目的基因及分离方法

（4）DNA插入诱变法分离目的基因
（5）基因定位克隆
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核苷酸序列彼此重叠的基因，即不同基因共用同一段DNA的 核苷酸序列，他们的核苷酸序列彼此重叠。
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2.重复基因
2006年3月15日报道： 随着多种生物基因组被破译，科学家证明生物的新 基因是通过基因重复获得的。美中两国科学家组成的 研究小组在最近的研究中证明，进化理论所推断的 “重复基因中的一部分可能产生新功能，有助于生物 对环境适应”的论断是正确的。
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1.2目的基因的分离方法
根据不同类型基因组的大小、基因组 成和基因排列方式不同，采用以下的方法 可以把目的基因从基因组中分离出来。
直接分离法 化学合成法 聚合酶链式反应（PCR）分离法 基于基因的分离法2014-11-27
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1.2.1直接分离法
（1）限制性核酸内切酶酶切分离法 （2）物理化学法 （3）双抗体免疫法： （4）利用酶促反转录法分离基因
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（2）从mRNA中扩增: RT-PCR
提取基因组 total RNA 反转录合成总cDNA作模板 根据目的基因序列设计引物 PCR扩增 适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。
（3）同源序列克隆法
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根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用及分 离方法
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1.1 目的基因的获得
来源：动、植物体，微生物，化学合成等。
1.1.1概念
目的基因 那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达 的特定基因或DNA片段，主要指结构基因。 目的基因包括蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、 生物药和保健品相关基因、毒物讲解相关的基因等。
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2.真核生物基因组成 （1）基因区 （2）转录启动区 （3）转录终止子
不含SD序列，核糖体与mRNA 5’端 的帽子结构结合
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1.1.3基因的排列
基因组的每个基因一般一个一个直 线排列在DNA分子上，并且两个基因之 间存在非编码的间隔序列，但存在一些 特殊排列。 1.重叠基因(overlapping genes)
3. 加倍基因
多倍体生物中的基因，与重复基因相似
4. 基因重排
有的基因组中，同一基因簇处在不同细胞中时，基 因排列会发生变化。
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目的基因分离是基因工程研究和应用的关键内容
不同基因组类型的基因组大小、基因组成和基因排列各不相同
(开放阅读框）
根据不同的实验要求，采用不同的途径 和方法分离目的基因
2014-11-法
对已知序列的DNA分子； 对已知定生物体 中分离目的基因，如病毒等。
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（2）物理化学法
根据基因片段的碱基组成差异较大， 其理化性质，如浮力密度和解链温度等的差 异，从生物基因组中分离目的基因。
密度梯度离心法 单链酶解法 分子杂交法
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（3）双抗体免疫法：抗原、抗体结合原 理，条件：纯化目的基因的天然蛋白、 制备抗天然蛋白的抗体。
（4）利用酶促反转录法分离基因：主要用 于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分 离目的基因。
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1.2.2维素膜之后，进行裂解， 释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核 酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到 目的基因。
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1.1.2 结构基因组成
1.原核生物的基因组成 （1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有 ATG的起 始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。 （2）启动区：RNApol识别、结合和开始转录的一段DNA核 苷酸序列。 （3）SD区：在起始密码子ATG上游约10bp处，有一个富含 嘌呤的保守序列，其与16S rRNA3′端序列互补。 SD区的作用：SD序列与起始密码子ATG之间的距离决定 了mRNA在细菌中的转录效率。 （4）转录终止子和终止因子 转录终止子：一个基因或一个操纵子3′端，提供转录停止 信号的DNA核苷酸序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋 白。
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱 氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体 就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、 缩合、分离、去保护五大操作单元。
1.2.3基于PCR的分离法
（1）直接从基因组中扩增
提取基因组DNA作模板 根据目的基因序列设计引物 PCR扩增 适合扩增原核生物基因。 真核生物基因组含有内含子！