测定核酸含量的方法(12页)
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优缺点：简单，快速，灵敏度高，不过受蛋白质和核苷酸影响
注意事项
◆ 1)清洗试验用容器不要用含磷清洗剂 2)消化过程注意预防爆沸和溅出内容物
定糖法
核酸中戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化 合物可与一些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测 定其溶液中吸收值，在一定浓度范围内，溶液吸收值与核酸含量成正 比。 ◆ 1、核糖测定
紫外吸收法
组成核酸分子碱基，均含有一定吸收紫外线特征，最大吸收值在波长 为250~270nm之间。核酸最大吸收波长是260nm, 这个物理特征 为测定核酸溶液浓度提供了基础。 ◆ 在波长260nm紫外线下，10D值光密度相当于双链DNA浓度为50μ g/ml; 单链DNA或RNA为20μg/ml。 能够次来计算核酸样品浓度。 ◆ 优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml 核酸溶液
测定核酸含合成生物大分子化合物，为生命最基础物质之一。 ◆ 核酸广泛存在于全部动植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白
质结合形成核蛋白。 不一样核酸，其化学组成、核苷酸排列次序等不一样。依据化学组成 不一样，核酸可分为核糖核酸(简称RNA) 和脱氧核糖核酸(简称
DNA)。
生成绿色化合物在λ=670nm处有最大吸收值。 2、 脱氧核糖测定
DNA中脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成w- 羟基-y-酮戊酸 ,该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收
值。
优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖都有此反应。
注意事项
其她糖及糖衍生物、芳香醛、蛋白质等都对试验有干扰，测定前应尽可 能可能除去。
小节
◆ 依据不一样情况以及试验条件选择适宜检测方法。 ◆ 不管何种方法，均需确保待测样品核酸 (DNA或RNA) 纯度。 ◆ 依据需要设定一定平行以及对照。
再见
謝謝
荧光光度法
◆ 即琼脂糖凝胶电泳法。 ◆ 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光
结合物，使发射荧光增强几十倍，而荧光强度正比于DNA含量，将已 知浓度标准样品作为电泳对照，就能够估量出待测样品浓度。用量只 需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1gDNA。 该方法只是估量水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子长度。
为可要测核酸含量
◆ 有利于接下来核酸相关试验中所用酶和其她试剂含量确定 ◆ 为了排除核酸在试验中干扰
核酸含量测定多个方法
定磷法 ◆ 定糖法 ◆ 紫外吸收法
荧光光度法
定磷法
◆ 在酸性环境中，定磷试剂中钼酸铵以钼酸形式与样品中磷酸反应生成 磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立刻转变蓝色还原产物——钼蓝 钼蓝最大光吸收在650—660nm波优点。当使用抗坏血酸为还原剂 时，测定最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先 将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品 中测得无机磷量，即得核酸含磷量，由此能够计算出核酸含量。
注意事项
◆ 1)清洗试验用容器不要用含磷清洗剂 2)消化过程注意预防爆沸和溅出内容物
定糖法
核酸中戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化 合物可与一些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测 定其溶液中吸收值，在一定浓度范围内，溶液吸收值与核酸含量成正 比。 ◆ 1、核糖测定
紫外吸收法
组成核酸分子碱基，均含有一定吸收紫外线特征，最大吸收值在波长 为250~270nm之间。核酸最大吸收波长是260nm, 这个物理特征 为测定核酸溶液浓度提供了基础。 ◆ 在波长260nm紫外线下，10D值光密度相当于双链DNA浓度为50μ g/ml; 单链DNA或RNA为20μg/ml。 能够次来计算核酸样品浓度。 ◆ 优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml 核酸溶液
测定核酸含合成生物大分子化合物，为生命最基础物质之一。 ◆ 核酸广泛存在于全部动植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白
质结合形成核蛋白。 不一样核酸，其化学组成、核苷酸排列次序等不一样。依据化学组成 不一样，核酸可分为核糖核酸(简称RNA) 和脱氧核糖核酸(简称
DNA)。
生成绿色化合物在λ=670nm处有最大吸收值。 2、 脱氧核糖测定
DNA中脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成w- 羟基-y-酮戊酸 ,该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收
值。
优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖都有此反应。
注意事项
其她糖及糖衍生物、芳香醛、蛋白质等都对试验有干扰，测定前应尽可 能可能除去。
小节
◆ 依据不一样情况以及试验条件选择适宜检测方法。 ◆ 不管何种方法，均需确保待测样品核酸 (DNA或RNA) 纯度。 ◆ 依据需要设定一定平行以及对照。
再见
謝謝
荧光光度法
◆ 即琼脂糖凝胶电泳法。 ◆ 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光
结合物，使发射荧光增强几十倍，而荧光强度正比于DNA含量，将已 知浓度标准样品作为电泳对照，就能够估量出待测样品浓度。用量只 需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1gDNA。 该方法只是估量水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子长度。
为可要测核酸含量
◆ 有利于接下来核酸相关试验中所用酶和其她试剂含量确定 ◆ 为了排除核酸在试验中干扰
核酸含量测定多个方法
定磷法 ◆ 定糖法 ◆ 紫外吸收法
荧光光度法
定磷法
◆ 在酸性环境中，定磷试剂中钼酸铵以钼酸形式与样品中磷酸反应生成 磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立刻转变蓝色还原产物——钼蓝 钼蓝最大光吸收在650—660nm波优点。当使用抗坏血酸为还原剂 时，测定最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先 将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品 中测得无机磷量，即得核酸含磷量，由此能够计算出核酸含量。