流式细胞术原理及应用
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• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
THANK YOU
2019/4/27
D、 单标对照 Single Staining Control •什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 •为什么要进行补偿调节？
FITC PE
laser
PC5
400
500
600
700
665
520 575
补偿调节方法：
FL-2(PE)
FL-2(-)
FL-1(FITC)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
FL2 - %FL1
FITC 单标
FL-1(-)
FL1 - %FL2
PE 单标
FL-2(PE)
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-2(PE)
什么样的补偿最合适？
• 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时 为最合适的补偿。
流式结果
线性门
十字门
流式细胞仪检测范围
细胞功能
核内抗原
•细胞表面、胞浆、核的特异 性抗原
•细胞活性
•细胞内细胞因子
•酶活性 •细胞受体
黏附因子
•细胞内钙离子
表面受体
分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
医学应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
研究； • 不同类型的神经细胞的鉴定和功
能研究； • 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定
和功能研究； • 检测细胞活性，细胞凋亡和细胞
周期； • 神经细胞发育过程研究 • 干细胞向神经细胞分化研究 • 。。。
在肿瘤研究中的应用： •细胞凋亡的检测； •细胞周期分析； •细胞增殖研究； •荧光蛋白分析； •肿瘤干细胞的鉴定和功能分析； •循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析； •实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解 离成单细胞后）； •肿瘤细胞系表型分析； •细胞活性的检测； •。。。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值 。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光信号 •细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W
CD4
• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
SSC SSC Foxp3 PE
FSC
CD4 FITC
3）流式试验对照设置 • A、空白对照 Negative Control
细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染 色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。
设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特 异性荧光，避免假阳性的结果。
001
001
002
• 流式结果中荧光强弱是一个相对值，光 电倍增管电压越大，电子信号越强；电 压越小，信号越弱。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白 含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
C、阳性对照 Positive Control
• 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都 必须设置： 使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。
• 设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。
SUCCESS
• DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含 量的多少与荧光染料的结合量成正比 ，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子 的多少。通过流式检测就能反映细胞 内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1 期、S期和G2/M期细胞比例。
• 细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不 能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细 胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的 DNA，但需紫外激光激发。
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
Uncompensated
PE-Medianneg < PE-Medianpos
Compensated
PE-Medianneg= PE-Medianpos
Overcompensated
PE-Medianneg > PE-Medianpos
FL2-no stain
FL1-FITC stain
FL1-FITC stain
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
流式细胞仪构造图
流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
海洋生物学 •富集和分析细菌，藻类，浮游植物 等
微生物学 •细菌和酵母检测； •荧光蛋白检测。
生物燃料 •Bodipy®和/或 Nile Red中脂类的定 量 •藻类，蓝藻细菌，酵母和细菌等生 物的富集
四、常见流式细胞术应用
4.1 细胞周期检测
• 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不 同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA ，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA， 而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍 体量之间。
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
• 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强 度处于阴性的位置，实验组的荧光值都 是相对对照组。
B、同型对照 Isotype Control
•同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的 免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） •与染色的单克隆抗体： ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 •用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产 生的背景染色
在细胞生物学和分子生物学研究中 的应用： •检测细胞转染效率； •检测转导效率； •分析细胞中荧光蛋白的表达； •分析蛋白—蛋白之间的相互作用 （FRET） •分析细胞活性，细胞凋亡，和细胞 周期； •研究细胞的分化过程； •研究细胞增殖； •。。。
在高通量检测和新药研发中的应用： •细胞功能变化的研究； •细胞周期和活性； •细胞凋亡； •细胞增殖； •新药研发； •培养基研发； •。。。
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
• 尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； • 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；
D、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性
CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5
样本曝光时间
0 hour
PE 2 hours
22.5 hours
FL1-FITC stain
准确补偿的重要性
补偿调节要合适
未补偿
正确补偿
FITC-PE补偿太大
PE-FITC补偿太大
举例：双染实验
• 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同 型对照抗体分别染色 • n色分析就要制备n 个补偿对照管
设门与数据分析
• 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过 程实际上就是选门和设门的过程。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
THANK YOU
2019/4/27
D、 单标对照 Single Staining Control •什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 •为什么要进行补偿调节？
FITC PE
laser
PC5
400
500
600
700
665
520 575
补偿调节方法：
FL-2(PE)
FL-2(-)
FL-1(FITC)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
FL2 - %FL1
FITC 单标
FL-1(-)
FL1 - %FL2
PE 单标
FL-2(PE)
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-2(PE)
什么样的补偿最合适？
• 单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时 为最合适的补偿。
流式结果
线性门
十字门
流式细胞仪检测范围
细胞功能
核内抗原
•细胞表面、胞浆、核的特异 性抗原
•细胞活性
•细胞内细胞因子
•酶活性 •细胞受体
黏附因子
•细胞内钙离子
表面受体
分泌到胞外的 细胞因子
细胞因子 核酸含量
胞内抗原
医学应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
研究； • 不同类型的神经细胞的鉴定和功
能研究； • 星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定
和功能研究； • 检测细胞活性，细胞凋亡和细胞
周期； • 神经细胞发育过程研究 • 干细胞向神经细胞分化研究 • 。。。
在肿瘤研究中的应用： •细胞凋亡的检测； •细胞周期分析； •细胞增殖研究； •荧光蛋白分析； •肿瘤干细胞的鉴定和功能分析； •循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析； •实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解 离成单细胞后）； •肿瘤细胞系表型分析； •细胞活性的检测； •。。。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值 。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光信号 •细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W
CD4
• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
SSC SSC Foxp3 PE
FSC
CD4 FITC
3）流式试验对照设置 • A、空白对照 Negative Control
细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染 色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。
设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特 异性荧光，避免假阳性的结果。
001
001
002
• 流式结果中荧光强弱是一个相对值，光 电倍增管电压越大，电子信号越强；电 压越小，信号越弱。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白 含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
C、阳性对照 Positive Control
• 设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都 必须设置： 使用新的荧光素抗体时； 使用存储时间较长的荧光素抗体时。
• 设置阳性对照的方法： 用肯定表达有该抗原的细胞来检测； 已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。
SUCCESS
• DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含 量的多少与荧光染料的结合量成正比 ，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子 的多少。通过流式检测就能反映细胞 内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1 期、S期和G2/M期细胞比例。
• 细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不 能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细 胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的 DNA，但需紫外激光激发。
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
Uncompensated
PE-Medianneg < PE-Medianpos
Compensated
PE-Medianneg= PE-Medianpos
Overcompensated
PE-Medianneg > PE-Medianpos
FL2-no stain
FL1-FITC stain
FL1-FITC stain
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
流式细胞仪构造图
流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
海洋生物学 •富集和分析细菌，藻类，浮游植物 等
微生物学 •细菌和酵母检测； •荧光蛋白检测。
生物燃料 •Bodipy®和/或 Nile Red中脂类的定 量 •藻类，蓝藻细菌，酵母和细菌等生 物的富集
四、常见流式细胞术应用
4.1 细胞周期检测
• 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不 同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA ，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA， 而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍 体量之间。
科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
• 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强 度处于阴性的位置，实验组的荧光值都 是相对对照组。
B、同型对照 Isotype Control
•同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的 免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） •与染色的单克隆抗体： ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 •用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产 生的背景染色
在细胞生物学和分子生物学研究中 的应用： •检测细胞转染效率； •检测转导效率； •分析细胞中荧光蛋白的表达； •分析蛋白—蛋白之间的相互作用 （FRET） •分析细胞活性，细胞凋亡，和细胞 周期； •研究细胞的分化过程； •研究细胞增殖； •。。。
在高通量检测和新药研发中的应用： •细胞功能变化的研究； •细胞周期和活性； •细胞凋亡； •细胞增殖； •新药研发； •培养基研发； •。。。
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
• 尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； • 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；
D、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性
CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5
样本曝光时间
0 hour
PE 2 hours
22.5 hours
FL1-FITC stain
准确补偿的重要性
补偿调节要合适
未补偿
正确补偿
FITC-PE补偿太大
PE-FITC补偿太大
举例：双染实验
• 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同 型对照抗体分别染色 • n色分析就要制备n 个补偿对照管
设门与数据分析
• 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过 程实际上就是选门和设门的过程。