大葱轮作对温室黄瓜根际土壤微生物多样性的影响

大葱轮作对温室黄瓜根际土壤微生物多样性的影响
时伟;申太荣;魏珉;李岩;王秀峰;杨凤娟;史庆华
【摘要】采用大葱/黄瓜轮作和黄瓜/黄瓜连作两种栽培模式，比较研究了黄瓜根际土壤微生物多样性的差异，在此基础上，进一步探讨了大葱根系分泌物对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响。

结果表明：与连作相比，大葱轮作提高了黄瓜根际土壤中细菌、放线菌的多样性及均匀度指数，降低了真菌的多样性与均匀度指数；大葱根系分泌物处理可提高黄瓜根际土壤中细菌和真菌的多样性和均匀度指数，但对放线菌的作用不明显；较高浓度的大葱根系分泌物可引起黄瓜根际土壤中部分细菌和真菌聚集。

%The differences of microbial diversity in rhizosphere soil of cucumber in greenhouse were stud -ied under welsh onion-cucumber rotation and continuous cucumber cropping modes .On this basis , the influ-ences of welsh onion root exudates on soil microbial diversity were further discussed .The results showed that , compared with continuous cropping , welsh onion rotation increased the diversity and evenness indexes of bac -teria and actinomyces and reduced those of fungi in cucumber rhizosphere soil .The welsh onion root exudates treatment could increase the diversity and evenness indexes of bacteria and fungi in cucumber rhizosphere soil , but the effect on actinomyces was not obvious .High levels of welsh onion root exudates could cause aggrega-tion of some bacteria and fungi in cucumber rhizosphere soil .
【期刊名称】《山东农业科学》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】7页(P72-77,81)
【关键词】大葱;轮作;根系分泌物;微生物多样性;PCR-DGGE
【作者】时伟;申太荣;魏珉;李岩;王秀峰;杨凤娟;史庆华
【作者单位】山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018; 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018; 作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018; 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安271018; 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018;山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018; 作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018【正文语种】中文
【中图分类】S154.3
连作障碍严重制约设施蔬菜高产高效与可持续发展。

连作会引起土壤微生物结构变化，细菌和放线菌种类与数量减少，有害微生物种类与数量增加［1］，根际微生物平衡遭到破坏，微生物种群多样性降低［2］。

合理轮、间(套)作是减轻或克服土壤连作障碍的有效措施［3］，能够增加细菌和放线菌等有益微生物的种类与数量，提高土壤微生物多样性，改善土壤生态环境，促进作物生长［2～4］。

土壤中微生物种类很多，但采用传统方法只能培养其中0.1% ～10%的微生物［5］，不能完全反映土壤中微生物群落的状况。

PCR-DGGE作为一种现代分子生物学研究手段，能够较好地从DNA水平上反映微生物群落的变化及其多样性，
弥补了传统微生物培养方法的缺陷［6］。

黄瓜是设施主栽蔬菜，对连作反应敏感［7］。

各作物与黄瓜轮作的研究发现，大葱/黄瓜轮作对连作土壤的改良作用及对黄瓜生育的影响更为明显［8］。

研究表明，大葱轮作可显著改善黄瓜连作土壤的理化和生物学特性，增加细菌和放线菌数量，减少真菌数量，抑制枯萎病病原菌繁殖，促进生长，提高产量［9，10］，但其内在机制尚未完全明确。

为此，本试验采用PCR-DGGE技术，比较研究了大葱/黄瓜轮作和黄瓜/黄瓜连作条件下根际土壤微生物多样性的变化，并进一步探讨了大葱根系分泌物对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响，旨在从一个侧面揭示大葱轮作缓解黄瓜连作障害的原因，为制定合理栽培制度提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。

土壤类型为棕壤，土壤理化性状为pH 6.19，EC 825 μS/cm，碱解氮 238.0 mg/kg，有效磷151.2 mg/kg，速效钾 131.2 mg/kg。

供试黄瓜(Cucumis sativus L.)品种‘新津11号’，大葱(Allium fistulosum L.)品种‘元藏大葱’。

Amberlite XAD-4吸附树脂购于Sigma公司。

1.2 试验设计及处理
1.2.1 轮作和连作对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响试验于2011年8月至2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理:大葱/黄瓜轮作(T)，黄瓜/黄瓜连作(CK)。

每处理10盆，重复3次，随机排放。

花盆直径30 cm，高25 cm，内装连作土壤10 kg。

黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株。

后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，于5月15日、5月25日、6月5日取土样。

1.2.2 大葱根系分泌物处理对黄瓜根际土壤微生物多样性的影响用连续根系分泌物收集系统(ContinuousRootExudates Trapping System，CRETS)收集大葱根系
分泌物［11］。

按占新华等［12］方法测定溶液中总有机碳浓度，并用去离子水
配制总有机碳浓度105、210、420 mg/L的大葱根系分泌物溶液，置4℃冰箱中
备用。

试验于2012年11月至2013年1月在山东农业大学北校区玻璃温室进行。

将催
芽的黄瓜种播于装280 g风干连作土的塑料钵(8 cm×8 cm)中，自幼苗子叶展平
开始，采用上述浓度的大葱根系分泌物溶液，以等量去离子水作对照(CK)进行处理，每盆均匀浇灌50 mL，每2天处理一次，视天气情况补浇同等量的水。

重复3次，每重复4株，完全随机排列。

从初次灌溉处理起，共30天。

处理完后的第3天取土样。

1.3 测定项目与方法
1.3.1 根际土壤采集按雷娟利等［13］方法获取根际土样，混匀，放-70℃冰箱保存，进行微生物群落结构PCR-DGGE测定。

1.3.2 PCR-DGGE测土壤微生物多样性
(1)土壤总DNA提取土壤总DNA用E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek，Inc.，GA，USA)提取。

(2)PCR扩增①细菌16S rDNA基因V3区扩增。

采用通用引物对GC-F341/R518进行PCR扩增。

引物序列为:GC-F341:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;R518:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

PCR反应参数:94℃预变性5 min;94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 1 min，10 个循环;退火温度每两个循环降低1℃，再在退火温度为56℃时循环15次，72℃延
伸5 min。

②放线菌16S rDNA基因保守区扩增。

采用通用引物对F243/GC-R513进行PCR 扩增。

引物序列为:GC-R513:5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCGGCCG CGGCTGCTGGCACGTA-3′;F243:5′-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3′。

PCR反应参数:95℃预变性4 min;94℃ 1 min，63℃ 1 min，72℃ 2 min，35 个循环;最后72℃延伸10 min。

③真核微生物18S rDNA扩增。

采用通用引物对NS1/GCFung进行PCR扩增。

引物序列为:GCFung:5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTAC CCGTTG-3′;NS1:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′。

PCR反应参数:94℃预变性2 min;94℃ 15 s，50℃ 30 s，68℃ 30 s，30 个循环;最后72℃延伸10 min。

(3)变性梯度凝胶电泳(DGGE)①聚丙烯酰胺凝胶的制备。

制备凝胶厚度1.0 mm、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增。

细菌采用的变性剂(尿素及甲酰胺)浓度为30%到70%;放线菌为40%到60%;真菌为
31.5%到35.5%。

②PCR样品的加样。

待胶完全凝固后，将胶板放入装有1×TAE Buffer的电泳槽中，每孔上样量为40 μL。

③电泳及染色。

用D-code System电泳仪(Bio-RadLab，LA，USA)，电压150 V，温度60℃，电泳5.5 h(细菌 DGGE用);电压150 V，温度62℃，5 h(放线菌DGGE用);电压 50 V，温度60℃，20 h(真核微生物DGGE用)。

银染法染色。

待凝胶干燥后用数码相机拍照。

1.4 数据处理与分析
采用 Bio-Rad Quantity One 4.5软件对DGGE图谱进行数字化、标准化分析;采
用 Microsoft Excel软件完成数据整理;主成分分析采用Canoco for Windows 4.5 software［14］。

Shannon-Weaver指数及均匀度指数由下式计算:
式中，Dsh为 Shannon-Weaver指数，Jsh为均匀度指数，Pi为第i个DGGE条带出现的概率，Ni为第i个条带的扩增量，N为土壤微生物群落DNA的DGGE 条带的扩增总量为群落DNA丰富度指数(总物种数)。

2 结果与分析
2.1 轮作和连作对黄瓜根际微生物多样性的影响
2.1.1 细菌菌群DGGE分析 DGGE条带数量体现了细菌的种群数量，而条带灰度则反映了同种细菌数量的多寡［15］。

图1表明，随生育期推进，连作和轮作黄瓜根际土壤中细菌16S rDNA的DGGE图谱中条带数目逐渐增多，多数条带的灰度逐渐加深，轮作与连作黄瓜根际土壤中细菌群落DGGE图谱的条带数及条带灰度始终差异明显。

主成分分析结果表明，不同栽培模式黄瓜根际土壤细菌群落分布于不同象限，随生育期的延长，轮作和连作黄瓜根际土壤细菌群落之间距离逐渐减小，说明大葱和黄瓜根际细菌群落组成差异较大，但种植黄瓜使两者的相似度增加;黄瓜生长前期与后期根际土壤中细菌群落分布于不同象限，说明生育时期对黄瓜根际细菌群落的影响较大。

图1 轮作和连作黄瓜根际土壤细菌16S rDNA的DGGE图谱(a)及主成分分析图(b)注:1、3、5 分别代表轮作土壤第1、2、3 次所取样品;2、4、6 分别代表连作土壤第1、2、3次所取样品。

下图同。

从表1可以看出，随黄瓜生育期的推进，轮作和连作黄瓜根际土壤细菌的多样性和均匀度指数均不断上升;轮作黄瓜根际土壤细菌的多样性和均匀度指数在3个时
期均略高于连作黄瓜。

表1 轮作和连作黄瓜根际土壤细菌类群的多样性和均匀度指数多样性参数Shannon-Weaver指数Dsh 均匀度指数J sh 5/15 5/25 6/5轮作黄瓜5/15 5/25 6/5 2.542 2.751 2.998 0.890 0.897 0.900连作黄瓜2.502 2.535 2.941 0.846 0.850 0.892
2.1.2 放线菌菌群DGGE分析从图2可知，随生育期推进，连作和轮作黄瓜根际土壤放线菌16S rDNA的DGGE图谱条带数变化不大，但条带的灰度逐渐加大。

不同取样时期轮作与连作黄瓜根际土壤中放线菌群落的条带灰度始终差异明显，轮作黄瓜根际土壤中某些放线菌种群数量高于连作。

图2 轮作和连作黄瓜根际土壤放线菌类群16S rDNA的DGGE图谱(a)及主成分分析图(b)
主成分分析结果表明，不同栽培模式黄瓜根际土壤放线菌群落分布于不同象限，随生育期的延长，轮作和连作黄瓜根际土壤放线菌群落之间距离先减小后增大，说明大葱和黄瓜根际放线菌群落组成差异较大，两种种植模式下两者的差异最终有所增加;轮作与连作黄瓜根际放线菌群落分别位于纵轴两侧，说明种植模式对放线菌群落的影响较大。

从表2可以看出，随生育期推进，轮作和连作黄瓜根际土壤中放线菌的多样性指数均逐渐增大，但连作黄瓜增加幅度不大，轮作黄瓜与连作黄瓜根际土壤中放线菌多样性指数差值也随生育期推进逐渐增大。

轮作黄瓜根际土壤中放线菌的均匀度指数逐渐增大，连作黄瓜根际土壤中放线菌的均匀度指数先增大后减小，最终使轮作黄瓜根际土壤中放线菌的均匀度指数高于连作黄瓜。

表2 轮作和连作黄瓜根际土壤放线菌类群的多样性和均匀度指数多样性参数Shannon-Weaver指数Dsh 均匀度指数J sh 5/15 5/25 6/5轮作黄瓜5/15 5/25 6/5 2.105 2.221 2.249 0.878 0.926 0.937连作黄瓜2.101 2.103 2.117 0.912
0.913 0.883
2.1.3 真菌菌群DGGE分析图3表明，随生育期推进，连作和轮作黄瓜根际土壤真菌18S rDNA的DGGE图谱条带数目先减少后增多，多数条带灰度逐渐增加。

整个生育期连作和轮作黄瓜根际土壤真菌的条带数和条带灰度始终有明显差异。

图3 轮作和连作黄瓜根际土壤真菌18S rDNA的DGGE图谱(a)及主成分分析图(b) 主成分分析结果表明，不同种植模式下的黄瓜根际土壤真菌群落前期分布于不同象限，而后期位于同一象限，说明大葱和黄瓜根际真菌群落组成差异较大，但种植黄瓜可减小两者的差异;黄瓜生长前、后期的根际土壤中真菌群落位于不同象限，说明黄瓜生育时期明显影响真菌群落的组成。

由表3可以看出，随黄瓜生育期的推进，轮作和连作黄瓜根际土壤中真菌群落的
多样性指数先降低后升高，第3次取样时土壤中真菌群落多样性指数较第1次有所降低;与轮作黄瓜相比，连作黄瓜真菌群落的多样性指数始终较高。

轮作和连作黄瓜根际土壤中真菌的均匀度指数均为先升高后降低，第3次取样时轮作黄瓜的
均匀度指数有所上升，而连作黄瓜的均匀度指数则有所下降;与连作黄瓜相比，轮作黄瓜土壤真菌的均匀度指数较低。

表3 轮作和连作黄瓜根际土壤真菌类群的多样性和均匀度指数多样性参数Shannon-Weaver指数Dsh 均匀度指数J sh 5/15 5/25 6/5轮作黄瓜5/15 5/25 6/5 2.720 2.482 2.673 0.835 0.859 0.852连作黄瓜2.931 2.758 2.833 0.880 0.906 0.870
2.2 大葱根系分泌物对黄瓜幼苗根际微生物多样性的影响
2.2.1 细菌菌群DGGE分析从图4中可以看出，与对照相比，不同浓度大葱根系分泌物处理的黄瓜幼苗根际土壤中细菌16S rDNA的DGGE图谱有明显差异，条带数目增多，灰度增大。

说明大葱根系分泌物能够提高黄瓜幼苗根际土壤中细菌种类及数量。

图4 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤细菌16S rDNA的DGGE图谱(a)及主成分分析图(b)注:1、2、3、4 分别代表大葱根系分泌物浓度为 0、105、210、420 mg/L。

下图同。

对不同处理的细菌种群进行主成分分析，得到主成分PCA，它解释了总变异的71.5%。

在以主成分PCA为坐标轴构建的二维坐标系中，不同浓度大葱根系分泌物处理的样品出现了明显的位置变异，分别位于四个象限，说明大葱根系分泌物使黄瓜幼苗根际土壤中一些细菌的种群发生了较大变化。

从表4中可看出，不同浓度大葱根系分泌物处理均能提高黄瓜幼苗根际土壤中细菌种群的多样性和均匀度指数，且以浓度为210 mg/L的处理最明显，多样性指数和均匀度指数分别比对照高出14.40%和3.81%。

表4 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤细菌类群的多样性和均匀度指数0 105 210 420 Shannon-Weaver指数Dsh多样性参数大葱根系分泌物浓度(mg/L)2.715 2.991 3.106 3.034均匀度指数Jsh 0.918 0.922 0.953 0.931
对各泳道样品16S rDNA的条带图谱通过Quantity One 4.5软件，采用非加权成对算数平均法(UPGMA)进行了相似性的聚类分析(图5)。

结果表明，对照样品与其他样品的遗传相似性为57%，在80%的相似性水平处可将4个样品区分开来。

对照与大葱根系分泌物处理的根际土壤细菌群落结构相似性较低，大葱根系分泌物处理之间相似性较高，以处理浓度为210 mg/L与420 mg/L的相似性最高，达到80%。

图5 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤细菌类群的16S rDNA条带图谱的聚类分析图注:图中横坐标代表细菌群落结构相似性。

下图同。

2.2.2 放线菌菌群DGGE分析图6显示，大葱根系分泌物处理的黄瓜幼苗根际土壤中放线菌群落表现出来的DGGE图谱条带数目及条带灰度差异较小;聚类分析结果表明，所有样品间遗传相似性均不小于89%，说明大葱根系分泌物处理对放线
菌种群的影响较小。

2.2.3 真菌菌群DGGE分析从图7中可以看出，与对照相比，不同浓度大葱根系分泌物处理的黄瓜幼苗根际土壤中真菌18S rDNA的DGGE图谱有明显差异;随大葱根系分泌物浓度的增加，条数目增多，条带灰度增大。

主成分分析得到主成分PCA，解释了总变异的69.3%。

在以主成分PCA为坐标轴构建的二维坐标系中，不同浓度大葱根系分泌物处理的样品出现了位置变异，其中处理2和3距离较近，其相似度较高。

说明大葱根系分泌物能影响黄瓜幼苗根际土真菌群落结构。

图6 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤放线菌类群16S rDNA的DGGE图谱(a)及聚类分析(b)
图7 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤真菌类群18S rDNA的DGGE图谱(a)及主成分分析图(b)
从表5中可以看出，大葱根系分泌物处理提高了黄瓜幼苗根际土壤中真菌群落的多样性，且以浓度为210 mg/L处理的多样性指数最高，比对照提高31.23%。

不同浓度大葱根系分泌物处理提高了真菌群落的均匀度，以浓度为210 mg/L和420 mg/L处理的均匀度指数最高，均为0.926，比对照高10.50%。

表5 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤真菌类群的多样性和均匀度指数0 105 210 420 Shannon-Weaver指数Dsh多样性参数大葱根系分泌物浓度(mg/L)2.324 2.910 3.050 2.981均匀度指数Jsh 0.838 0.916 0.926 0.926
根际真菌遗传相似性聚类分析图谱(图8)表明，对照样品与其他样品的遗传相似性为59%，在80%的相似性水平处可将4个样品区分开来。

对照与大葱根系分泌物处理的根际土壤真菌群落结构相似性较低，大葱根系分泌物处理之间相似性较高，以处理浓度为210 mg/L与420 mg/L的相似性最高，达到80%，说明大葱根系分泌物对黄瓜幼苗根际土壤真菌群落结构的影响较大。

图8 大葱根系分泌物处理下黄瓜幼苗根际土壤真菌类群的18S rDNA条带图谱的聚类分析图
3 讨论
土壤微生物在植物残体降解、养分转化循环等过程中扮演重要角色［16］，影响植物生长的根际土壤微生态环境。

土壤微生物群落结构会影响植株生长发育［17］，提高微生物多样性，有效改善土壤微生态环境，促进作物生长，提高产量［2］。

本试验结果表明，与连作相比，大葱轮作可明显改善黄瓜根际微生物群落结构，提高细菌与放线菌群落的多样性和均匀度指数，降低真菌群落多样性和均匀度指数。

吴凤芝等［2］研究也发现，与连作相比，轮作更有利于提高黄瓜土壤微生物多样性和稳定性。

改善作物根际土壤的微生物环境为其正常生长和提高产量奠定了基础。

根系分泌物是影响土壤微生物的重要因子之一［18］。

不同栽培制度造成土壤微生物数量及种群结构的变异，与作物残体和根系分泌物在土壤中的积累有关［19］。

本试验中，与对照相比，大葱根系分泌物处理改变了黄瓜根际土壤的微生物群落结构，显著提高了细菌和真菌群落的多样性及均匀度指数，进而提高了土壤中微生物多样性，与前人研究结果相似［19］。

但大葱根系分泌物处理和大葱轮作的效果存在着差异，可能与两种条件下实际进入土壤中的根系分泌物成分及含量不同有关。

不同作物根系分泌物成分及含量存在差异，对土壤微生物的影响也不同。

赵大君等［20］发现，凤眼莲根系分泌物的氨基酸组成对根际细菌趋化作用产生明显的影响。

Zhou等［21］发现，对羟基苯甲酸可降低细菌群落的Shannon-Weaver指数及均匀度指数，但提高真菌群落的Shannon-Weaver指数及均匀度指数。

也有研究发现，根系分泌物中的糖、氨基酸等种类和含量与病原菌孢子萌发及菌丝生长有关［22］。

大葱根系分泌物处理和大葱轮作对黄瓜根际微生物群落结构的影响差异原因值得进一步探讨。

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