《金属铜离子与蛋白》PPT课件

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蓝铜蛋白（I型铜蛋白）的谱学特征主要 有：
紫外光谱在590～625 nm范围内有很强的 LMCT吸收（配体到金属的电荷跃迁）；
电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细 偶合常数非常小，这是由于Cu-S键的共价性 较大、键长较短造成的；
与一般铜配合物的氧化还原电位（约160 mV） 相比，I型铜蛋白的氧化还原电位都比较高 （200～700 mV）。
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最后采用电化学微分脉冲伏安法研究了Cu2+与 Fe2+间的作用过程，进一步证实了紫外光谱得到 的结论。
亚铁血红素离子以铁为中心体，形成6配位的正八 面体弱场。按晶体场理论，Cu2+外层电子的3d9结 构比Fe2+的3d6结构更容易形成稳定的配合物，导 致Cu2+在与血红素中的Fe2+进行竞争配位反应时 获得优势，使得铜离子取代了血红素中的亚铁离 子，从而使得体系的电化学性质及紫外光谱图都 发生了一定程度的变化。
金属铜离子与蛋白质
编辑ppt1ຫໍສະໝຸດ 内容：研究的目的及意义 铜与血清白蛋白 铜与血红蛋白 铜蛋白和铜酶
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研究目的及意义
在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应， 如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼 吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成； 作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。
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N-端三肽链 (HSA为Asp1-Ala2-His3 ,BSA为A sp1Thr2-His3)公认是Cu2+(Ⅱ)的强结合位点。通常金 属离子与Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2个去 质子肽氮(加上轴向的Asp1的羧基)配位,形成平面 四边形(四方锥)构型。
N-端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于 His咪唑基N的配位能力,还有三肽链的灵活易变, 可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型。
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肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红 素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构 又被称为珠蛋白。
血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在 卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原 子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第 8位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子 平面的上方与亚铁离子配位结合。
血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅 由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常 以BSA( bovine serum albumin, 牛血清白蛋白) 和 HSA( human serum albumin, 人血清白蛋白)为研 究对象。
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人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗 传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白 模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载 体等。
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左：2μmol/L血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫 外光谱图
右：血红蛋白与铜离子相互作用时随时间变化的紫外光谱 图
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由此推测，Cu2+的加入，破坏了血红蛋白中芳香族的共轭 结构；而血红素400nm处的soret吸收峰随着时间的变化 逐渐减弱,于是，在不含铜离子的2μmol/L血红蛋白溶液中 滴加不同浓度的Fe2+ ，发现随着Fe2+的加入，400nm处的 吸收峰增强。
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• 氧化型质体蓝素的结构基本上不随pH变化而变化，而
还原型质体蓝素的结构随pH变化而变化，当pH较低时，
His87发生质子化，而且其咪唑环发生旋转不再与铜离子
配位。
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Ⅰ型铜蛋白—阿祖林(天青蛋白)
它是从荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等细菌中分 离得到的，相对分子质量为14600～17000，含有 一个铜离子，氧化还原电位为280～340 mV。在 电子传递体系中，阿祖林将电子传递给细胞色素， 但供电子体尚不清楚。
BSA分子由583个氨基酸残基组成。而HSA比 BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。 两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116 位和585位的残基。
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荧光光谱法
由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 残基,从而能发出荧光。在这些基团中Trp起主要 作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般认为 蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。
Cu2Zn2－SOD中含有两个相同的亚基，其中每个亚 基中含有一个Cu2+和一个Zn2+，他们通过一个组氨酸 侧链上的咪唑基团桥联。两个亚基之间主要是通过非 共价键的疏水作用缔合在一起。
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铜锌SOD
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铜锌SOD中每个铜离子与四个组氨酸侧链上的咪 唑氮原子配位，形成一个变形的四边形，还有一 个水分子在轴向上与铜离子配位，使铜离子为五 配位的变形四方锥构型。每个锌离子为四配位的 变形四面体构型，由三个组氨酸侧链的咪唑氮原 子和一个天冬氨酸的羧基氧原子与锌离子配位而 成。
在这个酶中,Cu2+可能决定了酶的催化特异性，而 Zn2+ 则可能起到稳定蛋白质结构的作用。但全酶 的活性需要两只协同作用。
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含铜氧载体--Ⅲ型铜蛋白
Ⅲ型铜蛋白的主要特点是在其活性中心含有两 个铜离子，并且两个铜离子之间存在强的相互 作用。
典型代表有血蓝蛋白和酪氨酸酶。 血蓝蛋白是一种氧载体，存在于蜗虫、章鱼等
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按活性结构中含铜原子的个数又可分为单核、 双核和多核铜蛋白。
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含铜电子传递蛋白--Ⅰ型铜蛋白
目前已知的Ⅰ型铜蛋白都是参与电子传递反应 的铜蛋白，该类蛋白一般呈深蓝色，所以也称 蓝铜蛋白。
根据晶体结构，I型铜蛋白中铜的配位环境为 N2SS*，即两个His侧链上的咪唑氮原子、一 个Cys侧链上的硫原子和一个Met侧链上的硫 原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结 构。
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Ⅰ型铜蛋白—质体蓝素
质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光 合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿 体。质体蓝素的分子质量约为11000 D，氧化 还原电位为370 mV左右。
它的活性中心的铜处于变形的四面体构型，由 两个His侧链上的咪唑氮原子、一个Cys侧链上 的硫原子和一个Met侧链上的硫原子与铜配位。
型的四方锥配位构型； (3) 电子光谱中吸收强度减弱； (4) 电子自旋光谱中超精细偶合常数变大。
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Ⅱ型铜蛋白中的铜一般处于配位不饱和状态，即留有 空位，从而可以结合底物分子，并进行催化反应。
代表蛋白：铜锌超氧化物歧化酶（铜锌SOD），它能 有效地催化分解超氧负离子，是一种很好的抗氧化剂， 起到保护生物体的作用。
测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液 前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子 后，不论加入的铜离子浓度有多大，在280nm处的吸 收峰均消失，而其400nm附近的强吸收峰则随着铜离 子浓度的增大降低越来越明显(下图左)，表明铜离子 浓度越大，对蛋白质π~π*跃迁带的破坏性越大。
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血红素与血红蛋白结构
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当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子 从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红 蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。 血红素与它周围的疏水性氨基酸残基依靠范德 华力保持确定的空间构象。
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铜离子与血红蛋白相互作用
血红蛋白在280nm附近有一个吸收峰，这是由于蛋白 质中芳香族氨基酸共轭键的紫外吸收所致，在400nm 附近有一个索瑞(soret)吸收峰，这是血红素卟啉环的 π~π*跃迁带，为强吸收峰。
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铜离子与血红蛋白
1. 血红蛋白简介
血红蛋白（Hemoglobin,简称Hb）在体内担任的 功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉 血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧 化碳经静脉血送到肺再排出体外。
血红蛋白化学式为 C3032H4816O812N780S8Fe4 其分 子量约为64500，是含有4个肽链的四聚体。它是 由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基， 血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分 子构成。
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铜蛋白和铜酶
金属酶的成键方式、配位环境和空间结构与配位化合 物极为类似。配位化学的理论观点和方法可以用来模 拟金属酶生物活性配合物的结构以及结构-性质-功能 的关系, 推定作用机理。
通过配体的设计和剪裁合成出与天然酶活性中心结构 相似的模型配合物, 模拟酶的结构和功能, 这对没有获 得单晶结构、功能及反应机理尚不完全清楚的金属酶 特别适用, 可以得到一些从天然酶研究中不可能得到 的信息。对铜蛋白以及含铜金属模拟酶的研究是近年 来仿生化学工作者研究的热点之一。
表明400nm处的吸收峰是血红素Fe2+形成的卟啉环的特征 吸收峰。血红蛋白在370nm处无明显的吸收峰，当铜离子 加入后，此处吸收峰明显增强。当反应进行了9小时后， 形成了一个很宽的吸收带，推测是Cu2+取代Fe2+后与血红 素卟啉环所形成铜络合物的吸收峰。
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左：铜离子、铁离子与血红蛋白反应的紫外光谱图 右：铜离子与血红蛋白反应16小时的紫外光谱图
在阿祖林的活性中心中，两个His的咪唑氮原子和 一个Cys的硫原子形成一个三角形，Met上的硫原 子和一个蛋白链中的酰胺氧原子分别从三角形的 两边与中心铜离子有弱配位作用。
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Ⅱ型铜蛋白--铜锌超氧化物歧化酶
与Ⅰ型铜蛋白相比，Ⅱ型铜蛋白活性中心在谱 学上有几点变化：
(1) 铜的氧化还原电位向正的方向移动； (2) 与铜配位的原子由硫变为氮或氧，铜采取典
当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或 少数金属离子(稀土离子)荧光的改变,由此可进行 定性、定量研究蛋白质构象的变化。
常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数 和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋 白质分子中色氨酸残基之间的距离。
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荧光淬灭可以分为静态淬灭和动态淬灭。能降 低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧 光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物, 且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝 灭。而激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光 猝灭则称为动态猝灭。
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铜蛋白质参与生物体内的电子传递、氧化还原、 氧的输送以及活化过程。铜蛋白质按其光谱性 质可分为三类:
Ⅰ型铜, 600nm 附近有非常强的吸收, 具有小 的超精细偶合常数;
Ⅱ型铜, 具有一般铜(Ⅱ) 配合物相近的分子吸 光系数和超精细偶合常数;
Ⅲ型铜, 两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用, 在 330nm 附近存在强吸收。
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图:Cu2+对BSA溶液荧光发射光谱的影响
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研究发现Cu2+能够明显猝灭BSA自身的特征荧 光光谱,并且这种猝灭作用随着Cu2+的浓度的 增大而增强。由于BSA自身的特征荧光主要是 其色氨酸残基(Trp)产生的,表明随着Cu2+浓度 的增加,BSA的骨架结构发生了较大变化,使Trp 暴露出来,造成BSA的荧光猝灭,猝灭机理主要 为静态猝灭。
甲壳类和软体类动物的血液中。
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还原型血蓝蛋白
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还原型血蓝蛋白的活性中心含有两个一价铜离子， 每个铜离子与三个组氨酸侧链的咪唑氮原子配位， 两个铜离子之间未发现桥联配体。两个铜离子之 间的空腔正好容纳一个氧分子。
氧化型血蓝蛋白中尽管铜离子为二价d9构型，但 由于两个二价铜离子之间存在很强的反铁磁相互 作用，以致在室温条件下，该双核铜活性中心呈 抗磁性。氧分子结合到血蓝蛋白后，以过氧负离 子状态存在
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C uII
O C uII
O
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酪氨酸酶
酪氨酸酶存在于哺乳动物中，具有两种不同的 催化活性，它既可以催化氧化邻苯二酚（儿茶 酚），又可以催化对甲苯酚的羟基化反应，即 酪氨酸酶具有儿茶酚酶和甲苯酚酶的活性。L酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化为L-多巴， 进一步被氧化生成皮肤黑色素。
但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的 氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异 反应，导致蛋白质的错误折叠；与其它物质竞争酶的 活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体 的DNA、蛋白质和脂类物质 。
所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。
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铜与血清白蛋白
血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许 多内源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重 要的储存和输运作用。