Green®Kit提供。

IRF4的引物序列，正向：5'-AGAACGAGGAGAAGAG-CAT-3'，反向：5'-CCTTTAAACAGTGCCCAAG-3'。

Ac-tin的引物序列，正向：5'-CTGGTGCTGTCTGCGCTG-3'，反向：5'-CT GGGTTTCGTCTTTCTGG-3'；反应结束后，计算机自动分析每个样品的Ct值，miR-125b-5p以U6为内参对照，IRF4以actin作为内参对照，
通过2-△△Ct计算相对mRNA表达量。

1.8荧光素酶试验为了确定miR-125b-5p与IRF4之间的调节关系，本研究使用专门设计的荧光素酶载体进行了荧光素酶试验。

含有miR-125b-5p结合位点的IFR4的完整3'UTR序列被扩增并亚克隆到pcDNA载体中，生成IFR4的野生型载体（IFR4-3'UTR-WT）。

另外，再设计不含有miR-125b-5p结合位点的IFR4的3'UTR序列被扩增并亚克隆到pcDNA载体中，生成IFR4的突变型载体（IFR4-3'UTR-MT）。

将AMC-HN-8C细胞接种到24孔板中，用Lipofectamine2000将miR-125b-5p模拟物（miR-125b-5p mimic）/模拟物NC（NC mimic）（5pmol）和IFR4-3'UTR-WT/IFR4-3'UTR-MT（0.16μg）共同转染。

最后，在转染48h后，使用双荧光素酶报告测定系统对转染细胞的荧光素酶活性进行测定。

1.9统计学处理数据以平均值±标准差（xˉ±s）表示，采用SPSS17.0对组间差异进行单因素分析和Tukey多重比较检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2结果
2.1黄芩素对喉癌细胞增殖活力的影响CCK-8细胞活力测定实验结果显示，10、30、100、300μmol/L的黄芩素都能显著抑制喉癌细胞增殖（P< 0.01），且具有剂量依赖的效果（Fig.1A）。

细胞形态学观察显示空白组细胞排列紧密，且细胞形态均一，呈卵圆形生长，生长旺盛，而47.31μmol/L 黄芩素处理下，培养皿里细胞数量明显减少，细胞缩小成亮点，可见细胞碎片（Fig.1B）。

流式细胞仪检测结果显示，黄芩素处理后的喉癌细胞在II和III象限出现了早期凋亡和晚期凋亡，表明黄芩素具有较强的促进喉癌细胞AMC-HN-8凋亡的能力（P<0.01）（Fig.1C和D）。

细胞侵袭实验结果显示，与空白组比较，47.31μmol/L黄芩素处理组有较少的细胞穿过聚碳酸酯膜（P<0.01），表明黄芩素能够抑制喉癌细胞的侵袭（Fig.1E和F）。

Western blot实验结果表明，与空白组比较，凋亡调控因子Cyto-c、促凋亡蛋白Bax、凋亡标志核心蛋白cleaved-caspe3被黄芩素激活（P<0.05），抑制凋亡的蛋白Bcl-2被黄芩素抑制（P<0.05）。

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Blank group
Baicalin group
Baicalin
***********
B l a
n k g r o u
p A p o p t o Ɵc r a t e (100 %)
B a i
c a l
i n g r o u p
C e l l n u m b e r
B l a
n k g r o u
p B a
i
c a l
i n g r o u
p
2.52.01.51.00.50.0
R e l a Ɵv e p r o t e i n e x p r e s s i o n
B l a
n k
g r o u p B a i c a l i n g r o u p B l a n
k g r o u p B a i c a
l i n g r o u p B l a n k g r o u p B a i c a
l i n g r o u p B l a n
k g r o u p B a i c a
l i n g r o u p
n k g r o u p B a i c a l i n g r o u p
Bax
Bcl-2
cleaved-caspase3Cyto-c β-acƟn
Blank group Baicalin group
0 104 105 106
FITC P I
0 104 105 1060 104 105 106 107
0 104 105 106 107
Blank group
Q1-UL (0.14 %)
Q1-UR (1.45 %)
Q1-LL (96.41 %)Q1-LR (2.01 %)Q1-UL (1.25 %)
Q1-UR (13.27 %)
Q1-LL (81.18 %)Q1-LR (4.30 %)
Baicalin group
B
C
D
E
G
H
F
Fig.1Baicalein induces apoptosis in AMC-NH-8cells.
A:cell proliferation assay (CCK-8method);B:AMC-NH-8cell morphology;C:apoptosis rate (flow cytometry);D:flow cytogram;E:pictures of cell invasion;F:statistical graph of cell invasion results;G:AMC-NH-8cell Bax,Bcl-2,cleaved-caspase3,Cyto-c protein ex-pression results;H:statistical graphs of Bax,Bcl-2,cleaved Caspase-3,Cyto-c protein expression in AMC-NH-8cells.b P <0.05,c P <0.01,compared with the blank group.
2.2黄芩素对喉癌细胞miR-125b-5p/IRF4轴的影响
Fig.2A 和B 所示，与空白组比较，黄芩素作
用下miR-125b-5p 的表达显著增加（P <0.01），而IRF4mRNA 的表达显著减少（P <0.01）。

蛋白结果显示，与IRF4的mRNA 结果一致，IRF4蛋白被黄芩素显著下调（P <0.01）。

2.3
miR-125b-5p 与IRF4的靶向关系验证
Tar-
getscan 发现IRF4是miR-125b-5p 的潜在靶基因，从数据库中获得了miR-125b-5p 与IRF4的结合位点（Fig.3A ）。

IRF4选择双荧光为载体构建质粒（Fig.3B ），作为miR-125b-5p 与IRF4的靶向关系理论验证。

报告基因结果显示，与NC mimic 相比，miR-125b-5p mimic 能够显著抑制IRF4-3'UTR-wt 质粒的转录活性，而NC mimic 和miR -125b -5p mimic 对IRF4-3'UTR-mt 质粒的活性则无影响
（Fig.3C ）。

B l a n k g r o u p B a i c a l i n g r o u p
R e l a ƟR e l a ƟB l a n k g r o u p B a i c a l i n g r o u p
1.51.00.50.0
R e l a Ɵv e p r o t e i n e x p r e s s i o n o f I R F 4
B l a n k g r o u p B a i c a l i n g r o u p
B l a n k g r o u p IRF4B a i c a l i n g r o u p
β-acƟn
C
D
Fig.2Baicalein regulates the expression of miR-125b-5p and IRF4
A:expression level of miR-125b-5p;B:mRNA expression level of IRF4(CCK-8method);C:results of IRF4protein expression in AMC-NH-8cells;D:statistical graph of IRF4protein expression in AMC-NH-8cells.c P <0.01,compared with the blank group.
PosiƟon 592-599 of IRF4 3’UTR hsa-miR-125b-5p
Predicted
consequenƟal pairing of target region (top) and miRNA (boƩom)
Site type 8 mer -0.39-0.39986.8540.96
Context++ score Context++ score percenƟle Weighted context++ score Conserved branch length
PCT
5’...AUGUCUGUGCCAUUUAUCAGGGA...3’AGUGUUCAAUCCCAGAGUCCCU
1.51.00.50.0
R e l a Ɵv e l u c i f e r a s e a c Ɵv i t y
N C
m i m i c
m i R -1
25
b -
5p
m i m i c
N C
m i m i c
m
i R -1
25
b -
5p
m i m i c
MT-IRF4-3’UTR
WT-IRF4-3’UTR pSI-Check2Luciferase Luciferase
pSI-Check2
A
B
C
Fig.3Targeted inhibition of IRF4by miR-125b-5p
A:binding site map of miR-125b-5p and IRF4obtained by Targetscan;B:schematic diagram of IRF4-3'UTR dual fluorescent plasmid structure;C:statistical plot of the validation results of the targeting relationship between the dual luciferase reporter gene miR-125b-5p and IRF4.c P <0.01,compared with NC mimic group.
2.4黄芩素对喉癌细胞凋亡蛋白的影响与空白组比较，黄芩素抑制了细胞增殖（P <0.01）；与黄芩素组比较，ZVAD-FMK 促进了喉癌细胞增殖（P <0.01），NEC-1则没有效果（Fig.4A ）。

与空白组比较，miR-125b-5p mimic 抑制了喉癌细胞增殖（P <0.05）；与黄芩素组比较，黄芩素和miR-125b-5p
mimic 联合作用下凋亡细胞进一步增加（P <0.05）（Fig.4B ）。

Western blot 实验结果表明，与黄芩素组比较，miR-125b-5p inhibitor 下调了Bax 、cleaved caspase-3和Cyto-c 的表达，上调了Bcl-2。

黄芩素与miR-125b -5p inhibitor 联合则能抵消掉miR-125b-5p inhibitor 的部分作用（Fig.4C 和D ）。

·
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Nov;28(11)
B l a n k B a i c a l e i n B a i c a l e i n +Z V A D -F M K
B a i c a l e i n +N E
C -1
B l a n k
C e l l v i a b i l i t y (O
D )
B a i c a l e i n B a i c a l e i n +N
C m i m i c B a i c a l e i n +m i R -125b -5p m i m i c
m i R -125b -5p m i m i c N C m i m i c s Blank Baicalein
Baicalein+NC mimic
Baicalein+miR-125b-5p mimic
miR-125b-5p mimic R e l a Ɵv e p r o t e i n e x p r e s s i o n
B l a n k Bax Bcl-2
cleaved-caspase3Cyto-c β-acƟn
B a i c a l e i n B a i c a l e i n +N
C m i m i c B a i c a
l e i n +m i R -125b -5p m i m i c
m i R -125b -5p m i m i c B
C
D
Fig.4Baicalein and miR-125b-5p mimic promote apoptosis in laryngeal carcinoma cells
A:CCK-8detects the effect of apoptosis and necrosis inhibitors on cell proliferation;B:effect of miR-125b-5p mimic on the prolifera-tion of laryngeal carcinoma cells;C:Bax,Bcl-2,cleaved Caspase-3,Cyto-c protein expression results;D:statistical results of protein expression.b P <0.05,c P <0.01,compared with the blank group.e P <0.05,f P <0.01,compared with the Baicalein group.
2.5黄芩素通过miR-125b-5p/IRF4轴对细胞增
殖、凋亡的影响
Western blot 结果显示，与空白
组比较，黄芩素抑制了IRF4的表达（P <0.05），miR-125b-5p inhibitor 对IRF4有一定诱导作用，inhibi-tor NC 对黄芩素的抑制作用没有影响，而miR-125b-5p inhibitor 则能逆转黄芩素的抑制作用（Fig.5A 和B ）。

克隆形成实验结果显示，与空白组比较，黄芩素抑制了形成的克隆数量（P <0.05），inhibitor NC 对黄芩素的抑制作用没有影响，而miR-125b-5p inhibitor 则能逆转黄芩素的抑制作用（Fig.5C 和D ）。

细胞侵袭实验结果表明，miR-125b-5p inhibitor 能够一定程度上恢复黄芩素减弱的喉癌细胞侵袭能力（Fig.5E 和F ）。

流式细胞凋亡结果显示，与空白组相比，黄芩素组、黄芩素+inhibitor NC 组AMC-HN-8细胞凋亡率显著增加（P <0.05）。

与黄芩素组相比，黄芩素+miR -125b-5p inhibitor 组AMC-HN-8细胞凋亡率显著降低（P <0.05）（Fig.5G 和H ）。

3讨论
细胞凋亡是一种程序性死亡过程，其中半胱天
冬酶的激活导致线粒体膜通透性和形态发生变化，
导致程序性细胞死亡［16］。

促凋亡蛋白Bax 在细胞质中普遍存在［17］，接收到凋亡信号后，Bax 在线粒体
表面重新定位，并在线粒体膜上形成一个孔，导致膜电位降低，膜通透性增加，从而导致凋亡因子的
释放［18］。

Bcl-2家族蛋白存在于线粒体外膜中，能
改变线粒体通透性并降低线粒体膜电位，通过线粒体外膜通透性将可溶性蛋白从线粒体膜间隙释放到细胞质或将它们转移到细胞核，如细胞色素C 外渗、线粒体易位至细胞核、刺激含半胱氨酸的天冬
氨酸蛋白级联反应和诱导细胞凋亡［19］。

Cyto-c 能
够影响凋亡通路caspase-9/caspase-3促进细胞凋
亡［20］。

caspase-3在半胱氨酸依赖性细胞凋亡中起
决定性作用，连续激活caspase-3可导致PARP-1（poly ADP-ribose polymerase ，DNA 修复酶）裂解并丧失其酶促修复活性，使DNA 损伤修复困难并导致
细胞凋亡［21-22］。

本研究结果表明，黄芩速素能够抑
制喉癌细胞AMC-NH-的增殖和诱导细胞凋亡，并促进细胞caspase-3蛋白的切割，增加cleaved-caspae-3的表达。

此外，黄芩速素上调促凋亡蛋白Bax 、Cy-to-c ，下调凋亡抑制蛋白Bcl-2，提示黄芩素可能通
中国临床药理学与治疗学2023Nov;28(11)
过凋亡途径抑制喉癌细胞的增殖。

B l a n k g r o u p IRF4300
2001000
R e l a Ɵv e p r o t e i n e x p r e s s i o n o f I R F 4
N u m b e r o f c l o n e s f o r m e d B a i c a l e i n g r o u p m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p B a i c a l e i n +i n h i b i t o r N C g r o u p B a i c a l e i n +m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p
Blank group Baicalein group
miR-125b-5p inhibitor group Baicalein+inhibitor
NC group
Baicalein+miR-125b-5p inhibitor
group
Blank group Baicalein group
miR-125b-5p inhibitor group Baicalein+inhibitor
NC group
Baicalein+miR-125b-5p inhibitor
group
Blank group
Baicalein group
miR-125b-5p inhibitor group
Baicalein+inhibitor
NC group
Baicalein+miR-125b-5p inhibitor
group
B l a n k
g r o u p B a i c a l e i n g r o u p m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p B a i c a l e i n +i n h i b i t o r N C g r o u p B a i c a l e i n +m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p
B l a n k g r o u p B a i c a l e i n g r o u p m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p B a i c a l e i n +i n h i b i t o r N
C g r o u p B a i c a l e i n +m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p
β-acƟn
b
b
150
100500
N u m b e r o f i n v a s i v e c e l l s B l a n k g r o u p B a i c a l e i n g r o u p m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p B a i c a l e i n +i n h i b i t o r N C g r o u p B a i c a l e i n +m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p
b
b
2520151050
A p o p t o Ɵc r e t a (100 %)
B l a n k g r o u p B a i c a l e i n g r o u p m
i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p B a i c a l e i n +i n h i b i t o r N C g r o u p B a i c a l e i n +m i R -125b -5p i n h i b i t o r g r o u p
c
c
0 104 105 1060 104 105 1060 104 105 1060 104 105 1060 104 105 106
0 104 105 106 107
0 104 105 106 107
0 104 105 106 107
0 104 105 106 107
0 104 105 106 107
Q1-UL (0.14 %)
Q1-UR (2.07 %)
Q1-LL (95.54 %)Q1-LR (2.25 %)Q1-UL (0.73 %)
Q1-UR (13.06 %)
Q1-LL (80.58 %)Q1-LR (5.64 %)Q1-UL (0.12 %)
Q1-UR (0.96 %)
Q1-LL (98.30 %)Q1-LR (0.63 %)Q1-UL (0.43 %)
Q1-UR (12.55 %)
Q1-LL (82.75 %)Q1-LR (4.28 %)Q1-UL (0.53 %)
Q1-UR (8.25 %)
Q1-LL (89.76 %)Q1-LR (1.46 %)
FITC
P I
A
B
C
D
F G
E
H
Fig.5Effect of baicalin on AMC-NH-8cell behaviour via miR-125b-5p/IRF4axis
A:IRF4protein results;B:IRF4protein statistics;C:clone formation number statistics;D:clone formation graph;E:statistical graph of cell invasion results;F:pictures of cell invasion;G:apoptosis rate (flow cytometry);H:flow cytometry graph.b P <0.05,c P <0.01,compared with the blank group.
然而，黄芩素促进凋亡的机制还有待进一步研究。

miR-125b-5p 广泛表达于机体各种组织和
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Chin J Clin Pharmacol Ther2023Nov;28(11)
器官，参与了肿瘤生长、神经性损伤等疾病发生，能够对细胞生长和凋亡进行调控［23-26］。

先前研究表明，miR-125b-5p属于抑癌分子，在皮肤鳞癌、黑色素瘤等疾病中低表达，过表达miR-125b-5p 抑制癌症和肿瘤细胞的增殖［27］。

另外，microR-NAs作为非编码RNA是通过与靶基因的3'非翻译区（3'-UTR）结合来调节基因的表达［28］。

本研究通过Targetscan发现，miR-125b-5p能够靶向IRF4-3'-UTR。

双荧光素酶报告基因结果显示，miR-125b-5p mimic能够抑制IRF4-3'-UTR-MT的活性，再次验证了Targetscan的预测结果。

另外，miR-320c、miR-27a-3p和miR-30a-5p，这些miRNAs与Tregs中的IRF4结合并抑制IRF4的活性，调节在人类癌症中的Treg分化中发挥作用［29-30］。

同时，阻断IRF4蛋白可以消除骨髓瘤癌细胞［12］。

本研究结果表明，miR-125b-5p inhibitor作用下IFR4蛋白表达水平增加，细胞克隆和侵袭能力增加、凋亡减少，提示过表达的IFR4可能会促进肿瘤细胞的生长。

黄芩素作用下miR-125b-5p表达水平增加，IFR4蛋白表达水平降低，提示黄芩素作用下过表达的miR-125b-5p可能抑制了IFR4的表达，与Tar-getscan的预测结果一致。

综上所述，黄芩素诱导喉癌细胞AMC-NH-8的miR-125b-5p的高表达，并通过miR-125b-5p靶向抑制IRF4的表达，进而诱导促凋亡有关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、Cyto-c的水平，下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，促使喉癌细胞凋亡。

另外，miR-125b-5p可能成为LSCC诊断和预后的标志物，为黄芩素作为一种抗癌药物治疗喉癌的潜在用途提供了初步的见解。

我们将进一步阐明miR-125b-5p促进细胞死亡依赖于IRF4的具体机制，通过先敲低内源IRF4再过表达不受miR-125b-5p影响的突变型IRF4，检测miR-125b-5p直接通过IRF4进而调控肿瘤细胞死亡。

通过IRF4互作蛋白的筛选和检测，进一步揭示黄芩素促进喉癌细胞死亡的分子机制。

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Chin J Clin Pharmacol Ther2023Nov;28(11) Baicalein promotes laryngeal cancer cell death and inhibits invasion via miR-125b-5p/IRF4axis
WANG Jian,SUN Yongdong,ZHOU Xingwei,LIU Lei,CHEN Long,TONG Xingke,ZHU Jiali Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southwest Medical University,Luzhou646000,Sichuan,China
ABSTRACT AIM:To investigate the mechanism of baicalin-induced apoptosis in human laryngeal can-cer cells.METHODS:AMC-HN-8cells were selected for the study,and baicalin was applied to the cells at different concentrations(0,10,30,100,and300μmol/L),and the half-inhibitory concentration(IC50) was measured by the CCK-8method.Bax,cleaved-caspase-3,Cyto-c,IRF4protein expression by pro-tein blotting(Western blot);miR-125b-5p and IRF4 expression by RT-qPCR.Dual-luciferase reporter gene validation of Targetscan prediction(binding of miR-125b-5p to IRF4-3'UTR);apoptosis and necro-sis inhibitors explore the way baicalein induces death in laryngeal cancer cells.AMC-HN-8was then divided into blank group,baicalein(IC50),miR-125b-5p inhibitor group,baicalein+inhibitor NC group,baicalein+miR-125b-5p inhibitor group,and cell invasion and clone formation assays to detect cell invasion and proliferation ability,respectively. Apoptosis was detected by flow cytometry.RE-SULTS:Baicalein inhibited the proliferation of AMC-HN-8cells in a dose-dependent manner with an IC50value of47.31μmol/pared with the blank group,47.31μmol/L baicalin induced apopto-sis and inhibited cell invasion,while upregulating the expression of miR-125b-5p and suppressing the mRNA and protein levels of IRF4.The luciferase re-sults showed that the miR-125b-5p mimic was able to inhibit the activity of the IRF4-3'UTR promoter relative to the NC mimic(mimic)group.Baicalein induces laryngeal cancer cell death in an apoptotic manner.In addition,the combination of47.31μmol/L baicalin and miR-125b-5p inhibitor affected the behavior of AMC-HN-8cells,showing that com-pared with the blank group,the baicalin group showed a decrease in the number of cell clones, weakened invasion ability,and increased apoptosis; the miR-125b-5p inhibitor group showed an in-crease in the number of cell clones,enhanced inva-sion ability and decreased apoptosis.The baicalin+ inhibitor NC group was consistent with baicalin, with no significant effect of inhibitor NC on cell be-havior.The cloning,invasion,and apoptosis of cells in the baicalin+miR-125b-5p inhibitor group were intermediate between the baicalin and miR-125b-5p inhibitor groups.CONCLUSION:Baicalin inhibits the proliferation of AMC-HN-8cells,and the mech-anism may be related to miR-125b-5p targeting to inhibit the expression of IRF4,inducing the pro-apoptotic proteins Bax,cleaved-caspase3,and Cyto-c,and inhibiting the apoptosis suppressor protein Bcl-2thereby inducing apoptosis. KEYWORDS laryngeal cancer cells;baicalein; apoptosis;miR-125b-5p;IRF4
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