分子荧光分光光度分析解析

分子荧光分光光度分析
第_章第二章第三章荧光分析基本原理荧光分光光度计定性与定量分析
第一章荧光分析基本原理
第一节荧光产生与测量
第二节荧光参数
第三节荧光与分子结构的关系第四节影响荧光测量的因素
一、分子能级
二、荧光产生
三、磷光产生
荧光测量
一. 分子能级
分子的结构比原子复杂，最简单的双原子分子，有
配对电子形成化学键维系其结构，大多数分子有偶数个电子，每个轨道中的电子自旋相反，这种分子状态称为单线态。

当分子价电子被激发后，电子自旋取向有两种。

与低能级电子自旋方向相反，为单线态；与低能级电子自旋方向相同，为三线态（亦称三重态）。

单线态与三线态性质不同，单—单线态跃迁几率
大，激发态平均寿命108So单—三线态跃迁几率小, 激发态平均寿命可达1S O
二、荧光的产生分子荧光是一种
光致发光，与紫外吸收过程相
反。

在室温下，大多数分子处在
基态的最低振动能级，当吸收特
征频率光（激发光）后，可以激
发到第一、二电子激发态单线态
的各个不同振动能
A | 禺久3
级的各个转动能级（吸收光谱），通过无辐射跃迁（内转换）, 回到第一电子激发态的最低振动能级后，再跃迁到基态的各个
振动能级，以光的形式弛豫便产生荧光。

分子荧光为单―单线态跃迁，荧光寿命仅10“s,
激发光消失，荧光立即消失。

从荧光的产生可看出:
①分子荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始，与荧光分子被激发到哪个能级无关，故荧光光谱形状与激发光波长无关。

②荧光发射之前经内转换损失一部分能量，荧光波
长比激发光波长长。

三、磷光的产生
根据洪特规则，在不同轨道上有两个自旋相同电子的分子能量（三形态），低于同一轨道上有两个自旋相反电子的分子能量（单线态）。

因此，在太阳的分子轨道上, 处于三线态分子的能量低于单线态分子。

但是，处于第一电子激发三线态的一个振动能级几乎与第一电子激发单线态最低振动能级的能量相同。

这样，由第一电子激发单线态的最低振动能级，有可能通过系间跨越，跃迁至第一电子激发三线态，再经振动弛豫跃迁至最低振动能级，由此激发态跃迁至基态便产生磷光。

从磷光的产生可知:
①磷光产生经过系间跨越（自旋禁阻），发光速率较慢，激发光消失，磷光还能持续一定的时间，磷光寿命10 70s。

②系间跨越损失部分能量，磷光波长比荧光波长长, 比激发光波长更长。

荧光测量由于荧光是一种光致发光，激发光从一个方向射入,
荧光向四方八方辐射。

所以，荧光可以与照射光束呈90。

方向测量荧光。

与紫外分光光度法比
较，荧光检测背景黑暗,
荧光强度F直接反映荧光
物质吸收激发光的强弱。

而紫外吸光度大小是通过
透射光强I与入射光强厶比
较得到的。

从荧光测量方式可看出：
①物质紫外吸收系数一定，激发光越强，荧光发射
越强，即Foc/oo
②分子荧光强度与测量仪器有关，提高荧光检测灵
敏度，可通过改善仪器性能，比较变态物质的荧光发射强度，需要对仪器进行校正。

③荧光分析提高灵敏度途径多，干扰因素也多。

第一章荧光分析基本原理
从荧光产生与测量可知：
①物质分子吸收光是产生荧光的必要条件；
②磷光波长大于荧光波长，而二者的波长都大于激发光波长，磷光寿命长于荧光。

③分子荧光强度F与吸光系数成正比，与激发光强度成正比。

④荧光强度检测与仪器单色器光损失、狭缝宽度、检测器灵敏度有关。

⑤大多数荧光物质只有一个荧光谱带，而吸收光谱有多个谱带。

一、激发光谱
二、荧光发射光谱
三、荧光量子产率
四、荧光强度与总荧光量
一、激发光谱
荧光物质的激发光谱（瓦）是激发辐射在不同波长处照射荧光分子，引起应发射的相对效率。

或者，不同激发光（扫描入射光波长）激发荧光分子发射某一波长荧光（固定发射光波长）的相对强度关系图。

荧光物质吸收激发光愈多，处于激发态的分子愈多,
荧光发射愈强。

反映了物质对激发光吸收的状况，的形状与吸收光谱极为相似，与所选荧光波长无关, 荧光波长影响仗大小。

直接扫描的Ex包含仪器光源、单色器的特性，称为
表观光谱。

经过校正的真实激发光谱与吸收光谱完全相同。

二、荧光发射光谱
荧光发射光谱（EQ 是荧光物质在某一激发波长作用
下，发射不同波长荧光的相对效率图。

分子的吸收光谱与Em 是分子价电子两个不同跃迁方向 的所产
生的，由于分子的第一电子激发态与基态的振动、
转动能级分布相似，Em 与吸收光谱的第一吸收带（与真实 对称关系（频率）。

激发 光波
长与呂…形状无关, 影响盅
的大小。

三、荧光量子产率 激发光谱相同）呈镜像
250 330 2/nm
400 500
荧光量子产率飒量子效率)是物质荧光特性的主要参数，他表示物质发射的本领，可表示为
V发射量子数发射量子数
cT) - --------------------- -- --------------------------------------------
吸收量子数发射量子数+无辐射损失
卩表明物质吸收光是产生荧光的必要条件，表示充分条件，大多数有紫外吸收的物质不发射荧光，其原因是卩太小。

物质Foe%卩与温度、溶剂有关。

分子的价电子跃
迁过程中无辐射跃迁导致卩变小0
荧光强度与总荧光量
从以上的分析中可知，荧光强度Foe"或厶、卩、忧与单色器效率、狭缝宽度、检测器灵敏度等相关的仪器系数）、荧光物质浓度C。

根据朗伯■比尔定律有
I
:.I = /010^c=厶以3必VAZ = /0-/ = Z0（l-宀Lc）
X2
=1-X + ——
3!
2!
当兀VV1时，e-x ^1-X,在荧光分析中，荧光物质吸光量
AZ不超过总入射光的2%时，或也c不大于0.05时，
荧光强度可表示为
F = k'Xk X(PXM = k'Xk X0 XZ0[l-(l-2.3^Zc)] 或F = K(t>I Q sLc 上式表明：
①p oc (p、£
②F *厶
③F
④当也C不大于0.05、各常数一定时，F*c,样液浓度很低时，F = Kc的线性关系越好。

⑤荧光测量是相对方法，影响因素较多。

一、有机化合物结构
二、物质分子所处环境
一、有机化合物结构
1.分子碳架结构
荧光物质分子均有共轨双键结构，且分子的共轨体
系越大，非定域7T电子越容易被激发，越容易产生荧光。

同时，荧光波长向长波红移
越多。

任何影响疗电子共辘
结构改变的因素，都将影响
荧光量子效率，或影响荧光
酚猷
波长红移。

联苯0二0.18茹0二1
第三节荧光与分子结构的关系
无荧光 有荧光
2.分子几何结构
从荧光分子结构可看出，强荧光有机化合物分子， 多数
具有加大的刚性平面，一些具有有共辄体系、刚性 平面不大的分子, 与无机离子螯合 C H 2 笏 后，快出生荧光。

刚性平面越稳定、 共辘体系越大，荧 光效率越高。

if
联二苯
3.取代基位置
芳香族化合物环上有不同取代基时，荧光强度和荧
光光谱将会发生河大的变化
加强荧光的有—OH、—OR、一NH、一NHR、一NR、
-CN、-OCH3> -OC2H5等。

消弱荧光的有-COOH、-c=o. -NO2>-NO、-SH、一F、一Cl、一Br、一I等。

影响不明显的有-R、-SO3H.-NIV等。

二、物质分子所处环境
荧光分子所处溶液的pH影响分子的存在状态，从而应荧光强度的变化，
例如，苯胺在pHV2的溶液中，无荧光；在pH7〜12 溶液中，具有蓝色荧光；在pH>13的溶液中，无荧光。

奎宁在O.lmol/L硫酸(I/2H2SO4)溶液中，具有强荧光, 在O.lmol/L盐酸溶液中，无荧光。

此外，温度影响分子异构体变化、溶剂影响分子处
在状态、共存物质的相互作用，均能使荧光物质的荧光发射发
射变化。

一、激发光源与仪器系数
二、引起荧光淬灭的因素
三、内滤光与自吸收
四、光散射影响
五、溶剂影响
六、pH影响
七、温度影响
八、其他干扰
一、激发光源与仪器系数
仪器光源在不同波长区域发射强度是不同的，势必影响荧
光强度的测量。

仪器光栅分光对不同波长光的损失、狭缝宽度、检
测器灵敏度等仪器系数，在不同波长处的影响不一样, 影响荧光强度的测量。

强辐射光源照射样品，引起荧光物质的光分解，影
响荧光强度测量。

二、引起荧光淬灭的因素
广义讲，任何使荧光物质的荧光发射强度降低的现象，都称为荧光淬灭。

1.碰撞淬灭
激发态分子发生非弹性碰撞，使激发态分子以非发
光形式弛豫，均引起荧光淬灭。

2.形成新的化合物
温度、溶剂效应、pH值、金属离子对荧光物质分子
的存在状态产生影响，使荧光淬灭。

3.转入三线态
常温下，一般分子转入三线态的几率很小，含碘、
漠以及硝基化合物、重氮化合物、竣基化合物、一些杂环化合物较容易转入三线态，然后通过非弹性碰撞弛豫, 释放能量，引起荧光淬灭。

4.发生电子转移
I > B L、CN-等淬灭剂与荧光物质分子碰撞时，易给出电子而使其还原，这样改变了荧光物质的分子结构、构象、取代
基性质，从而引起荧光淬灭。

5.荧光物质自淬灭
自淬灭主要是溶液浓度过大，溶质分子自身碰撞而聚合，改变荧光分子的构象、构型，引起荧光淬灭。

此外，利用一些淬灭剂的荧光淬灭现象，可以进行淬灭剂的间接测定。

例如，样分子可以使硼酸根•三苯乙醇酮络合物的荧光淬灭，利用淬灭作用测量痕量氧。

三、内滤光与自吸收
内滤光是指溶液中存在能吸收激发光或荧光的物质, 使荧
光物质发射的荧光在溶液中被吸收，导致荧光发射减弱。

例如，色氨酸测定时，溶液中混入少量重钻酸钾,
色氨酸的荧光峰位287nm、348nm,重銘酸钾吸收峰位287nm> 370nm o如果以287nm作为荧光测定波长，将出现内滤光现象。

一些吸收光谱与荧光光谱重叠的物质，浓度较高时,
容易出现自吸收现象。

蔥是典型的自吸收物质。

光散射影响在荧光分析中，激发光在溶液中的散射在荧
光光谱
中出现，干扰荧光光谱的测定、消弱荧光强度，影响荧光分析灵敏度。

1.容器表面散射
样品池表面的划痕对激发光散射，这种散射光波长与激发光波
长相同。

扫描荧光光谱时，散射峰出现在于激发光波长相同的位置。

2.丁铎尔散射
丁铎尔散射主要是溶液中胶体粒或气泡，使激发光改变传播方向，进入检测器产生信号，该散射光波长与激发光波长相同。

3.瑞利散射
瑞利散射又称为分子散射。

瑞利散射可能是溶液中溶质分子、溶剂分子与光子的弹性碰撞，改变了入射光的传播方向。

也可
能是非待测物质分子振、转能级跃迁吸收能量（无电子能级跃迁），释放与吸收波长相同的光。

瑞利散射强度与波长的4次方成反比o
4.拉曼散射
拉曼散射是与瑞利散射类似的又一种分子散射，它
跃迁回稍高或稍低于原来的振动能级时，发射比激发光波长较长（红伴线）或较短（兰伴线）的光。

拉曼峰波数与激发光波数之差为一恒定值（频率差），这一波数（频率差）称为拉曼位移。

不同溶剂的拉曼位移不同，相同溶剂，激发波长不同，拉曼峰位不同。

水拉曼位移0.338|n-i,当激发波长为248nm 时，拉曼峰位=248/（l-0.338*248/1000）=270.7nm o
拉曼散射峰可通过计算初步判定，改变激发光波长, 拉曼峰随之移动，荧光峰不动。

五、溶剂影响
荧光物质在不同溶剂中，其电离程度、分子存在形式、氢键结合程度、分子缔合形式及缔合程度不同，使荧光物质的荧光效率、内滤光效应、荧光淬灭程度不同。

例如，苯胺蔡磺酸类化合物，在水溶液中基本无荧光，在醇类溶液中呈现蓝色荧光。

而且，随醇溶剂的极性减小，荧光增强，峰位蓝移。

六、pH影响
溶液pH主要影响荧光物质分子的电离程度、络合、螯合形式，从而影响荧光分子结构和离子效率。

七、温度影响
溶液温度升高，分子内部能量变化，分子碰撞加剧, 无辐射跃迁几率增加。

一般情况下，大多数荧光物质，温度升高
1 °C,荧光强度降低1〜2%。

一些生物样品，温度升高
八、其他干扰
除以上主要干扰外，试剂杂质可能引起荧光污染。

样品池、橡胶塞、润滑油、滤纸以及样品中微生物滋生均可能引起应荧光污染，样品处理过程中交叉污染也应防止。

第_早
第一节第二节
荧光分光光度计
仪器结构
荧光分光光度计主要部件
第一节仪器结构
荧光分析仪器种类较多，有目测荧光计、光电荧光计、荧光分光光度计等。

荧光分光光度计光路结构如下
一、光源
二、单色器
三、样品池
检测器
五、数据记录与处理装置
一、光源
荧光分光光度计要求光源发射强度大，稳定、光谱
灯、氤灯。

汞灯辐射强度大、稳定，供电电源简单。

但是，光
谱不是连续光谱。

氤灯在紫外和可见光区能给出较好的连续光谱，辐
射强度大，在300〜400nm辐射强度平稳，在300nm以下辐射强度减小。

供电要求严格，点灯要求瞬时高压，能产生臭氧。

目前，有脉冲供电光源。

二单色器
单色器包括激发单色器和发射单色器，单色器的主
要部件为光栅，主要釆用闪耀光栅，集光效率高，70〜90%能量集中在一级光谱中。

棱镜、滤光片仅用于低档仪器。

三、样品池
样品池采用无荧光、方形石英比色皿。

特殊需要的检测，可采用30 °、45°角形比色皿。

检测器检测器主要采用光电倍增管，检测器工作负高压可调，以提高检测灵敏度。

五、数据记录与处理装置
目前，荧光分光光度计主要釆用计算机釆集、记录、处理数据和控制仪器，具有光谱扫描、荧光强度测定、同步荧光测定、时间扫描、化学反应动力学测定以及磷光、化学发光测定等功能。

第三章定性与定量分析
第一节定性分析
第二节定量分析
第三节测定条件选择
荧光分析定性依据为荧光光谱、激发光谱、量子产率
等荧光参数，较紫外吸收光谱准确性更高。

在生化研究方面具有更大优势。

荧光分析的最大优势是灵敏度高、选择性强，常用定量方法包括标准曲线法、标准加入法、差示分光法、多波长法、导数光谱法等。

第三节测定条件选择
荧光分析测量条件选择主要有光谱扫描波长范围、
狭缝宽度、波长扫描速度、响应时间选择以及散射、荧光淬灭等干扰判定。