三江平原根际微生物群落结构研究

三江平原根际微生物群落结构研究
刘峰;王建波;谢立红;许修宏
【摘要】The law of change of the Bacterial community structure of soil in Deyeuxia angutifolia community were studied on with the large generally used PCR-DGGE technology in the growing season (July 2012), the maturity (August 2012) and the autumn (September 2012). Results showed that Bacterial community struc-ture of soil in different period were Significantly different, in which the diversity index of soil bacterial community in the matu-rity was the highest, up to 3.23. By wetland soil fungi 16S rDNA gene sequencing analysis shows that proteobacteria were main groups of wetland soil bacteria in Sanjiang plain.% 采用PCR-DGGE技术，研究小叶章湿地土壤细菌群落结构的生长期（2012年7月）、成熟期（2012年8月）和凋落期（2012年9月）的变化规律。

结构表明各个时期的
细菌群落结构差异显著的，其中成熟期土壤细菌群落的多样性指数最高为3.23；
对湿地土壤真菌16S rDNA基因测序分析可知，其中变形菌纲（proteobacteria）为三江湿地土壤细菌的主要类群。

【期刊名称】《国土与自然资源研究》
【年(卷),期】2013(000)003
【总页数】3页(P93-95)
【关键词】三江湿地;土壤细菌;16S rDNA;PCR-DGGE
【作者】刘峰;王建波;谢立红;许修宏
【作者单位】东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030; 黑龙江省科学院自
然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040;黑龙
江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨150040;黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实
验室，哈尔滨150040;东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030
【正文语种】中文
【中图分类】X172
微生物的物种资源极其丰富，是地球上仅次于昆虫的第二大类生物，微生物多样性的研究是整个生物多样性研究的重要组成部分。

土壤微生物群落是一个非常特别的生物学总体，它是指在一定生境中由同种生物不同个体组成的群体，各种群体之间存在着各种相互作用 [1-3]。

土壤是一个极为复杂的生态体系：具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度条件等，是微生物生活的良好环境，具备高度的异质性。

土壤微生物包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌以及超显微结构微生物和真核生物微生物如真菌、藻类、地衣和原生动物等。

土壤微生物以细菌含量最大，约占70%～90%[4，5]，对甘肃环县草地可培养细
菌进行分离研究发现，平均每克土壤中含有65个不同的细菌种群，细菌总量为
4.51×109-1.75×1010 cfg/g土壤[6-8]。

对美国威斯康星农田土壤的微生物多样
性分析表明，约98%的物种属于细菌，其中，16.1%属于Proteobacteraia，21.8%属于Cytophaga-Flexibacter-Bacterorides类群，另外有21.8%属于低
G+C含量的革兰氏阳性菌。

遗憾的是，由于研究方法和人们认识能力的局限，目
前[9]土壤中仍约有80%～99%的微生物还未被完全认识和鉴定。

微生物在全球物质循环中起着重要作用，关系到地球在物质平衡、大气构成、地质形成方面的变化，
研究证实[10-12]，土壤中原核生物所含的N、P与陆生植物相当。

土壤微生物是自然物质循环不可缺少的成员，担负着分解动植物残体的重要作用，直接关系到土壤养分的有效性，对植物生长起到重要的作用，同时微生物在土壤肥力评价和生物净化等发面也有着重要的作用。

微生物[13-15]在土壤中的分布与活动，既反映了土壤各因素对微生物生态分布、生化特性以及对其功能的影响和作用，也反映了微生物对植物的生长发育、土壤肥力和物质循环与能量转化的影响和作用，揭示了土壤发育的现状和趋向。

同时，土壤微生物对环境变化很敏感，能够较早地指示生态系统功能地变化，这方面的研究对于退化生态系统的恢复和治理以及提高不同植被的生产力均有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法
1.1 采样
黑龙江三江国家级自然保护区（简称三江保护区）位于黑龙江省抚远县和同江市境内，距离佳木斯市约400km。

北临黑龙江，东靠乌苏里江，与俄罗斯隔江相邻，中心部分在抚远县境内。

平均海拔50m。

保护区面积19.8万hm2，其中国际重要湿地面积16.44万hm2。

主要保护类型是内陆湿地和水域生态系统，主要保护对象是东方白鹳、大天鹅、丹顶鹤等珍贵水禽及沼泽湿地。

保护区属内陆湿地，主要湿地类型包括永久性河流、时令河、永久性淡水草本沼泽、泡沼和人工湿地等，符合《湿地公约》国际重要湿地指定标准的 1、2、3、5、7，该湿地能很好地代表所在生物地理区域的湿地基本特征并处在自然状态，具有所在生物地理区域上代表性、典型性、稀有性或特殊性。

于2012年5月、6月、7月、8月进行样品采集，采集地土壤类型为沼泽化小叶章土壤、沼泽化草甸小叶章土壤、草甸小叶章土壤。

采样点序号见表1采样时，在5cm×5cm、垂直土层表面10～20cm处分别采集小叶章土壤样品各采样点重复取样3次，并将3次所得土壤样品充分混匀，将可见的植物残体（如根、茎、
叶）和土壤动物去除，装于样品袋中，封口，送到实验室-20℃保存。

1.2 湿地土壤DNA的提取
取10g土壤样品加入灭菌的锥形瓶中，加入10ml灭菌的ddH2O，置于摇床中，转速为140r/min，2h；将摇匀的样品倒入10ml离心管中，参考蒋建东等[5]的方法对样品进行前处理，得到菌体细胞的沉淀。

取0.3～0.5g沉淀样品，利用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，LLC，USA）试剂盒提取湿地土
样总DNA，提取方法按试剂盒使用说明进行操作。

然后用0.8%的琼脂糖凝胶电
泳检测。

1.3 细菌16SrDNA V3区的扩增
采用扩增细菌16SrDNA V3区的通用引物对338F-GC：5'-C GCGCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGG GAGGCAGCAG-3'和 518R：5'-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3'[11]。

PCR采用
50μl反应体系：10×PCR Buffer（10 mmol/LTris-HCl，1.5mmol/LMgCl2，
50mmol/LKCl）5μl；dNTPs4μL（2.5 mmol/L）；上、下游引物各1μL；
1μlDNA；1U Super Taq DNA Polymerase（HaiGen）；4μl1%BSA（消除腐植酸对 PCR的干扰）；补足灭菌的 ddH2O至50μl。

细菌 16S rDNA-PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 50 s，64℃ 1 min，72℃ 1 min，35 cycles；72℃ 10 min；4℃59 min。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 样品序号采样时间采样地土壤类型小叶章湿地土壤2012年7月2012年8
月2012年9月ABC
1.4 DGGE分析和测序
DGGE仪器为（Bio-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System）。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）使用8%的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺:双丙烯酰胺
=37.5:1m/V），16SrDNA的变性剂浓度适合的范围为30%～60%（100%变性
指7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺）。

电泳运行条件：1×TAE电泳缓冲液，60V的电压，60℃恒温、恒压电泳12h。

电泳完毕后[16-20]，用硝酸银染色法对凝胶进行染色0.5 h。

将染色后的凝胶用Syngene公司生产的G：BOX HR全自动凝胶成像分析系统拍照，获得DGGE条带图谱。

根据DGGE图谱及Quantity One 4.6.2软件对图谱条带的分析，计算得到每个湿地土壤样品中的微生物多样性指数（Shannon-Wiener，H）Pi=Ni/N，Ni为样品上各个条带吸收峰的面积，N 为样品上所有条带吸收峰的总面积；均匀度（Evenness，E）E=H/Ln S，其中 H 为求得的Shannon-Wiener多样性指数，S为丰富度，即每一条泳道的条带数目[9]。

从而从多个角度对湿地土样中的微生物分布进行研究。

进一步应用Quantity one4.6.2软件对DGGE图谱进行聚类分析。

并采用SPSS19.0软件对DGGE图谱进行主成分（PCF）分析。

将DGGE图谱上的主要条带切胶回收，再次使用不带GC夹子的引物进行去夹子反应。

得到的PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒（Omega）进行纯化后与克隆载体（pMD18-T）连接，得到的阳性克隆送华大基因测序。

表2 DGGE条带相似菌株克隆序列名最相似的已知序列 GenBank登录号相似性（%）W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 Uncultured gamma proteobacterium clone C28 Uncultured bacterium clone P32 Uncultured bacterium clone Control 14d c24 Uncultured Clostridium sp.partial
16SrRNA gene Uncultured bacterium clone GB7N87003GBZEL 16SrRNA amplicon fragment from a soil sample Uncultured bacterium gene for
16SrRNA Uncultured bacterium clone NCD1s1Fastd2_7804 Uncultured bacterium clone B26_57 Acinetobacter calcoaceticus 16SrRNA gene
HQ883281 EU307191 GU558984 HE805973 HM665812 FQ749992
AB594285 JQ371081 EU790330 HE651906 96 94 97 95 94 98 96 97 94 96
1.5 系统发育分析
将测序所得的13个序列，通过DNAMAN软件进行处理，用Blast程序将序列与GenBank数据库进行相似性比较后，获得相近已知序列，用MEGA 4中NJ法（Neighbor-Joining）构建16SrDNA基因的系统进化树并对其进行系统发育分析。

表3 DGGE图谱多样性指数评价指标 2012年7 2012年8 2012年9月SHE 11 2.4 0.97 23 3.13 0.98 18 2.89 0.98
2 结果与讨论
2.1 DGGE图谱分析
湿地细菌16SRDNA基因的DGGE图谱见表2在所有的湿地样品中检测到了W1、W8和W10表明这3个条带指示菌可能是小叶章根基土壤细菌群落中普遍存在的优势菌群，同时每个样品中也存在着很多特异的条带，表明在不同时期、营养状况和退化程度条件下，湿地土壤细菌群落结构发生了变化。

W1与W10主要出现在2012年7月和8月。

W4和W5主要出现在2012年9月。

应用Quantity
one4.6.2软件分析细菌16SrDNA基因的DGGE图谱，得出每个泳道的多样性指
数（H）、丰富度（S）和均匀度（E），结果如表3所示。

比较不同时期的小叶章湿地土壤细菌多样性指数的可知，9月份多样性指数最高为3.25，因为其土壤含
水量较少与空气交换快。

2012年7、8、9月小叶章湿地土壤细菌的多养性指数分别为2.4、3.13、2.89。

三江湿地样品的DGGE图谱具有较好的多样性指数和均匀度，所以更有利于运用PCR-DGGE进行湿地土壤细菌微生物多样性的研究。

图1 16S rDNA序列系统进化树
进一步应用Quantity one4.6.2软件的UPGAMA对DGGE图谱进行聚类分析，
结果见图1中所有的湿地样品将获得的10条序列通过BLAST比对和系统进化树
分析后，大致可分为2个细菌类，Clostridia和Proteobacteria。

从图1可以看
出，湿地土壤的真菌种类多数属于Proteobacteria，它是主要的土壤细菌类群，
主要出现在2012年8月的湿地土壤中。

试验样品的相似性均在0.48～0.81之间，说明各湿地样品细菌群落的差异性较大。

样品A、B、C分别聚类在一起显示出他
们之间具有相似的细菌群落结构，表明湿地植物生长期和凋落期的变化是引起湿地细菌群落结构差异的主要因素。

3 结论
湿地植物生长期（2012年7月）、成熟期（2012年8月）、凋落期（2012年9月）的细菌结构差异显著2012年8月（成熟期）的多样性指数最高。

三江湿地样品的DGGE图谱具有较好的多样性指数 (H)和均匀度（E）。

因此，更适合借助于PCR-DGGE技术对三江湿地的微生物群落结构进行研究。

三江湿地的土壤细菌种类主要包括proteobacteria、unclassified、clstridia。

其中proteobacteria是三江湿地主要的土壤细菌类群由于湿地土壤中的微生物群落结构复杂，因此对于三江湿地土壤中的细菌群落结构研究仍需要进一步深入研究。

【相关文献】
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