氨基酸酯水解酶突变体催化合成头孢丙烯

Enzymatic synthesis of cefprozil by mutant of α-amino acid ester hydrolase
Pan Yue, Li Duan-hua, Wang Jia-min, Wang Lu and Wang Xin-rong
(Chengdu University Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu 610052)
Abstract Objective Obtain the relevant experimental data through experiment of process conditions of synthesis of cefprozil by α-amino acid ester hydrolase mutants, to lay the foundation for the implementation of the green production technology of cefprozil. Methods Molecular transformation of the wild-type amino acid ester hydrolase through directed evolution, and synthesize cefprozil by the mutant. Investigated the influence to the synthesis of cefprozil by several factors including pH, temperature, enzyme concentration, nucleus/side chain feed ratio and adding an organic solvent. Results Obtain a mutant of AEH through molecular modifying and High Throughput Screening of the wild-type enzyme. The mutant enzyme is more suitable for the synthesis of cefprozil than the wild-type according to the analysis of kinetic data. We also found that during the synthesis of cefprozil by mutant enzyme, the most suitable pH for the system is 6.0, the most suitable temperature is 30℃, the concentration of substrate is 50mmol/L, the most suitable nucleus/side chain feed ratio is 1:2, and the most suitable organic system is 15% of isopropanol. Conclusion The mutant α-amino acid ester hydrolase is more suitable for the synthesis of cefprozil than wild-type enzyme. The experimental data lay the foundation for the practical application of the cefprozil enzymatic synthesis. Key words α-amino acid ester hydrolase; Cefpriozil; Mutant; Synthesis
NH2
性肺炎和无乳链球菌、对甲氧西林敏感的金葡菌作 用强，对流感嗜血菌等也有抑制作用。临床用于治 疗敏感菌所引起的轻度到中度皮肤感染和呼吸道感 染。头孢丙烯安全性好，不良反应极低，已收载在 美国药典中，为美国临床医生推荐的品种之一。目 前头孢丙烯的生产主要是化学合成法[2-3]。一些国际 大制药公司已经开展酶法合成的技术研究 。四川抗
收稿日期：2013-09-10 基金项目：四川省国际科技合作项目(No 2011HH0013，No2010HH0036)；四川省青年基金项目(2013JQ0050)。 作者简介：潘月，男，生于1988年，在读硕士研究生，主要从事酶工程方面研究。E-mail: 523739068@
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通讯作者，李端华，E-mail: duanhualee@；王辂，联邦工业微生物遗传育种研 究所联合开发的α-氨基酸酯水解酶(AEH)具有合成头 孢菌素类抗生素的活性 ，如图1。本文报道了课题组
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对于α-氨基酸酯水解酶合成头孢丙烯的研究结果。 1 仪器和试剂 1.1 仪器 DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器 ( 郑州汇成
科工贸有限公司 ) ，富华 CHZ-82 恒温振荡器 ( 金华市 富华仪器有限公司)，DH-2110低温恒温槽(上海精科 实业有限公司)，LC-2010A HT液相色谱仪(岛津)， Anke TGL-16C 离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 ) ， G ＆ G JJ300Y电子天平(美国双杰兄弟(集团)有限公司常 熟双杰测试仪器厂)，Mettler Toledo SG8 pH计[梅特 勒-托利多仪器(上海)有限公司]，ELX800 UV酶标仪 (Biotech)，J-26高速冷冻离心机(贝克曼)，梯度PCR 仪(eppendorf)。 1.2 菌株 原始菌株：红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)CPCC 140817，由中国医药集团四川抗 菌素工业研究所保藏。 E. coli BL21(DE3) 感受态细 胞，购自北京天根生化公司。 1.3 试剂
产技术打下基础。方法
温度、酶浓度、母核/侧链投料比及有机溶剂等多个因素对酶法合成头孢丙烯的影响。结果
选出一株突变体。动力学数据分析表明，突变体酶比野生型更适合用于头孢丙烯的合成。在突变体酶催化合成头孢丙烯的过程 中，体系最适合的pH为6.0；最适温度为30℃；底物浓度为50mmol/L；最适的母核侧链比为1:2；最适的反应体系为15%异丙醇水溶液。结论 相对于野生型的α-氨基酸酯水解酶，该突变体更适合用于头孢丙烯的合成，实验数据为头孢丙烯酶法合成的实 际应用打下基础。 关键词： α-氨基酸酯水解酶；头孢丙烯；突变体；合成 中图分类号：TQ465，R978.1 DOI:10.13461/ki.cja.005326 文献标志码： A
中国抗生素杂志2014年4月第39卷第4期
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量质粒提取试剂盒提取质粒，由上海Invitrogen公司 测序。 2.3 HPLC检测方法 在测定AEH酶动力性参数和催化反应时采 用HPLC法，色谱条件：LC-2010AHT高效液相 色谱仪， XB-C 18 色谱柱 (4.6mm×200mm ， 5 μ m) ， D-HPG 、 D-HPGM·HCl 和头孢丙烯的检测波长为 225nm ， 7-APRA 检测波长为 254nm ，柱温 35 ℃， 流动相为0.3%，pH2.1的磷酸铵缓冲液(89%)和乙腈 (11%)，流速1mL/min。 2.4 动力学参数测定方法 用pH6.0左右，50~100mmol/L的H3PO4-NH3·H2O 缓冲体系配置不同浓度的底物，30℃反应，每隔一段 时间取样检测，计算反应速度，确定其一级反应时 间。再配制一系列浓度梯度的底物，加入一定量酶进 行反应，测定其在各浓度下的初始速率。根据米氏方 程计算Km和V 等参数，并根据酶浓度计算k
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α-氨基酸酯水解酶突变体催化合成头孢丙烯 潘月等
头孢丙烯是具有广谱抗菌作用第二代头孢菌 素，其杀菌机制是阻碍细菌细胞壁的合成 。对化脓
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用于克隆的聚合酶为上海生工生物工程公司 Pfu 聚合酶，定点突变采用 TOYOBO 的 KOD plus 定 点突变试剂盒，内切酶DpnⅠ及T4 DNA连接酶购自 Fermentas 公司，质粒小量提取采用 Bio-Tek 公司的 OMEGA试剂盒。 母核7-氨基-3-(Z-丙-1-烯基)-4-头孢烷酸 (7-APRA)和头孢丙烯购自浙江华方药业有限 责任公司，侧链D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐 (D-HPGM·HCl)和副产物D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG) 购自上海邦成化工有限公司，其余有机溶剂、无机 盐、酸碱均为市售分析纯，购自成都市科龙化工试 剂厂和国药集团化学试剂有限公司。 2 实验方法 2.1 α-氨基酸酯水解酶的定向进化 采用PCR的方法从红纹黄单胞菌(X. rubrillineans) CPCC 140817的全基因组中分离到AEH基因。PCR产 物克隆到pGEM-T载体中，测序验证后，将pGEM-Taeh和pET28 载体经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后回收，相 连并转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3)。利用SwissModel 软件预测 AEH 的三维结构，用 PyMOL 对其三 维结构进行进一步分析，确定突变后最有可能影响 其底物亲和性的一些位点。以重组质粒 pET28-aeh为 模板，采用KOD plus突变试剂盒对选择出的氨基酸 位点进行定点饱和突变[6]。根据头孢类化合物在碱性 环境中发生分子内亲核攻击，生成哌嗪衍生物[7]，其 最大吸收峰比 β - 内酰胺环的吸收峰大这一原理，用 96孔板对突变的单克隆进行高通量筛选[8]，获得对底 物催化效率较高的突变株。 2.2 阳性突变体突变氨基酸确定 筛选出的阳性突变体用含有30mg/L卡那霉素的 LB培养基在37℃下培养16h，用OMEGA(Bio-Tek)小
NH2 COOCH3 + HO HO E HO O
O H2N O H2O NH2 COOH + E HO O O COOH HO NH2 N COOH S
E
H N N
S +
HO E
HO
图1 α-氨基酸酯水解酶催化合成头孢丙烯的反应机理 Fig.1 The reaction mechanism of enzymatic synthesis of cefprozil by α-amino acid ester hydrolase
ini s [9] cat
2.6.4
加酶量对头孢丙烯合成的影响
向50mL锥形瓶中加入50mmol/L(0.24g)7-APRA 和100mmol/L(0.435g)D-HPGM·HCl，然后用20mL磷 酸盐缓冲液溶解，调节pH至6.0左右，分别加入一系 列酶量的突变 AEH 酶，在 30 ℃水浴摇床中反应。过 程中滴加 25% 氨水或 20% 磷酸控制 pH 。定时取样， HPLC检测。 2.6.5 有机溶剂对头孢丙烯合成的影响 向50mL锥形瓶中加入50mmol/L(0.24g)7-APRA 和100mmol/L(0.435g)D-HPGM·HCl，然后用20mL不 同种类和浓度的有机溶剂溶解，调节 pH 至 6.0 ，再 加入300U突变AEH酶，在30℃水浴摇床中反应。过 程中滴加 25% 氨水或 20% 磷酸控制 pH 。定时取样， HPLC检测。 3 3.1 结果 HPLC检测方法建立 各组分峰形良好，分离度均在 1.5 以上，如图 2 。标准曲线分别为： 7-APRA ： y =2889522.7323 x + 22825.1895 ， R 2 =0.9998(254nm) ；头孢丙烯： y = 7049073.1018 x -5985.9182 ， R 2 =0.9999(225nm) ； D-HPGM·HCl ： y =4865906.0371 x +110337.4205 ， R 2 =0.9997(225nm) ； D-HPG ： y =5141768.1539 x + 74412.6179，R2=0.9999。重复进样6次，各组分RSD 均在1%以下。 3.2 α-氨基酸酯水解酶的定向进化 对野生型 α - 氨基酸酯水解酶进行分子改造，共 做了8个位点的定点突变，其中筛出一株催化活性较 高的菌株。测序结果显示为131位由缬氨酸变成丝氨 酸(V131S)。 对突变体和野生型 α - 氨基酸酯水解酶进行了部 分动力学参数测定，结果如表1所示。 V131S 对侧链的 K m值有所降低，转化数 k cat和催 化效率都有较大提高。合成头孢丙烯时，初始速率
仪器和试剂11仪器df101s集热式恒温加热磁力搅拌器郑州汇成科工贸有限公司富华chz82恒温振荡器金华富华仪器有限公司dh2110低温恒温槽上海精科实业有限公司lc2010aht液相色谱仪岛津anketgl16c离心机上海安亭科学仪器厂gjj300y电子天平美国双杰兄弟集团有限公司常熟双杰测试仪器厂mettlertoledosg8ph计梅特勒托利多仪器上海有限公司elx800uv酶标仪biotechj26高速冷冻离心机贝克曼梯度pcr仪eppendorf
中国抗生素杂志2014年4月第39卷第4期
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文章编号：1001-8689(2014)04-0261-06
α-氨基酸酯水解酶突变体催化合成头孢丙烯
潘月 李端华* 王佳珉 王辂* 王欣荣
(成都大学四川抗菌素工业研究所，成都 610052) 摘要：目的 通过α-氨基酸酯水解酶突变体合成头孢丙烯的工艺条件实验，获得相关实验数据，为推行头孢丙烯的绿色生 通过定向进化对野生型α-氨基酸酯水解酶进行改造，用突变体酶催化合成头孢丙烯，考察了包括pH、 对野生型AEH酶进行分子改造，筛