缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成

缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的
形成
赵楠;孙保存;赵秀兰;孟洁;董学易;古强
【摘要】目的模拟缺氧微环境分析缺氧条件下BCL-2表达及其对核凝集形成的影响,探讨线形程序性坏死(linearly patterned programmed cell necrosis,LPPCN)样细胞核凝集形成的分子机制.方法利用CoCl2缺氧模型模拟肿瘤细胞缺氧微环境,以B16黑色素瘤细胞系作为研究对象观察核凝集出现时肿瘤细胞的变化;利用伤口愈合实验、SRB实验评价缺氧对肿瘤细胞迁移、增殖的影响;应用Western blot 和RT-PCR检测缺氧对凋亡相关分子BCL-2蛋白和RNA表达的影响;利用免疫荧光技术观察缺氧对BCL-2表达定位的影响.结果缺氧36 ～48 h后,采用Hochest 33342活体细胞染色,荧光显微镜下可见30％以上胞核呈高度凝集状态,表现为单个凝集体或多个连接的小凝集体,未见明显的凋亡;缺氧可以明显抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力;在缺氧条件下,BCL-2表现出随时间变化的特征性表达谱,与肿瘤细胞核凝集出现的时间一致.结论缺氧可诱导肿瘤细胞核凝集的形成,呈现与LPPCN细胞同样的特点;缺氧条件下存活的肿瘤细胞表现出更强的运动潜能;缺氧条件下抗凋亡蛋白BCL-2表达高峰的形成可能与核凝集有关.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2015(031)011
【总页数】6页(P1258-1262,1266)
【关键词】缺氧;核凝集;BCL-2
【作者】赵楠;孙保存;赵秀兰;孟洁;董学易;古强
【作者单位】天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052;天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052;天津医科大学肿瘤医院病理科,天津 300060;天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052;天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052;天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052;天津医科大学病理学教研室,天津300070;天津医科大学总医院病理科,天津300052
【正文语种】中文
【中图分类】R730.2
缺氧区域的存在是进展期实性肿瘤的特征性生理特点，缺氧环境可以使某些特定区域的肿瘤细胞发生附加的基因突变，从而获得更强的增殖或侵袭能力促进肿瘤生长[1,2]，在肿瘤演进和转移中发挥重要作用。

血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是最早于1999年Maniotis等[3]报道的一种不依赖内皮细胞的全新肿瘤内血液供应模式。

VM是由于缺氧而形成的坏死性“裂隙”进而引流血液后形成。

本课题组前期工作通过对肿瘤局部微环境模式的变化和形态学的特征提出一个新概念，即线形程序性坏死(linearly patterned programmed cell necrosis, LPPCN)[4]。

LPPCN是一种肿瘤组织中具有一定空间分布特点的线状或条带状坏死区带，形态学上表现为线形排布的固缩肿瘤细胞。

相同组织区域范围内LPPCN与微血管分布的向量分析及三维重建图像显示LPPCN与肿瘤新生微血管的分布和走行趋势及空间构造趋于一致。

作者由此推测，LPPCN正是VM空间结构形成的基础。

前期研究中动物模型及人体标本的免疫组化分析均提示LPPCN的形成与抗凋亡BCL-2家族蛋白的作用密切相关。

本实验选取黑色素瘤作为肿瘤模型，在体外观察LPPCN样固缩肿瘤细胞形成的条件及特点，初步探讨LPPCN形成的分子机制。

1.1 细胞系 C57/BL小鼠来源黑色素瘤细胞系B16F10细胞系(以下简称B16)培养
条件为RPMI1640培养基(Hyclone)，含10%胎牛血清(Hyclone)和1%双抗(青霉素和链霉素)，37 ℃ 5%CO2恒温条件下培养。

1.2 缺氧模型的建立 B16细胞常规培养24 h后，更换无血清培养基；加入CoCl2，使其终浓度分别为：0、50、100、150、200、250、300、400 μmol/L，平行8个孔；在0、12、24、36、48 h镜下观察细胞形态的变化；于48 h收集细胞进
行细胞计数分析，并确定最佳缺氧浓度。

1.3 细胞增殖实验收集对数生长期细胞，0、12、24、36、48、72 h共6个时间点分别取样；用预冷的50% TCA液固定；静置后将细胞培养板移至4 ℃放置1 h；每孔加100 μl SRB，室温放置10 min；1%HAC清洗，空气干燥；结合的SRB
用10 mmol/L非缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解；570 nm处测定细胞吸光度OD 值。

1.4 细胞伤口愈合实验接种细胞5×105个，以过夜能铺满为宜；以20 μl Tip在
板底作垂直于记号线的划痕；以PBS或培养液洗细胞后更换无血清培养液或缺氧
处理，此时记作0 h；放入37 ℃ 5%CO2培养箱，分别于0、12、24、36、48、72 h取样、拍照，记录每一个“伤口宽度”，结果进行统计学分析。

1.5 免疫荧光观察建模，在取样时间点弃去培养基；37 ℃ PBS轻柔冲洗细胞；冷甲醇室温固定细胞；室温PBS轻柔冲洗细胞；5%FBS封闭液室温封闭30 min，
弃去封闭液；加入封闭液稀释一抗溶液，37 ℃孵育1 h；室温PBS轻柔冲洗细胞；加入封闭液稀释荧光二抗溶液(1 ∶100稀释)，室温避光孵育1 h；室温避光PBS
轻柔冲洗细胞；防荧光淬灭封片剂封固；荧光显微镜观察并拍照。

1.6 RT-PCR检测采用Trizol(Invitrogen)法提取细胞总RNA，质控鉴定后进行逆转录反应(逆转录酶为Tiangen公司Quantium酶)，逆转录步骤严格按照试剂盒
说明书进行。

采用Sybrgreen(Applied Biosystems)法检测细胞总RNA的相对表
达量。

采用7500HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA)进行PCR扩增。

引物信息如下：BCL-2上游引物5′-TGAACCGGCATCTGCACACCT-3′，下游引物5′-TGGGGCAGGTTTGTCGACCTCA-3′;GAPDH上游引物5′-CCTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3′，下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。

1.7 Western blot检测 RIPA冰上裂解细胞，蛋白煮沸，室温冷却；12 000
r/min离心，加入5×Loading buffer上样；8%或10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；湿转，300 mA，1～1.5 h；封闭过夜；封闭液稀释一抗，37 ℃孵育1 h；TBST
洗3次；封闭液稀释HRP标记二抗，室温孵育2 h；TBST洗5次；加入ECL反
应液，暗室内X光片曝光；Bandscan 5.0分析软件读取条带灰度值。

BCL-2抗体(Santa Cruz公司，N-19Sc-492，1 ∶200)。

1.8 明胶酶谱明胶酶谱主要用于检测MMP-2和MMP-9的活性。

细胞裂解采用
不含还原剂和EDTA的上样缓冲液裂解，不经煮沸直接上样，以含0.1%明胶的10%SDS-PAGE分离蛋白，随即用50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)洗胶5次；37 ℃孵育20 h，取出后考马斯亮蓝R250染色，脱色，可见负染带。

凝胶成像并翻转
颜色后分析条带灰度值。

1.9 统计学分析所有数据采用SPSS 13.5软件进行统计学分析，分别采用t检验
和多组比较单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 缺氧模型的构建常规培养细胞，待细胞生长至70%时汇合加入CoCl2，使其
终浓度分别为：0、50、100、150、200、250、300、400 μmol/L，平行8个孔。

缺氧24～36 h后，相差显微镜下观察可见B16黑色素瘤细胞在无CoCl2条
件下呈梭形，细胞膜边界清楚，折光性好，伪足明显；CoCl2浓度为150 μmol/L 时细胞生长开始受到抑制，伪足回缩；CoCl2浓度增加到200 μmol/L时，细胞
表现为球形；随着CoCl2浓度的增加，细胞形态变化更为明显。

细胞抑制实验表明低浓度的CoCl2可促进B16细胞增殖，随着剂量的加大，CoCl2表现出对B16细胞较强的抑制作用，剂量达150 μmol/L即开始产生较明显的抑制效果，且抑制作用呈明显的量效关系(图1)。

进一步采用明胶酶谱法检测不同CoCl2浓度时B16细胞分泌的MMP-2和MMP-9活性可知，CoCl2浓度为200 μmol/L时，MMP-2和MMP-9的活性最强(图2)。

综上所述，本实验选用200 μmol/L为CoCl2为最终缺氧浓度。

2.2 缺氧对肿瘤细胞核凝集、增殖和迁移能力的影响
2.2.1 缺氧对肿瘤细胞核凝聚的影响缺氧36～48 h后，采用Hoechst 33342活体细胞染色，荧光显微镜下观察可见大量异形胞核存在，几乎所有胞核均有核深染区，30%以上胞核呈高度凝集状态，表现为单个凝集体或多个连接的小凝集体，少数细胞异常核分裂，未见明显的凋亡；而对照组则可以观察到胞核形状规则，大小一致，核仁清晰(图3)。

2.2.2 缺氧对肿瘤细胞增殖的影响缺氧可以明显抑制肿瘤细胞的增殖。

本实验采用SRB法检测缺氧对肿瘤细胞增殖的影响，结果显示与正常氧条件相比，缺氧组肿瘤细胞增殖活性明显下降，对照组0 h时肿瘤细胞增殖活性稍低于缺氧组，而对照组24～48 h时肿瘤细胞增殖活性为缺氧组的1.3倍，二者差异具有统计学意义(P<0.05，图4)。

2.2.3 缺氧对肿瘤细胞迁移能力的影响采用伤口愈合实验检测肿瘤细胞迁移能力，结果可见缺氧48 h后对照组伤口完全愈合，缺氧组大部分肿瘤细胞的迁移能力被抑制，但在伤口区可观察到部分迁移能力较强的细胞，在相差显微镜下呈球形，这部分细胞可能是适应缺氧环境而存活下来的细胞，它们可能较对照组肿瘤细胞具有更强的迁移能力(图5)。

2.2 缺氧条件对BCL-2表达的影响为进一步研究缺氧对肿瘤细胞核凝集的影响，
探讨其分子机制，本组从蛋白水平和RNA水平检测BCL-2表达的变化。

结果显示，在正常氧条件下，抗凋亡蛋白BCL-2的表达随时间推移而下降；在缺氧条件下，BCL-2表现出随时间变化的特征性表达谱：BCL-2随缺氧时间的延长表达逐渐上升，在36 h时达高峰，随之下降(图6)。

实时定量RT-PCR检测亦表现出与之一
致的结果(图7)。

为进一步了解BCL-2的表达，本组采用免疫荧光法观察缺氧后BCL-2的定位。

缺氧12 h后，BCL-2主要定位于胞质。

当缺氧时间延长至36 h，BCL-2在正常氧
条件下的定位无明显变化，而在缺氧条件下则可观察到BCL-2在胞核表达(图8)。

过去二十多年的研究表明，肿瘤缺氧在多种生物学反应中均发挥重要作用，包括凋亡、增生、分化、转移、血管生成、永生化和基因不稳定性[5-9]。

临床与基础研
究均表明，缺氧可通过调节凋亡相关分子的变化，增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，从而使肿瘤细胞获得更强的存活能力，最终可能导致肿瘤的复发、转移及向恶性表型的转化[10-12]。

目前，有关缺氧致肿瘤细胞凋亡能力改变的信号通路和基因调节
机制尚不清楚。

本组通过在体外细胞实验中模拟缺氧环境分析LPPCN样核凝集出现的条件，初步探讨其可能的分子机制。

结果显示缺氧可抑制肿瘤细胞的增殖活性，而同时在缺氧条件下可见B16肿瘤细胞由细长的梭形变为球形，伪足回缩，更易
悬浮，这种形态的变异使得肿瘤细胞更易发生阿米巴样运动，且侵袭能力增强[13]。

上述细胞的组织形态与HE染色切片观察的LPPCN细胞具有相同的特点。

此外，在伤口愈合实验中，与对照组相比，缺氧组大部分肿瘤细胞迁移较慢，伤口区可见部分肿瘤细胞适应缺氧条件而存活，其形态变化也使这部分肿瘤细胞具有更好的运动能力。

以上结果证实，适应缺氧环境而存活的细胞与形成VM的细胞具有相似
的特点[14]。

作者由此预测缺氧环境诱导核凝集细胞的出现可能是LPPCN细胞形成的核心机制。

通过分析该细胞出现的条件及特点，使推测LPPCN细胞的形成成为可能。

BCL-2家族是最重要的凋亡调节蛋白，在多种生物学过程中均发挥重要的作用。

根据其功能的不同，BCL-2家族又可分为促凋亡蛋白如Bax、Bak、BCL-xs和抗
凋亡蛋白如BCL-2，BCL-xl[15]。

缺氧后BCL-2表达上升可能与核凝集出现相关。

本组中可见缺氧条件下BCL-2呈时间依赖性的表达谱。

研究已证实BCL-2过表达可以增强肿瘤细胞的转移潜能[16]。

BCL-2过表达可以干扰Bax嵌入线粒体膜，
并抑制其寡聚体的形成，从而抑制凋亡的发生[17]。

因此，缺氧环境下BCL-2表
达高峰的出现可能使肿瘤细胞的存活能力增强。

免疫荧光观察显示，缺氧36 h后BCL-2定位于胞核，提示BCL-2可能通过进入细胞核发挥更强的作用。

核表达的BCL-2在多种生物学过程如EMT诱导细胞转化过程中发挥重要作用[18]。

上述结
果表明，缺氧导致BCL-2时间依赖性的变化和LPPCN样细胞核凝集的出现，而BCL-2表达高峰可能是早期散在的LPPCN样细胞核凝集出现的重要原因，随后BCL-2表达下降，线性排布的LPPCN样细胞形成。

其机制可能是由于缺氧可以诱导瘤细胞高表达BCL-2，大量的BCL-2转移到线粒体外膜上，阻止了细胞色素C、凋亡相关蛋白等促凋亡因子从线粒体释放到胞质内，从而阻止或减少缺氧早期由缺氧刺激引起的细胞杀伤，阻止细胞死亡。

本课题组在体外缺血移植瘤模型和生物力学模型中的肿瘤组织石蜡切片行凋亡相关蛋白(BCL-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9)免疫组化SP法染色结果也提示，在LPPCN形成的早期阶段，程序性坏死的细胞尚未连接成条带或网络，而是由3～5个细胞在肿瘤实质中呈散发性分布，这些呈坏死形态特征的细胞高表达BCL-2。

本实验在体外细胞实验中构建缺氧模型，实验结果发现缺氧后BCL-2可以呈响应
性高表达，具有明显的时相性(20～30 h表达高峰，36 h后显著下调并引起细胞
死亡)，而细胞核凝集的出现与此时相表达密切相关，与石蜡切片的实验结果一致。

此外，对从体内LPPCN的形成过程进一步分析还提示，LPPCN形成等同于肿瘤
细胞出现了局限性坏死区域，该区域周边的细胞即“亚LPPCN细胞”此时仍存活，
但却处于高度缺氧状态，组织切片免疫组化检测可见该部分细胞BCL-2也呈高表达。

当LPPCN细胞被清除且该腔隙灌注血液后，“亚LPPCN细胞”迅速解除缺氧，同时获得血流的剪切力和血液中成血管因子的刺激，形成具有功能的管道与内皮血管相连通，即VM。

本组由此推测该表达谱尤其是BCL-2表达高峰的出现与肿瘤细胞LPPCN样核凝集密切相关。

同时，BCL-2高水平表达使其获得与恶劣微环境对抗的能力。

本实验结果可以更好的解释LPPCN细胞形成，还为更好的理解BCL-2是否通过凋亡抵抗诱导核凝集的形成从而使肿瘤细胞获得更恶性的表型和侵袭能力提供重要依据。

核凝集的出现是LPPCN形成的基础，为更好的理解LPPCN和VM的形成提供依据，进一步丰富肿瘤血管生成理论。

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